ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: TS Phạm Thị Lƣơng Hằng PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội – Năm 2016 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung LỜI CẢM ƠN Lời đầ u tiên , xin gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắ c nhấ t tới TS Phạm Thị Lƣơng Hằng PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, ngƣời đã trƣ̣c tiế p hƣớng dẫn , tạo mo ̣i điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i , giúp đỡ suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn Các cô không ngƣời truyền đạt cho kiến thức mà hỗ trợ nhiều vật chất Tôi thấy mình thật may mắn đƣợc học trò các cô Tôi xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành nhấ t tới ThS Bùi Thị Vân Khánh, ThS Nguyễn Đắ c Tú , nhƣ̃ng ngƣời chi ̣ , ngƣời anh tâ ̣n tình hƣớng dẫn nhƣ̃ng ki ̃ thuâ ̣t đầ u tiên bƣớc chân vào phòng thí nghiê ̣m Anh, chị không truyền đạt cho nhƣ̃ng kinh nghiê ̣m công viê ̣c mà cả nhƣ̃ng kinh nghiê ̣m quý báu cuô ̣c số ng, đó sẽ là nhƣ̃ng hành trang mà sẽ mang theo sau này Xin gửi lời cảm ơn đến CN Nguyễn Thị Thu Hà, CN Hà Hữu Cƣờng, CN Nguyễn Thị Loan, CN Vũ Anh Công nhiệt tình giúp đỡ quá trình làm thí nghiệm Xin gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắ c nhấ t tới các thầ y cô và cán bô ̣ Khoa Sinh học, đă ̣c biê ̣t là các thầ y cô Bô ̣ môn Sinh ho ̣c tế bào Bộ môn Sinh lí Thực vật Hóa sinh đã giúp đỡ , tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành lu ận văn Và, xin chân thành cảm ơn các anh chi ̣ , các bạn các em Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Tế bào ngƣời động vật nhƣ Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Mô thực vật Vi tảo đã đồ ng hành , quan tâm và giúp đỡ thời gian tham gia nghiên cƣ́u ta ̣i Sƣ̣ quan tâm , chia sẻ các bạn các em động lực lớn lao với lúc mệt mỏi khó khăn Tôi sẽ không quên thời gian làm việc đầ y ắ p tiế ng cƣời cùng các ba ̣n hai gia điǹ h lớn trƣờng Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội i Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ kinh phí cho nghiên cứu đề tài mang mã số 106.16-2012.24 Cuố i cùng, xin gƣ̉i lòng biế t ơn sâu sắ c và lớn lao nhấ t đế n gia đình , nhƣ̃ng ngƣời đã hy sinh cả vâ ̣t chấ t và tinh thầ n , yêu thƣơng , ủng hộ, đô ̣ng viên và tôn tro ̣ng mo ̣i quyế t đinh ̣ của Mỗi nghi ̃ về gia đin ̀ h nhƣ đƣơ ̣c tiế p thêm sƣ́c ma ̣nh để vƣ̃ng tin hoàn thành tố t luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Bùi Thị Thuỳ Dung ii Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tƣ̀ viế t tắ t Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ED50 Median effective dose Liều có hiệu 50% số động vật thí nghiệm EtOAc Ethyl acetate Dung môi ethyl acetate HCT116 Human colon carcinoma cell HepG2 Hepatocellular carcinoma G2 Dòng tế bào ung thƣ gan IC50 Half maximal inhibitory concetration Nồng độ ức chế 50% số tế bào LC/MS Liquid chromatography–mass spectrometry Dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng Sắc kí lỏng - khối phổ LD50 Median lethal dose 50% Liều gây chết trung bình MCF7 Breast adenocarcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ vú MeOH Methanol Dung môi methanol Minimal inhibitory MIC concentration Nồng độ ức chế tối thiểu n-Hex n-Hexan Dung môi n-Hexan OD Optical Density Mật độ quang học SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B TLC Thin-layer chromatography Sắc kí mỏng MỤC LỤC iii Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung MỞ ĐẦU Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lam 1.1.1.Đặc điểm hình thái sinh lí vi khuẩn lam 1.1.2.Phân loại vi khuẩn lam 1.2 Tiềm phát triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam 1.3 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam 1.4 Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam 13 Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu 15 2.1.1 Các chủng vi khuẩn lam 15 2.1.2 Dòng tế bào 16 2.2 Các nội dung nghiên cứu 17 2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào 17 2.3.2 Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 19 2.3.3 Phƣơng pháp sắc kí cột silica gel 20 2.3.5 Phƣơng pháp LC/MS 21 Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ 22 3.1.1.Kết hoạt hóa tế bào 22 3.1.2.Xác định số IC50 các dịch chiết từ vi khuẩn lam 22 3.2 Phân lập các chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 29 3.2.1.Sự phân tách cột sắc ký silica gel 29 3.2.2 Sự phân tách cột sắc kí sillica gel lần 32 3.2.3 Sự phân tách cột sắc kí silica gel lần 35 3.3 Xác định khối lƣợng phân tử hoạt chất phƣơng pháp LC/MS 37 iv Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Cryptophycin [36] v Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Borophycin [17] Hình 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng nghiên cứu 16 Hình 3.1 Các dòng tế bào ung thƣ dùng phép thử hoạt tính 22 Hình 3.2 Tế bào MCF7 mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm 23 Hình 3.3 Tế bào MCF7 dƣới tác dụng dịch chiết APD4- EtOAc 24 Hình 3.4 Tế bào HCT116 dƣới tác dụng dịch chiết APD4- EtOAc 24 Hình 3.5 Tế bào HepG2 dƣới tác dụng dịch chiết APD4- EtOAc 24 Hình 3.6 Đƣờng cong đáp ứng liều các dịch chiết có hoạt tính hai dòng tế bào MCF7 HCT116 27 Hình 3.7 Đƣờng cong đáp ứng liều dòng tế bào MCF7 đối với Taxol 28 Hình 3.8 Các phân đoạn rửa giải từ dịch chiết APD4-Met 30 Hình 3.9 Hình dạng tế bào MCF7 đƣợc ủ với phân đoạn DE5 32 Hình 3.10 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn có hoạt tính (DM-E) 33 Hình 3.11 Tế bào MCF7 ủ với phân đoạn DP1 DP5 nồng độ 50µg/ml 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC phân đoạn DP1 DP5 35 Hình 3.13 Tế bào MCF7 dƣới tác dụng phân đoạn DF4 36 Hình 3.14 Sắc kí đồ phân đoạn DF2 bƣớc sóng 256nm 37 Hình 3.15 Sắc kí đồ phân đoạn DF4 bƣớc sóng 256nm 38 Hình 3.16 Phổ khối lƣợng hợp chất P3 xuất phút 23,6 39 Hình 3.17 Kết tra cứu hợp chất có trọng lƣợng phân tử từ 795-796 dalton tháng 10/2016 40 Hình 3.18 Công thức cấu tạo Apratoxin E [26] 41 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chất có khả kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [39] Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng thí nghiệm đánh giá hoạt tính 15 vi Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Bảng 3.1 Giá trị tăng sinh A% các dịch chiết có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào dòng MCF7 25 Bảng 3.2 Giá trị tăng sinh A% các dịch chiết có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào dòng HCT116 26 Bảng 3.3 Giá trị IC50 số dịch chiết có hoạt tính 27 Bảng 3.4 Giá trị IC50 Taxol ba dòng tế bào MCF7, HCT116 HepG2 28 Bảng 3.5 Khối lƣợng các phân đoạn từ dịch chiết chủng APD4 31 Bảng Khối lƣợng khô các phân đoạn thu đƣợc từ cột silica gel lần 34 Bảng 3.7 Khối lƣợng các phân đoạn thu đƣợc từ cột sắc ký silica gel lần 36 Bảng 3.8 Tỷ lệ tƣơng đối hàm lƣợng các chất phân đoạn DF4 38 vii Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung MỞ ĐẦU Sự xuất bệnh ung thƣ mối đe dọa tính mạng ngƣời hàng đầu giới với tỷ lệ mắc phải ngày tăng Theo số liê ̣u báo cáo Viện nghiên cứu quốc tế ung thƣ , năm 2012, toàn giới có 8,2 triệu ngƣời chết vì các loại bệnh ung thƣ khác Các chuyên gia cảnh báo ngƣời không sớm tìm đƣợc biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn tốc độ phát triển nhƣ bệnh thì tới năm 2035, ung thƣ sẽ cƣớp sƣ̣ số ng của nh ất 24 triệu ngƣời [14] Hóa trị xạ trị từ lâu phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến điều trị ung thƣ, nhiên hai phƣơng pháp có nhiều tác dụng phụ, ảnh hƣởng xấu tới sức khỏe ngƣời bệnh, ngƣời bệnh có thể tử vong trƣớc tiêu diệt đƣợc tận gốc các tế bào ung thƣ Bởi vâ ̣y, viê ̣c tim ̀ mô ̣t loa ̣i thuố c đă ̣c hiê ̣u điề u tri ̣ung thƣ an toàn v ới ngƣời bệnh là mô ̣t vấ n đề r ất cấ p bách hiê ̣n Trong công tìm kiếm đó, các hợp chất từ thiên nhiên đƣợc quan tâm nhiều chúng có mặt các thuốc dân gian từ lâu có độ an toàn cao Vi khuẩn lam nguồn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm dƣợc phẩm có ý nghĩa quan trọng Chúng cho thấy khả chống lại các khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm Một số hợp chất đƣợc phân lập tinh sạch từ vi khuẩn lam cho kết bƣớc đầu thành công các thử nghiệm điều trị ung thƣ lâm sàng Các hợp chất đƣợc xem hợp chất tiên phong cho phát triển, tổng hợp các hợp chất dẫn với hoạt tính sinh học tốt Từ các kiến thức nhƣ trên, chúng tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả ức chế tăng trƣởng số dòng tế bào ung thƣ” với mục đích: Đánh giá khả ức chế tăng trưởng dịch chiết từ chủng vi khuẩn lam lên dòng tế bào ung thư phổ biến Việt Nam Tìm hợp chất có khả kháng ung thư từ dịch chiết vi khuẩn lam Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung thì chúng cần phải đƣợc tinh sạch hoàn toàn xác định cấu trúc phân tử phƣơng pháp đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR Quay trở lại với hợp chất P3 phân đoạn DF4 xuất phút thứ 23,6 (đỉnh 3) sắc ký đồ Do tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử 795,2 dalton có gợi ý tên chất apratoxin E, vì chúng tôi, cho có hai trƣờng hợp có thể xảy Trƣờng hợp thứ nhất, hợp chất phân đoạn apratoxin E, tức chúng có trọng lƣợng phân tử nhƣng khác công thức cấu tạo, có thể chúng sẽ có đƣợc hợp chất mới từ chủng vi khuẩn lam APD4 Trƣờng hợp thứ chất cần quan tâm có trọng lƣợng công thức cấu tạo với Apratoxin E (Hình 3.18), chúng có thể kết đến kết luận phân lập thành công hợp chất Apratoxin E từ chủng vi khuẩn lam APD4 thuộc chi Nostoc Khả cao hợp chất Apratoxin E chất có khả ức chế dòng tế bào ung thƣ đƣợc phát từ loài vi khuẩn lam Lyngbya bouillonii (ở xứ Guam) Hình 3.18 Công thức cấu tạo Apratoxin E [26] Cũng nhƣ các thành viên khác gia đình các apratoxin, apratoxin E có khả ức chế nhiều dòng tế bào ung thƣ khác Cụ thể, theo nghiên cứu Susan Matthew cộng sự, chất có khả gây ức chế tăng sinh các dòng tế bào: ung thƣ trực tràng HT29, ung thƣ cổ tử cung HeLa, ung thƣ xƣơng ác tính U2OS với giá trị IC50 lần lƣợt 21; 72 59nM [26] 41 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Nhƣ vậy, sau các thí nghiệm, chúng thu đƣợc chất P3 có khối lƣợng phân tử nằm khoảng 795-796, có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ đƣợc dự đoán apratoxin E Chúng cần tiến hành thêm các thí nghiệm để xác định xác có phải apratoxin E hay không? Nếu đó apratoxin E, nghiên cứu đƣa phát mới chủng vi khuẩn lam sản sinh apratoxin E, đó APD4 thuộc chi Nostoc Việt Nam Còn apratoxin E thì sẽ hợp chất mới, nghiên cứu tìm hợp chất tiềm nghiên cứu điều trị ung thƣ tại Việt Nam Đây kết có ý nghĩa quan trọng công tìm kiếm chất mới có khả điều trị ung thƣ 42 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung KẾT LUẬN Dịch chiết từ bốn số chín chủng vi khuẩn lam nghiên cứu bao gồm APD4, APA4, APA5 TVN12 có khả gây ức chế tăng trƣởng tế bào ung thƣ Cụ thể, dịch chiết từ chủng APD4 APA4 ức chế tăng sinh hai dòng tế bào ung thƣ vú MCF7 dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng HCT116 với giá trị IC50 từ 47,8 - 232,2µg/ml Trong đó, dịch chiết từ chủng APA5 có tác dụng ức chế lên dòng tế bào MCF7, dịch chiết từ chủng TVN12 có tác dụng lên dòng tế bào HCT116 Tất dịch chiết từ chủng vi khuẩn lam thử nghiệm không ức chế sống tế bào ung thƣ gan dòng HepG2 Bằng các phƣơng pháp sắc ký cột thủy tinh, hợp chất P3 có trọng lƣợng phân tử xấp xỉ 795,2 dalton đƣợc phân lập với độ tinh sạch 89% Hợp chất P3 có trọng lƣợng phân tử với apratoxin E - hợp chất có khả ức chế sinh trƣởng tế bào ung thƣ đƣợc phát trƣớc vi khuẩn lam Lyngbya bouillonii xứ Guam 43 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung KIẾN NGHỊ Tiếp tục tinh sạch tích lũy hợp chất P3 có trọng lƣợng phân tử xấp xỉ 795,2 dalton để làm sáng tỏ cấu trúc phƣơng pháp đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Xác định số IC50 hợp chất P3 hai dòng tế bào MCF7 HCT116 Mở rộng nghiên cứu phân lập các chất có khả ức chế ung thƣ từ các chủng vi khuẩn lam APA4, APA5 TVN12 44 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Phan Quốc Kinh, (2011), "Giáo trình các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học" Nhà xuất giáo dục Việt Nam TIẾNG ANH Balunas M.J., Grosso M.F., Villa F.A., Engene N., Mcphail K.L., Tidgewell K., Pineda M.L., Gerwick L., Spadafora C., Kyle D.E., and Gerwick W.H., (2012), "Coibacins A-D, antileishmanial marine cyanobacterial polyketides with intriguing biosynthetic origins", Organic letters, 14(15), pp 3878-81 Burja A.M., B Banaigs, E Abou-Mansour, J Grant Burgess, and P.C Wright, (2001), "Marine cyanobacteria - a prolific source of natural products", Tetrahedron, 57(46), pp 9347-9377 Chen J and Forsyth C.J., (2004), "Total synthesis of the marine cyanobacterial cyclodepsipeptide apratoxin A", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(33), pp 12067-72 Chin Y.-W., Balunas M J., Chai H B., and Kinghorn A.D., (2006), "Drug discovery from natural sources", The AAPS journal, 8(2), pp E239E253 Chun G., Lee Y.B., Kim D.J., Cho W.J, Lee S.K., Chung H.J., and Ahn C.H., (2014), "Characterization of a novel small molecule inhibitor with potent anticancer activity", Cancer research, 70(8), pp 3562 Costa M., Costa-Rodrigues J.,Fernandes M.H., Barros P., Vasconcelos V., and Martins R., (2012), "Marine cyanobacteria compounds with anticancer properties: a review on the implication of apoptosis", Mar Drugs, 10(10): pp 2181-207 De Los Rios A., Grube M., Sancho L.G., and Ascaso C., (2007), "Ultrastructural and genetic characteristics of endolithic cyanobacterial 45 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung biofilms colonizing Antarctic granite rocks", FEMS microbiology ecology, 59(2), pp 386-95 Devi T.I., Koijam L.,Singh O.A.,Tiwari O.N and Sharma G.D., (2010), "Assessment of cyanobacterial biodiversity through molecular approaches and possible exploitation for value addition", Assam University Journal of Science & Technology : Biological and Environmental Sciences, (1), pp 93-101 10 Dittmann E and Wiegand C., (2006), "Cyanobacterial toxins occurrence, biosynthesis and impact on human affairs", Molecular nutrition & food research, 50(1), pp 7-17 11 Dittmann E., Neilan B.A., and Borner T., (2001), "Molecular biology of peptide and polyketide biosynthesis in cyanobacteria", Applied Microbiol Biotechnol, 57(4), pp 467-73 12 Elliott A and Pace D.M., (1963), "Observations on the effects of Methanol and formaldehyde on estabilished cell lines cultivated in vitro”, Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 41(2), pp 299-304 13 Fang W., Liu S., and Nie Y., (2011), "Anticancer activity of chamaejasmine: effect on tubulin protein", Molecules, 16(8), pp 6243-54 14 Ferlay J.,Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M, Parkin D., Forman D., and Bray F., (2015), "Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012", International journal of cancer, 136(5), pp E359-86 15 Gerwick W.H., Proteau P.J., Nagle D.G., Hamel E., Blokhin A., and Slate D.L., (1994), "Structure of Curacin A, a Novel Antimitotic, Antiproliferative and Brine Shrimp Toxic Natural Product from the Marine Cyanobacterium Lyngbya majuscula", The Journal of Organic Chemistry, 59(6), pp 1243-1245 46 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung 16 Gerwick, W.H., Byrum T., Carland T., (2008),“Integratingchemical and biochemical approaches to natural products drug discovery from marine cyanobacteria”, International Conference on Newer Developments in Drug Discovery from Natural Products and Traditional Medicines, pp 33-43 17 Hemscheidt T., Puglisi M.P., Larsen L.K., Patterson G.M., Moore R., Rios J., and Clardy J., (1994), "Structure and biosynthesis of borophycin, a new boeseken complex of boric acid from a marine strain of the blue-green alga Nostoc linckia", The Journal of Organic Chemistry, 59(12), pp 3467-3471 18 Ibañez E., Herrero M., Mendiola J.A., and Castro-Puyana M (2012), “Extraction and Characterization of Bioactive Compounds with Health Benefits from Marine Resources: Macro and Micro Algae, Cyanobacteria, and Invertebrates”, Marine Bioactive Compounds: Characterization and Applications, pp 55-98 19 Ingrid Chorus, Jamie Bartram, (1999), Toxic Cyanobacteria in Water: A Guide to their Public Health Consequences, Monitoring and Management, Chemical Rubber Company Press 20 James J Pitt (2009), “Principles and Applications of Liquid ChromatographyMass Spectrometry in Clinical Biochemistry”, Clin Biochem Reviews, 30(1), pp.19–34 21 Kenneth G Macleod and Simon P Langdon, (2011), “Essential Techniques of Cancer Cell Culture”, Cancer cell culture- Methods and Protocol, 88, pp.17-23 22 Kossel A., (1981), "The chemical composition of the cell", Archiv für Physiologie, 61(10), pp 181-186 47 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung 23 Kwei C.K.,(2012), Elucidation and isolation of specific bioactive compound in cyanobacteria isolates, Thesis (Ph.D): Chemical Engineering, University of Adelaide 24 Mandal S and Rath J., (2015), “Secondary Metabolites of Cyanobacteria and Drug Development”, Extremophilic Cyanobacteria For Novel Drug Development, pp 23-43 25 Martínez-Núñez M.A, (2016), "Nonribosomal peptides synthetases and their applications in industry", Sustainable Chemical Processes, 4(1), pp 13 26 Matthew S., Schupp P., and Luesch H., (2008), "Apratoxin E, a cytotoxic peptolide from a guamanian collection of the marine cyanobacterium Lyngbya bouillonii", Journal of natural products, 71(6), pp 1113-6 27 Moore R.E., Corbett, T H., Patterson, G M L., and Valeriote, F A ,(1996), “The Search for New Antitumor Drugs from Blue-Green Algae”, Current Pharmaceutical Design, 2(3),pp 317-330 28 Neilan B.A., Dittmann E., Rouhiainen L., Bass L.A., Schaub V., Sivonen K., and Börner T., (1999), "Nonribosomal Peptide Synthesis and Toxigenicity of Cyanobacteria", Journal of Bacteriology, 181(13), pp 4089-4097 29 Newman D.J and G.M Cragg, (2007), "Natural Products as Sources of New Drugs over the Last 25 Years", Journal of natural products, 70(3), pp 461-477 30 Pattanaik B and P Lindberg, (2015), "Terpenoids and their biosynthesis in cyanobacteria", Life (Basel, Switzerland), 5(1), p 269-93 31 Patterson G.M.L, (1991), "Atineoplastic activity of cultured blue-green algae (Cyanpphyta)" Journal of Phycology, 27(4), pp 530-536 32 Prinsep M.R., Thomson R.A., West M.L., and Wylie B.L., (1996), "Tolypodiol, an antiinflammatory diterpenoid from the cyanobacterium Tolypothrix nodosa", Journal of natural products, 59(8), pp 786-8 48 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung 33 Sherma J., (2006), Thin-Layer Chromatography, in Encyclopedia of Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Ltd 34 Shimizu Y., (1996), "Microalgal metabolites: a new perspective", Annual review of microbiology, 50, pp 431-65 35 Simmons T.L., Andrianasolo E., Mcphail K., Flatt P., and Gerwick W.H, (2005), "Marine natural products as anticancer drugs", Molecular cancer therapeutics, 4(2), pp 333-42 36 Smith C.D., Zhang X., Mooberry S.L., Patterson G.M., and Moore R.E., (1994), "Cryptophycin: a new antimicrotubule agent active against drug-resistant cells", Cancer research, 54(14), pp 3779-84 37 Subramaniyan Vijayakumar M.M., (2015), "Pharmaceutical applications of cyanobacteriad-A review", 5(1), Journal of Acute Medicine, pp.1-9 38 Vasas G., G Borbely, P Nanasi, and P.P Nanasi, (2010), "Alkaloids from cyanobacteria with diverse powerful bioactivities", Medicinal Chemistry, 10(10), pp 946-55 39 Voigt W., (2005), "Sulforhodamine B assay and chemosensitivity", Molecular Medicine, 110, pp 39-48 40 Wipf P., Reeves J.T and Day B.W., (2004), "Chemistry and biology of curacin A", Current pharmaceutical design, 10(12), pp 1417-37 41 Zakhia F., Jungblut A.J., Taton A.,Vincent W.F., and Wilmotte A., (2008), “Cyanobacteria in Cold Ecosystems”, Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology, pp 121-135 49 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung PHỤ LỤC Phụ lục Hình Phổ khối lƣợng hợp chất P1 xuất phút 20,5 50 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Hình Kết tra cứu hợp chất P1 có trọng lƣợng phân tử từ 360-370 dalton tháng 10/2016 Hình Công thức cấu tạo Phaitanthrin A 51 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Phụ lục Hình Phổ khối lƣợng hợp chất P2 xuất phút 20,9 Hình Kết tra cứu hợp chất P2 có trọng lƣợng phân tử từ 276- 277 dalton tháng 10/2016 52 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Hình Công thức cấu tạo Goniodiol-7 53 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Phụ lục Hóa chất thiết bị dùng nghiên cứu Bảng Hóa chất sử dụng Tên hóa chất Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Gibco Mỹ RPMI 1640 Invitrogen Mỹ FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco Mỹ P-S (Penicillin- Streptomicine) Invitrogen Mỹ DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Gibco Mỹ Trysin Invitrogen Mỹ PBS (Phosphate Buffered Saline) Gibco Mỹ Blue Trypan Gibco Mỹ TCA (Tricloacetic acid) Merck Đức Acid acetic Merck Đức Tris-base Bioland Scientific LLC Mỹ SRB Sigma Mỹ Methanol Merck Đức Ethanol Merck Đức Ethyl acetate Merck Đức n-hexan Merck Đức Sillica gel Merck Đức 54 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Bảng Thiết bị sử dụng thí nghiệm Tên thiết bị Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất Tủ ấm 5% CO2 Shell lap Mỹ Tủ hood Esco Mỹ Bể ổn nhiệt Gra Operation SS40-1Mỹ Máy li tâm Universal 320 Hettich Đức Pipett aid Gilson Pháp Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Đức Kinhd hiển vi soi ngƣợc Axiovert 40 CFL Carl Zeiss Đức Microplate Reader Model 680 Bio- Rad Nhật Bản Máy votex WhirliMixer Anh Pipett man Gilson Pháp Kính hiển vi laze đồng tụ LSM 510 Carl Zeiss Đức Buồng đếm Tế bào Thomas Đức Máy cất quay Stuart Anh Máy lắc Stuart Anh Bảng Dụng cụ vật tƣ tiêu hao thí nghiệm Tên Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất Đĩa nuôi cấy đa giếng: 96 giếng, 24 giếng Corning Mỹ Đĩa, chai nuôi cấy tế bào Corning Mỹ Ống ly tâm 1,5ml, 15ml, 50ml Corning Mỹ Pipet thủy tinh 2ml, 5ml, 10ml Việt Nam Việt Nam Đầu típ Corning Mỹ Ống Cryo Corning Mỹ Lam kính, lamen Sail Brand Trung Quốc Bình tam giác, ống penicillin Schott Duran Đức Bản nhôm tráng Sillica gel- TLC Merck Đức Ống mao quản Assistant Đức Cột chạy sắc kí Schott Duran Đức 55 ... các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả ức chế tăng trƣởng số dòng tế bào ung thƣ” với mục đích: Đánh giá khả ức chế tăng trưởng dịch chiết từ chủng vi khuẩn lam lên dòng tế bào ung thư phổ... NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC... Thùy Dung Bảng 1.1 Một số chất có khả kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [37] STT Tên chất Từ vi khuẩn lam Dòng tế bào tác động Ankaraholide A Geitlerinema sp Các dòng tế bào ung thƣ: