ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS.BS Đinh Văn Hân PGS TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.BS Đinh Văn Hân PGS TS Nguyễn Lai Thành – người thầy tận tâm, nhiệt tình bảo, hướng dẫn động viên, cổ vũ tinh thần cho em suốt trình thực đề tài luận văn thạc sĩ Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo giảng dạy em năm qua, kiến thức tảng mà thầy cô nhiệt tâm truyền lại hành trang giúp em vững bước tương lai Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học Tế bào - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi tối đa cho em hoàn thành khóa học Xin chân thành cảm ơn cô chú, anh, chị, em Khoa Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị Bỏng, khoa Liền vết thương – Viện Bỏng Quốc Gia quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè tất người thân yêu động viên, khích lệ, giúp đỡ em trình học tập để em hoàn thành luận văn này! Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2016 Học viên Địch Thị Kim Hương MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tế bào gốc 1.1.1 Khái niệm tế bào gốc 1.1.2 Phân loại tế bào gốc 1.2 Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 1.3 Vết thương yếu tố tham gia liền vết thương 1.3.1 Diễn biến trình liền vết thương 1.3.2 Các thành phần tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương 11 1.4 Vết thương mạn tính 12 1.4.1 Các đặc điểm vết thương mạn tính 12 1.4.2 Một số loại vết thương mạn tính điển hình 13 1.4.3 Nguyên nhân điều trị vết thương mạn tính 15 1.5 Vai trò tế bào gốc liền vết thương 18 1.6 Một số ứng dụng tiêu biểu tế bào gốc trung mô lâm sàng 20 1.6.1 Ứng dụng điều trị tổn thương mạn tính xạ trị 20 1.6.2 Ứng dụng điều trị vết loét mạn tính tiểu đường 2021 1.7 Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh 221 1.7.1 Đánh giá tính an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua nhiễm sắc thể đồ 223 1.7.2 Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua định lượng enzyme telomerase 245 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, nguyên - vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2.2 Hóa chất cho nghiên cứu 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 299 2.2.1 Thu mô mỡ phân lập tế bào 299 2.2.2 Nuôi cấy tăng sinh tế bào ASCs 30 2.2.3 Xác định số lượng tế bào 30 2.2.4 Bảo quản phục hồi tế bào sau bảo quản 31 2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái tế bào nuôi cấy tăng sinh 32 2.2.6 Xác định khả tạo dòng tế bào 32 2.2.7 Lập kiểu nhân tế bào 32 2.2.8 Tách chiết định lượng enzyme telomerase tế bào sau nuôi cấy tăng sinh 33 2.2.9 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng tế bào gốc mô mỡ đến nguyên bào sợi in vitro 34 2.2.10 Theo dõi bệnh nhân có vết thương mạn tính ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 35 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 377 3.1 Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 377 3.2 Đặc điểm phân lập hình thái tế bào 38 3.3 Khả tạo colony tế bào gốc mỡ 40 3.4 Nuôi cấy tăng sinh nhân rộng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 444 3.5 Về việc đánh giá tính an toàn ASCs sau nuôi cấy tăng sinh 455 3.6 Tác động tế bào gốc mỡ bệnh nhân lên nguyên bào sợi da in vitro 51 3.7 Theo dõi trình liền vết thương ca sau ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 52 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết xử lý mẫu mô mỡ test mycoplasma 36 Bảng 3.2 Số lượng tế bào thu từ mô sau xử lý collagenase 38 Bảng 3.3 Tỷ lệ tạo colony hỗn dịch tế bào thu từ mô mỡ …… …41 Bảng 3.4 Khả tạo CFU-F theo hệ tế bào 44 Bảng 3.5 Thời gian đạt trạng thái cận che phủ hoàn toàn tế bào gốc mô mỡ 46 Bảng 3.6 Nồng độ Telomerase hệ tế bào nuôi cấy tăng sinh 49 Bảng 3.7 Số lượng tế bào mẫu nghiên cứu đối chứng 51 Bảng 3.8 Tỷ lệ sống nguyên bào sợi sau trypsin 52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vết thương nhiễm trùng 11 Hình 1.2 Vết thương sau xạ trị 12 Hình 1.3 Vết loét mạch máu 13 Hình 1.4 Vết loét chi bệnh tiểu đường 13 Hình 1.5 Vết loét tì đè 14 Hình 1.6 Cấu trúc vùng T-loop telomere 24 Hình 1.7 Chiều dài telomere hoạt tính telomerase dòng tế bào ung thư phổi 26 Hình 3.1 Hình thái tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy 39 Hình 3.2 Các đĩa colony sau nhuộm giemsa (mẫu số 1) 42 Hình 3.3 Các đĩa colony sau nhuộm giemsa (mẫu số 15) 42 Hình 3.4 Hình thái colony mẫu nghiên cứu theo thời gian 43 Hình 3.5 Đường cong tăng trưởng tế bào gốc mỡ 44 Hình 3.6 Bộ nhiễm sắc thể tế bào gốc mỡ định dạng theo nhiễm sắc thể 47 Hình 3.7 Bộ nhiễm sắc thể tế bào gốc mỡ lần cấy truyền thứ (P5) 48 Hình 3.8 Chiều dài telomere biểu telomerase số dòng tế bào 50 Hình 3.9 Vết thương sau ghép thời điểm theo dõi 53 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AB Antibiotic/Antimycotic - Kháng sinh ASCs Adipose-derived Stem Cells - Tế bào gốc mỡ bFGF Basic fibroblast growth factor – Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi D’MEM Dubeco’s Modified Eagle Medium – Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM EGF Epidermal Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng biểu bì FBS Fetal Bovine Serum - Huyết bào thai bò FGF Fibroblasts Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi MSCs Mesenchymal stem cells - Tế bào gốc trung mô P Passage- Cấy truyền PBS Phosphat Buffer Saline - Dung dịch đệm phosphate TNF – β Tumor Necrosis Factor – β – Nhân tố gây hoại tử khối u β TB Tế bào VEGF Vessle Endothelial Growth Factor – Nhân tố tăng trưởng tế bào nội mô MỞ ĐẦU Ứng dụng tế bào gốc tạo tiềm lớn cho y học tái tạo nhờ khả trì đặc tính gốc thời gian dài với đặc tính biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác điều kiện định Tế bào gốc có khả thay tế bào bị hư hỏng nhờ có khả điều trị bệnh Đặc tính thay sử dụng điều trị bỏng sâu, rộng; khôi phục hệ thống máu bệnh nhân bị bệnh rối loạn máu; chữa trị tổn thương gan não Đồng thời, mở triển vọng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Tế bào gốc công cụ quan trọng nghiên cứu bệnh tật có tiềm lớn để sử dụng lâm sàng Cho đến nay, loại tế bào gốc tế bào gốc phôi ứng dụng y học thành công tiềm chúng nhiều bị hạn chế so với tế bào gốc phôi Loại tế bào gốc sử dụng cho điều trị bao gồm nhóm chính: Tế bào gốc tạo máu; Tế bào gốc trung mô Tế bào gốc biểu mô Trong số nhóm nói trên, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (Adipose Derived Stem Cells – ASCs) quan tâm nhiều tiềm to lớn ứng dụng điều trị Thứ nhất, mô phổ biến, có nhiều thể người, dễ dàng thu nhận mà không gây xâm hại lớn tới thể tủy xương Điều đồng nghĩa với việc thu nhận lượng tế bào gốc trung mô mỡ phong phú so với tủy xương Hơn nữa, để thu thập mô mỡ, bệnh nhân cần phải gây tê cục vết thương bệnh nhân sau thu mỡ dễ dàng liền lại thời gian ngắn Thứ hai, mô dễ dàng tự bồi đắp thể Thứ ba lý quan trọng nhất, nguồn tế bào gốc thuận lợi cho sử dụng để ghép tự thân Với lý nói trên, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ coi nguồn tế bào gốc trưởng thành tự thân lý tưởng cho nghiên y học tái tạo, công nghệ mô liền vết thương Vết thương mạn tính hệ nhiều bệnh dị ứng, tiểu đường, bỏng sâu, bệnh hệ cứu thống miễn dịch da trường hợp tai nạn giao thông dẫn tới liệt người già ốm nằm chỗ lâu ngày gây loét da Các vết thương không điều trị nhanh chóng gây viêm nhiễm kéo dài làm thể dịch, chất dinh dưỡng suy kiệt Trường hợp thể có sức đề kháng dẫn tới viêm phổi, viêm đường tiết niệu, chí nhiễm trùng máu gây tử vong Có nhiều phương pháp điều trị vết thương mạn tính dùng thuốc kích thích phát triển tế bào, dùng oxy cao áp, tia laser hiệu thấp, can thiệp phẫu thuật thường thất bại áp dụng sức khỏe bệnh nhân không cho phép phẫu thuật khổng thể tự phục hồi vết thương Vì vậy, nhu cầu điều trị vết thương ghép tế bào gốc lớn, nhu cầu đặc biệt tăng cao bệnh nhân lớn tuổi Xuất phát từ sở khoa học tiềm ứng dụng tế bào gốc mỡ, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu, phân lập nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mỡ định hƣớng ghép tự thân điều trị vết thƣơng mạn tính” nhằm hai mục tiêu sau: Đánh giá khả tăng sinh tế bào gốc mỡ nuôi cấy bệnh nhân có vết thương mạn tính Đánh giá tính an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh 3.6 Tác động tế bào gốc mỡ bệnh nhân lên nguyên bào sợi da in vitro Sau tiến hành thí nghiệm đồng nuôi cấy, kết thu sau : Bảng 3.7 Số lượng tế bào mẫu nghiên cứu đối chứng Số lƣợng tế bào/giếng (x104) Giếng nguyên bào sợi Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ 4,0 6,2 10,8 3,6 5,3 9,7 Không đồng nuôi cấy 3,4 4,7 7,9 p A/B = 0,072 A/B < 0,001 A/B < 0,001 B/C = 0,066 B/C = 0,021 B/C 0,05 A/B > 0,05 A/B > 0,05 B/C > 0,05 B/C > 0,05 B/C > 0,05 A (n=5) Đồng nuôi cấy với ASCs chứng B (n=5) Đồng nuôi cấy với ASCs bệnh nhân C (n=5) Không có khác tỷ lệ sống nguyên bào sợi mẫu nghiên cứu có đồng nuôi cấy ASCs bệnh nhân (A) mẫu đối chứng dương (A - người hiến khỏe mạnh) chứng âm (C - không đồng nuôi cấy với ASCs) Tỷ lệ sống nguyên bào sợi mẫu nghiên cứu mẫu đối chứng âm chứng dương thời điểm ngày, ngày ngày đồng nuôi cấy nguyên bào sợi ASCs ổn định mức 96-97% 3.7 Theo dõi trình liền vết thƣơng ca sau ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Sau ghép với tế bào gốc trung mô từ mô mỡ vết thương làm sạch, kết ban đầu vết thương cho thấy: mật độ vi khuẩn giảm dần sau ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, trình biểu mô hóa mật độ mô hạt đỏ đẹp tăng dần, tình trạng tiết dịch giảm dần, vết thương tốt có cải thiện thời điểm nghiên cứu 52 a) b) c) d) Hình 3.9 Vết thương sau ghép thời điểm theo dõi a) Ngay trước ghép: Kích thước vết thương cm b) Vết thương thời điểm ngày sau ghép: Kích thước vết thương 2,5 cm c) Vết thương thời điểm 15 ngày sau ghép: Kích thước vết thương 2,2 cm d) Vết thương thời điểm 20 ngày sau ghép: Kích thước vết thương cm Sau 20 ngày ghép tế bào gốc mỡ, diện tích vết thương thu nhỏ lại khoảng 50%, không quan sát thấy phản ứng dị ứng, tình trạng tiết dịch, nhiễm khuẩn vết thương có cải thiện, tiêu sinh hóa máu thay đổi đáng kể so với thời điểm trước ghép Các phương pháp không sử dụng tế 53 bào gốc điều trị vết thương mạn tính trung bình 90 ngày để liền vết thương mạn tính giai đoạn có hoại tử mô da mô mỡ da trường hợp bệnh nhân [75] Như vậy, quan sát ban đầu ca bệnh nhân có vết thương mạn tính ghép với tế bào gốc mỡ cho thấy, tế bào gốc mỡ có hiệu điều trị vết thương có khả rút ngắn thời gian liền vết thương mà không ghi nhận thay đổi bất lợi khác số xét nghiệm bệnh nhân sau ghép 54 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu đánh giá khả tăng sinh nuôi cấy tế bào gốc mỡ bệnh nhân có vết thương mạn tính đánh giá tính an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh, kết kết luận rút sau: Phân lập thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ - Số lượng tế bào phân lập đạt 2,39 x 106 ± 1,3 TB/gram mô - Các tế bào có khả tạo colony, colony tế bào gốc mô mỡ thuộc dạng CFU-Fibroblast Tỷ lệ tạo CFU-F tế bào gốc mỡ hệ P1 - P5 đạt trung bình 16,3% Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ sau nuôi cấy tăng sinh tới hệ P5 hệ giữ hình thái, kiểu nhân, nồng độ enzyme telomerase giới hạn bình thường với giá trị trung bình hệ P3, P4, P5 0,169 ng/ml ASCs tự thân bệnh nhân có vết thương mạn tính có hiệu kích thích tăng sinh nguyên bào sợi có thấp so với ASCs người khỏe mạnh Tỷ lệ sống nguyên bào sợi mẫu ASCs nghiên cứu, mẫu đối chứng âm chứng dương thời điểm nghiên cứu ổn định mức 96 - 97% 55 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tính an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh theo nhiều tiêu chí số lượng mẫu nhiều Tiếp tục theo dõi kết ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ số lượng bệnh nhân lớn Theo dõi khả tạo khối u tế bào gốc mỡ sau ghép môi trường in vivo 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Đinh Văn Hân, Phan Minh Hoàng (2012), “Phân lập, đặc điểm hình thái khả tạo dòng tế bào gốc trung mô màng dây rốn”, Tạp chí Y học thảm họa Bỏng (2012); pp 35-43 Đoàn Hoàng Thu (2014), Nghiên cứu khả tăng sinh tế bào gốc mỡ ảnh hưởng chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng điều trị vết thương, Luận văn Thạc sỹ khoa học Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Gia Tiến, Đinh Văn Hân, Đoàn Hoàng Thu (2012), “Chế tạo vật liệu tương đương trung bì từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn điều kiện nuôi cấy không giá đỡ để điều trị vết thương bỏng”, Tạp chí Y học thảm họa bỏng (2012), pp 36-42 Trần Văn Hanh (1997), “Quan điểm mô học đại trình liền vết thương”, Tài liệu đào tạo sau đại học – chuyên đề mô học, Đại học Y Hà Nội, tr 141-156 B Tiếng Anh Akita S, Akino K, Hirano A, Ohtsuru A, Yamashita S (2010), “Noncultured autologous adipose-derived stem cells therapy for chronic radiation injury”, Stem Cells International, pp 1-8 Al Battah F, De Kock J, Vanhaecke T, Rogiers V (2011), “Current status of human adipose-derived stem cells: differentiation into hepatocyte-like cells”, Scientific World Journal, 11 (), pp.1568-81 Ana CC Paula, Thaís MM Martins, Alessandra Zonari, Soraia PPJ Frade, Patrícia C Angelo, Dawidson A Gomes, and Alfredo M Goes (2015), “Human adipose tissue-derived stem cells cultured in xeno-free culture condition enhance cMYC expression increasing proliferation but bypassing spontaneous cell transformation”, Stem Cell Research & Therapy, 6(1), pp 76 Andrew J.M Boulton, David G Armstrong, Stephen F Albert, Robert G Frykberg, Richard Hellman, M Sue Kirkman, Lawrence A Lavery, Joseph W LeMaster, Joseph L Mills, Michael J Mueller, Peter Sheehan and Dane K Wukich (2008), “Comprehensive Foot Examination and Risk Assessment Diabetes Care, 31(8), pp 1679-1685 Lauren Collins, Samia Seraj, Thomas Jefferson (2010), “Diagnosis and Treatment of Venous Ulcers” American Family Physician, 81(8), pp 989-996 10 Armanios M, Greider CW (2005), “Telomerase and cancer stem cells.” Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 2005 (70), pp 205-8 11 Blasco MA (2003), “Mammalian telomeres and telomerase: why they matter for cancer and aging”, European Journal of Cell Biology; 82(9), pp 441-6 12 C Bellotti, D Stanco, S Ragazzini, L Romagnoli, E Martella, S Lazzati, C Marchetti, D Donati, E Lucarelli (2013), “Analysis of the Karyotype of Expanded Human Adipose-Derived Stem Cells for Bone Reconstruction of the Maxillo-Facial Region”, International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 26 (1), pp 3-9 13 Carol W Greider (1998), “Telomerase activity, cell proliferation, and cancer”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(1), pp 90–92 14 Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J (2007), “Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing” Stem Cells, 25(11), pp 2739-49 15 D Broccoli, J W Young, and T de Lange (1995), “Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences 92 (20), pp 9082–9086 16 De Lange T, Shiue L, Myers RM, Cox DR, Naylor SL, Killery AM, Varmus HE (1990), “Structure and variability of human chromosome ends”, Molecular and Cellular Biology, 10(2), pp 518-27 17 E Hiyama, K Hiyama (2007), “Telomere and telomerase in stem cells”, British Journal of Cancer, 96(7), pp 1020–1024 18 Ebrahimian TG, Pouzoulet F, Squiban C, Buard V, André M, Cousin B (2009), “Cell therapy based on adipose tissue-derived stromal cells promotes physiological and pathological wound healing”, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 29 (4), pp 503-10 19 Erices A, Conget P, Minguell JJBr (2000), “Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood”, British Journal of Haematology, 109(1), pp 235-42 20 Frank Werdin MD, Mayer Tennenhaus, MD, Hans-Eberhardt Schaller, MD, and Hans-Oliver Rennekampff, MdcEplasty (2009), “Evidence-based Management Strategies for Treatment of Chronic Wounds”, Eplasty 21 Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Latsinik NV, Panasyuk AF, Keiliss-Borok IV (1974) “Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues”, Transplantation, 17(4), pp 331-40 22 Fromm-Dornieden C, Koenen P (2013) “Adipose-derived stem cells in wound healing: recent results in vitro and in vivo”, Molecul ar & Cell Biology, 20; pp 1-8 23 Frykberg RG, Banks J (2015), “Challenges in the Treatment of Chronic Wounds”, Advance Wound Care, (9), pp 560-582 24 Garcia-Olmo D, Herreros D, Pascual M, Pascual I, De-LaQuintana P, Trebol J (2009) “Treatment of enterocutaneous fi stula in Crohn’s Disease with adiposederived stem cells: A comparison of protocols with and without cell expansion” International Journal of Colorectal Disease, (24), pp 27-30 25 Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S (2000), “Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(25), pp 13625-30 26 Han SK, Kim HR, Kim WK (2010) “The treatment of diabetic foot ulcers with uncultured, processed lipoaspirate cells: A pilot study” Wound Repair and Regeneration, (18), pp 342-8 27 Haniffa MA,WangXN, Holtick U, Rae M, Isaacs JD, Dickinson AM, Hilkens CM, Collin MP (2007), “Adult human fibroblasts are potent immunoregulatory cells and functionally equivalent to mesenchymal stem cells”, Journal Immunology, 179(3), pp 1595-604 28 Harley CB, Futcher AB, Greider CW (1990), “Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts”, Nature, 345(6274), pp 458-60 29 Hastie ND, Dempster M, Dunlop MG, Thompson AM, Green DK, Allshire RC (1990),“Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing”, Nature, 346(6287), pp 866-8 30 J Bernier, J Bonner, J B Vermorken R., J Bensadoun, R Dummer, J Giralt, G Kornek, A Hartley, R Mesia, C Robert, S Segaert K, K Ang (2008), “Consensus guidelines for the management of radiation dermatitis and coexisting acne-like rash in patients receiving radiotherapy plus EGFR inhibitors for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck” Annals of Oncology, 19 (1), pp 142-149 31 Josh F1, Kobe K, Tobita M, Tanaka R, Suzuki K, Ono K, Hyakusoku H, Mizuno H (2012, “Accelerated and safe proliferation of human adipose-derived stem cells in medium supplemented with human serum’, Journal of Nippon Medical School, 79(6), pp 444-52 32 Jung JW, Kwon M, Choi JC, Shin JW, Park IW, Choi BW, et al Familial occurrence of pulmonary embolism after intravenous, adipose tissue-derived stem cell therapy Yonsei Medicine Journal 2013;54:1293-6 33 K Kishi, N Imanishi, H Ohara (2010), “Distribution of adipose-derived stem cells in adipose tissues from human cadavers,” Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, 63(10), pp 1717–1722 34 Knippenberg M., Helder M N., Doulabi B Z., Semeins C M., Wuisman P I J M., Klein-Nulend J (2005), “Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells acquire bone cell-like responsiveness to fluid shear stress on osteogenic stimulation”, Tissue Engineering, 11(11-12), pp.1780–1788 35 Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M., Benayahu D., Robey P.G (1997), “Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo” Journal of Bone and Mineral Research, 12 (9), pp 1335–1347 36 Lin Y, Uemura H, Fujinami K, Hosaka M, Harada M, Kubota Y (1997), “Telomerase activity in primary prostate cancer”, The Journal of Urology, 157 (3), pp 1161–1165 37 Lipsky BA, Berendt AR, Cornia PB, Pile JC, Peters EJ, Armstrong DG, Deery HG, Embil JM, Joseph WS, Karchmer AW, Pinzur MS, Senneville E (2012), “Infectious Diseases Society of America clinical practice guideline for the diagnosis and treatment of diabetic foot infections” Clinical Infectious Diseases; 54(12), pp.132-73 38 Mamidi MK, Nathan KG, Singh G, Thrichelvam ST, Mohd Yusof NA, Fakharuzi NA, Zakaria Z, Bhonde R, Das AK, Majumdar AS (2012), “Comparative cellular and molecular analyses of pooled bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells during continuous passaging and after successive cryopreservation” Journal of Cellular Biochemistry, 113(10), 3153-64 39 Marta García-Contreras, César David Vera-Donoso, José Miguel HernándezAndreu, José Manuel García-Verdugo, and Elisa Oltra (2014), “Therapeutic Potential of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs) from Cancer Patients: A Pilot Study”, PLoS One, 9(11) 40 Mesimäki K, Lindroos B, Törnwall J, Mauno J, Lindqvist C, Kontio R, Miettinen S, Suuronen R (2009), “Novel maxillary reconstruction with ectopic bone formation by GMP adipose stem cells”, International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 38(3), pp 201-9 41 Meza-Zepeda LA, Noer A, Dahl JA, Micci F, Myklebost O, Collas P (2008), “High-resolution analysis of genetic stability of human adipose tissue stem cells cultured to senescence”, Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12(2): 553– 563 42 Mustoe TA, O'Shaughnessy K, Kloeters O (2006), “Chronic wound pathogenesis and current treatment strategies: a unifying hypothesis”, Plastic and Reconstructive Surgery, 117(7), pp 35-41 43 Nambu M, Ishihara M, Nakamura S, Mizuno H, Yanagibayashi S, Kanatani Y, Hattori H, Takase B, Ishizuka T, Kishimoto S, Amano Y, Yamamoto N, Azuma R, Kiyosawa T (2007), “Enhanced healing of mitomycin C-treated wounds in rats using inbred adipose tissue-derived stromal cells within an atelocollagen matrix”, Wound Repair and Regeneration, 15(4), pp 505-10 44 Nie C, Yang D, Xu J, Si Z, Jin X, Zhang (2011), “Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis”,Cell Transplantation, 20(2), pp 205-16 45 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR (1999), “Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells”, Science 284 (5411), pp 143147 46 Ranera B, Remacha AR, Álvarez-Arguedas S, Castiella T, Vázquez FJ, Romero A, Zaragoza P, Martín-Burriel I, Rodellar C (2013), “Expansion under hypoxic conditions enhances the chondrogenic potential of equine bone marrowderived mesenchymal stem cells” The Veterinary Journal, 195(2), pp 248-51 47 Raynaud CM, Maleki M, Lis R, Ahmed B, Al-Azwani I, Malek J, Safadi FF, Rafii A (2012), “Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from human placenta and fetal membrane and their response to osteoactivin stimulation” Stem Cells International, 2012 (658356) 48 Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL (2004), “Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells”, Circulation, 109 (10), pp 1292-8 49 Riekstina U, Muceniece R, Cakstina I, Muiznieks I, Ancans J (2008), “Characterization of human skin-derived mesenchymal stem cell proliferation rate in different growth conditions” Cytotechnology, 58(3), pp 153-62 50 Rigotti G, Marchi A, Galiè M, Baroni G, Benati D, Krampera M (2007), “Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant: A healing process mediated by adipose-derived adult stem cells”, Plastic and Reconstructive Surgery (119), pp 1409-22 51 Robert Lanza, John Gearhart, Brigid Hogan, Douglas Melton, Roger Pedersen, E Donnall Thomas, James Thomson and Sir Ian Wilmut (2009), Essentials of Stem Cell Biology, Elsevier, Canada 52 Rotter N, Oder J, Schlenke P, Lindner U, Böhrnsen F, Kramer J, Rohwedel J, Huss R, Brandau S, Wollenberg B, Lang S (2008), “Isolation and characterization of adult stem cells from human salivary glands” Stem Cells and Development, 17(3), pp 509-18 53 Roufosse CA, Direkze NC, Otto WR, Wright NA (2004), “Review Circulating mesenchymal stem cells”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36(4), pp 585-97 54 Schüring AN, Schulte N, Kelsch R, Röpke A, Kiesel L, Götte M (2011), “ Characterization of endometrial mesenchymal stem-like cells obtained by endometrial biopsy during routine diagnostics” Fertility and Sterility, 95(1), pp 423-6 55 Sessarego N, Parodi A, Podestà M, Benvenuto F, Mogni M, Raviolo V, Lituania M, Kunkl A, Ferlazzo G, Bricarelli FD, Uccelli A, Frassoni F (2008), “Multipotent mesenchymal stromal cells from amniotic fluid: solid perspectives for clinical application, Haematologica, 93(3), pp 339-346 56 Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW (1998), “Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 95, pp.13726-13731 57 Tamara Borgonovo, Isadora May Vaz, Alexandra Cristina Senegaglia, Carmen Lucia Kuniyoshi Rebelatto, Paulo Roberto Slud Brofman (2014) “Genetic evaluation of mesenchymal stem cells by G-banded karyotyping in a Cell Technology Center”, Rev Bras Hematol Hemoter, 36(3), pp 202–207 58 Umesh D Wankhade, Michael Shen, Ravindra Kolhe, and Sadanand Fulzele (2016), “Advances in Adipose-Derived Stem Cells Isolation, Characterization, and Application in Regenerative Tissue Engineering”, Stem Cells International, 2016(5), pp 1-9 59 Vériter S, André W, Aouassar N, Poirel HA, Lafosse A, Docquier PL, Dufrane D (2015), “Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Cell Therapy: Safety and Feasibility in Different "Hospital Exemption" Clinical Applications”, PLoS One, 10 (10) 60 Wan Safwani Wan Kamarul Zaman, Suzana Makpol, Somasundaram Sathapan, Kien Hui Chua (2014), “Long-term in vitro expansion of human adiposederived stem cells showed low risk of tumourigenicity”, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 8(1), pp 67-76 61 Wang HS, Hung SC, Peng ST, Huang CC, Wei HM, Guo YJ, Fu YS, Lai MC, Chen CC (2004), “Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord” Stem Cells, 22(7), pp 1330-7 62 Wellinger R.J., Ethier K., Labrecque P., Zakian V.A.(1996), “Evidence for a new step in telomere maintenance”,Cell, 85, pp 423–433 63 William T Wake (2010), “Pressure Ulcers: What Clinicians Need to Know” The Permanente Journal, 14(2), pp 56–60 64 Wu XB, Tao R (2012), “Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells” Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International, 11(4), pp 360-71 65 Y Wang, D.L Huso, J Harrington, J Kellner, D.K Jeong, J Turney (2005), “Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture”, Cytotherapy, 7, pp 509–519 66 Young DA, DeQuach JA, Christman KL (2011), “Human cardiomyogenesis and the need for systems biology analysis”, WIREs Systems Biology and Medicine, 3(6), pp 666-80 67 Youwei Wang, Zhi-bo Han, Yong-ping Song, and Zhong Chao Han (2012), “Safety of Mesenchymal Stem Cells for Clinical Application”, Stem Cells International, 2012 (2012), pp.1-4 68 Z.X Zhang, L.X Guan, K Zhang ((2007), “Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro”, Cell Biology International, 31 (2007), pp 645–648 69 Zimmerlin L, Donnenberg VS, Pfeifer ME, Meyer EM, Péault B, Rubin JP (2010), “Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue”, Cytometry Part A , (77), pp 22-30 70 Zoe Marie MacIsaac, Hulan Shang, Hitesh Agrawal, Ning Yang, Anna Parker, and Adam J Katz (2011) ”Long-term In-Vivo Tumorigenic Assessment of Human Culture-expanded Adipose Stromal/Stem Cells”, Experimental Cell Research, 318(4), pp 416–423 71 Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH (2002) Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells Mol Biol Cell., 13(12), pp 4279-95 72 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH (2001), “Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies” Journal of Tissue Engineering, 7(2), pp 211-28 ... Nghiên cứu, phân lập nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mỡ định hƣớng ghép tự thân điều trị vết thƣơng mạn tính nhằm hai mục tiêu sau: Đánh giá khả tăng sinh tế bào gốc mỡ nuôi cấy bệnh nhân có vết. .. 6.000.000 tế bào sau tách từ 1ml mỡ hút sau xử lý SVF chứa gồm loại tế bào khác tế bào gốc trung mô, tế bào gốc mỡ, tế bào gốc tạo máu tế bào tế bào gốc nguyên bào sợi, tế bào máu, tiền thân tế bào mỡ. .. KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH Chuyên ngành : Sinh học