Luận văn cao học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN KHẮC SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ TỪ HẢI SÂM CERCODEMAS ANCEPS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, 2016 i Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN KHẮC SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ TỪ HẢI SÂM CERCODEMAS ANCEPS Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.0114 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN XUÂN CƢỜNG PGS TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG HÀ NỘI, 2016 ii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi tình cảm chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến với: TS Nguyễn Xuân Cƣờng, người thầy hướng dẫn luận văn tốt nghiệp Đối với tôi, lĩnh vực hóa sinh mẻ thầy giúp tiếp cận cách dễ dàng nhất; hỗ trợ lúc, kịp thời để có nhìn sâu sắc lĩnh vực mới.Tuy nhiều kiến thức cần phải học hỏi chắn thầy bảo tiền đề vững cho có khả tìm hiểu sâu kỹ thuật hóa sinh PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, người thầy vô kính trọng có ảnh hưởng sâu sắc đến Cô không người lãnh đạo nhóm Ung thư học thực nghiệm mà phó chủ nhiệm môn Sinh học tế bào.Với bao bộn bề công việc, cô dành cho khoảng thời gian để giúp giải khó khăn công việc Mỗi lần cô dạy tận tình lại thấy thật may mắn cô nhận vào nhóm nghiên cứu Cô dạy kiến thức kỹ thực hành, truyền lại cho kinh nghiệm tinh thần làm việc, cho nơi làm thí nghiệm hỗ trợ vật chất.Cùng với lời động viên nho nhỏ, động lực để bước qua rào cản lớn công việc ThS Bùi Thị Vân Khánh, người chị gắn bó với hệ sinh viên, có thời sinh viên Tôi nghe nói nhiệt tình chị sinh viên, làm việc chị thấy hết nổ nhiệt tình chị.Tôi muốn dành lời cảm ơn đặc biệt đến với chị nói giúp đỡ chị khó mà hoàn thành công việc mình.Chị động viên nói chuyện quan tâm đến ngày cuối trước hoàn thành công việc ThS Nguyễn Đắc Tú, CN.Lê Thị Kim Anh, ThS Nguyễn Thị Ngọc Ánh người anh, người chị lớn gia đình, gần gũi chăm lo cho nhóm nghiên cứu.Các anh chị không quan tâm đến công việc lo đời sống tinh thần cho em, tạo không khí vui vẻ, môi trường làm việc thân thiện, tốt cho em Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PhòngDƣợc liệu biển, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp phân lập xác định cấu trúc hợp chất saponin với tài trợ kinh phí từ Đề tài nghiên cứu khoa học trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam: “Nghiên cứu khai thác dược iii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học liệu Da gai vùng biển Đông bắc Việt Nam theo định hướng hoạt tính diệt tế bào ung thư kháng sinh", mã số VAST.TĐ.ĐAB.03/13-15 Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Khoa Sinh học nói chung thầy cô Bộ môn Sinh học tế bào nói riêng Thầy cô giúp có kiến thức vững vàng kỹ để tìm hiểu vấn đề quan tâm.Điều giúp nhiều việc hoàn thành khoá luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, cảm ơn từ bé nhỏ mà gia đình dành cho Tất vui vẻ với lựa chọn tôi, ủng đường đi, làm Cảm ơn anh chị đồng nghiệp, bạn bè hỗ trợ để có thời gian hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn Khắc Sinh iv Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN .3 1.1 Saponin .3 1.1.1 Saponin khả kháng u 1.1.2 Cơ chế kháng u số saponin 1.1.3 Mối liên quan cấu trúc chức kháng u saponin 1.2 Saponin từ hải sâm 1.2.1 Hải sâm 1.2.2 Nguồn saponin từ hải sâm 1.3 Một số phƣơng pháp phân lập xác định cấu trúc hợp chất hóa học 1.3.1 Sắc ký cột .9 1.3.2 Sắc kí lớp mỏng 10 1.3.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR) 10 1.4 1.3.3.1 Phổ 1H-NMR 10 1.3.3.2 Phổ 13C-NMR 10 1.3.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) 11 1.3.3.4 Phổ 2D-NMR 11 Ung thƣ 12 13 1.5 Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thƣ .16 1.5.1 Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào .16 1.5.2 Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào 18 1.5.3 Mô hình động vật thí nghiệm 18 Chƣơng – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 i Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học 2.1.1 Loài hải sâm Cercodemas anceps .20 2.1.2 Mẫu chế phẩm sinh học 21 2.1.3 Dòng tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180 21 2.1.4 Dòng tế bào ung thƣ vú MCF7 21 2.1.5 Dòng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 22 2.1.6 Chuột nhắt trắng Swiss 22 2.2 Hoá chất, thiết bị 23 2.2.1 Hoá chất .23 2.2.2 Thiết bị .24 2.2.3 Dụng cụ vật tƣ tiêu hao .25 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm 26 2.3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ hải sâm 26 2.3.3 Phƣơng pháp thử độc tính tế bào mô hình đơn lớp 27 2.3.4 Phƣơng pháp xác định tế bào apoptosis dƣới tác dụng CPSH 30 2.3.5 Phƣơng pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm 33 2.3.6 Phƣơng pháp thử tác dụng chế phẩm chuột thí nghiệm 34 2.3.7 Các phƣơng pháp đánh giá tác dụng kháng u chế phẩm sinh học 35 Chƣơng – KẾT QUẢ 38 3.1 Kết phân lập hợp chất từ hải sâm Cercodemas anceps 38 3.2 Kết xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc 39 39 3.3 Kết thử độc tính với tế bào hai chất phân lập 49 3.4 Kết đánh giá tác động CPSH mô hình in vitro in vivo 52 ii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ .64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 iii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1.1: Các đặc trƣng tế bào ung thƣ 13 Hình 1.2: Quá trình chết theo chƣơng trình (apoptosis) 15 Hình 1.3: Sự biểu sớm PS màng tế bào chết theo chƣơng trình .16 Hình 1.4: Một số dòng tế bào ung thƣ dạng sống chúng 17 Hình 1.5: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin Error! Bookmark not defined Hình 2.1: Loài hải sâm Cercodemas anceps nghiên cứu 20 Hình 2.2: Tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180 nghiên cứu 21 Hình 2.3: Tế bào ung thƣ vú MCF7 nghiên cứu 22 Hình 2.4: Tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 nghiên cứu 22 Hình 2.5: Chuột nhắt trắng Swiss (Mus musculus) nghiên cứu .23 Hình 2.6: Cấu trúc hoá học muối MTS sản phẩm màu Formazan 27 Hình 2.7: Tỷ lệ độ hấp thụ ánh sáng 490 nm với số lƣợng tế bào .27 Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS 28 Hình 2.9: Xác định số IC50 .30 Hình 2.10: Annexin V gắn màng tế bào chết theo chƣơng trình .30 Hình 2.11: Hình ảnh cắt dọc cấu trúc da 33 Hình 2.12: Thuốc 6MP (Purinethol hay Mercaptopurine) 35 Hình 2.13: Thƣớc kẹp caliper 36 Hình 3.1: Phổ 13C-NMR chất .39 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR chất 41 Hình 3.3: Phổ HSQC chất 41 Hình 3.4: Phổ HMBC chất 42 Hình 3.5: Phổ COSY chất .43 Hình 3.6: Phổ ROESY chất 44 Hình 3.7: Cấu trúc hóa học hợp chất – hợp chất colochiroside A 44 iv Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Hình 3.8: Phổ 13C-NMR chất .45 Hình 3.9: Phổ 1H-NMR chất 45 Hình 3.10: Phổ HMBC chất 47 Hình 3.11: Phổ HSQC chất 47 Hình 3.12: Phổ COSY chất 48 Hình 3.13: Phổ ROESY chất 48 Hình 3.14: Cấu trúc hóa học hợp chất – hợp chất philinopside A 49 Hình 3.15: Đƣờng cong đáp ứng liều tế bào HCT116 với hai chất .50 Hình 3.16: Đƣờng cong đáp ứng liều tế bào Sar-180 với hai chất .51 Hình 3.17: Đƣờng cong đáp ứng liều tế bào MCF7 với hai chất 51 Hình 3.18: Đƣờng cong đáp ứng liều Sar.180 (A) MCF7 (B) CPSH 53 Hình 3.19: Mẫu ĐC TB Sar.180 với Annecxin V 54 Hình 3.20: Mẫu ĐC TB Sar.180 với PI 54 Hình 3.21: Mẫu ĐC TB MCF7 với Annecxin V 54 Hình 3.22: Mẫu ĐC TB MCF7 với PI 55 Hình 3.23: Tế bào Sar.180 nhuộm Annexin V sau ủ với CPSH 56 Hình 3.24: Tế bào Sar.180 nhuộm nhân PI sau ủ với CPSH 56 Hình 3.25: Tế bào MCF7 nhuộm Annexin V sau ủ với CPSH .57 Hình 3.26: Tế bào MCF7 nhuộm nhân PI sau ủ với CPSH 57 Hình 3.27: U thực nghiệm dƣới da số chuột thí nghiệm .58 Hình 3.34: Đồ thị biểu diễn tăng trọng lƣợng lô ung thƣ trình thí nghiệm 59 Hình 3.29: Hình ảnh khối u chuột lô thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau cấy u 60 Hình 3.30: Đồ thị tăng trƣởng kích thƣớc trung bình u rắn lô thí nghiệm 61 v Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng thí nghiệm 23 Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 2.3: Dụng cụ vật tƣ dùng thí nghiệm 25 Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng thí nghiệm MTS 28 Bảng 2.5: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS 29 Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định tế bào chết theo chƣơng trình 31 Bảng 2.7: Quy trình tiến hành thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang 31 Bảng 2.8: Lô thông số trình thí nghiệm 35 Bảng 2.9: Thang đánh giá hiệu lực kháng u H Itokawa 37 Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) 13C-NMR 125 MHz, Pyridine-d5) phần aglycon hợp chất 1, chất tham khảo 40 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) 13C-NMR (125 MHz, Pyridine-d5) phần chuỗi đƣờng hợp chất 1, chất tham khảo 46 Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lƣợng trung bình chuột lô thí nghiệm .59 Bảng 3.4: Theo dõi kích thƣớc khối u trình thử nghiệm 61 Bảng 3.5: Tổng hợp kết khảo sát tác dụng kháng u CPSH chuột mang u rắn Sar.180 62 Bảng 3.6: Các số huyết học chuột lô thí nghiệm đối chứng .63 vi Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học A B Hình 3.19: Mẫu ĐC TB Sar.180 với Annecxin V Đối chứng không nhuộm (A) Đối chứng có nhuộm (B), kháng thể Annexin V cho tín hiê ̣u màu xanh lá (FITC) A B Hình 3.20: Mẫu ĐC TB Sar.180 với PI Đối chứng không nhuộm (A) Đối chứng có nhuộm (B), nhuộm nhân Propidium Idide cho tín hiê ̣u màu đỏ (PI) A B Hình 3.21: Mẫu ĐC TB MCF7 với Annecxin V Đối chứng không nhuộm (A) Đối chứng có nhuộm (B), kháng thể Annexin V cho tín hiê ̣u màu xanh lá (FITC) 54 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học A B Hình 3.22: Mẫu ĐC TB MCF7 với PI Đối chứng không nhuộm (A) Đối chứng có nhuộm (B), nhuộm nhân Propidium Idide cho tín hiê ̣u màu đỏ (PI) Sau thời gian 24h ủ với CPSH, tế bào nhuô ̣m với kháng thể đă ̣c hiê ̣u apoptosis Annecxin V cho tín hiệu màu xanh thuốc nhuộm nhân PI (Propidium Iodide) cho tín hiệu màu đỏ.Tín hiệu xanh Annecxin V biểu tế bào chết theo chương trình giai đoạn sớm, tín hiệu đỏ PI cho biết tế bào có màng sinh chất không toàn vẹn, trình muộn chết theo chương trình Đối với đối chứng không thử thuốc, tế bào có nhuô ̣m và không nhuô ̣m kháng thể ở cả hai dòng tế bào , cho kết biểu tín hiệu Annexin V màng cũng tín hiê ̣u nhân PI nhuô ̣m nhân dưới b ước sóng kích thích Các hình 3.19 – 3.22 ảnh chụp vài vi trường quần thể tế bào Một vài vi trường có nhận điểm bắt màu thuốc nhuộm có tế bào chết quần thể đối chứng số lượng ghi nhận không đáng kể nên kết sở để so sánh với mẫu tế bào thử thuốc Tế bào Sarcoma 180 sau 24 ủ với CPSH nồng độ 10, 20, 40µg/ml cho thấy tín hiệu quần thể có tế bào chết theo chương trình (những tế bào bắt màu xanh thuốc nhuộm Annexin V) Trong đó, nồng độ 10µg/ml ghi nhận tín hiệu yếu nhất, nồng độ 40µg/ml ghi nhận nhiều tín hiệu tế bào bắt màu xanh với cường độ lớn hẳn so với hai nồng độ lại (Hình 3.23) Tín hiệu màu đỏ (nhuộm nhân PI) xuất rõ nồng độ 40µg/ml chứng tỏ tế bào chết theo chương trình nồng độ chết giai đoạn muộn apoptosis 55 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học B A C Hình 3.23: Tế bào Sar.180 nhuộm Annexin V sau ủ với CPSH (A) 10µg/ml, (B) 20 (C) 40µg/ml, sau 24h, màu xanh B A C Hình 3.24: Tế bào Sar.180 nhuộm nhân PI sau ủ với CPSH 10µg (A), 20µg(B) 40µg(C), sau 24h, màu đỏ Một vài tế bào bắt màu đỏ rõ ràng nồng độ 20µg/ml tín hiệu đỏ yếu nồng độ 10µg/ml Như vậy, nồng độ thấp 10 µg/ml CPSH cho thấy khả gây chết theo chương trình, quan sát giai đoạn sớm mốc thời gian 24 thí nghiệm 56 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học a b A c B C Hình 3.25: Tế bào MCF7 nhuộm Annexin V sau ủ với CPSH (A) 10µg/ml, (B) 20µg/ml (C) 40µg/ml, sau 24h, màu xanh a b c A B C Hình 3.26: Tế bào MCF7 nhuộm nhân PI sau ủ với CPSH 10µg/ml (A), 20µg/ml (B) 40µg/ml (C), sau 24h, màu đỏ Đối với dòng tế bào MCF7, nồng độ CPSH 40 µg/ml gây chết tế bào mạnh khiến cho tế bào bong khỏi bề mặt nuôi cấy gần 90% nên số lượng tế bào lại không phản ánh trạng thái quần thể Ở nồng độ 20µg/ml, MCF7 chịu tác động mạnh nên tỷ lệ chết bong khỏi bề mặt nuôi cấy lớn, bào cố định bề mặt nuôi cấy cho thấy tín hiệu chết theo chương trình rõ (Hình 3.25B) Kết hợp với hình ảnh MCF7 ủ 20µg/ml, nhuộm nhân PI (Hình 3.26B) cho thấy màu đỏ không tập trung vùng nhân mà rộng hầu khắp tế bào, chứng tỏ quần thể tế bào chết theo chương trình giai đoạn muộn có tế bào chết hoại tử (neucrosis) tác động mạnh chế phẩm nồng độ 20µg/ml Ở nồng độ 10 µg/ml, tế bào giữ tính chất quần thể Các tế bào chết theo chương trình biểu rõ với tín hiệu màu xanh (Hình 3.25) Kết hợp với hình ảnh nhuộm nhân PI (Hình 3.26) cho thấy nhiều trường hợp tế bào chết khác nhau: Tế bào chết theo chương trình giai đoạn sớmvới biểu bắt màu 57 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học xanh Annecxin V mà không bắt màu đỏ PI (mũi tên a), tế bào chết theo chương trình giai đoạn muộn với biểu bắt màu xanh bắt màu đỏ (mũi tên b) tế bào không bắt màu xanh Annecxin V bắt màu đỏ PI cho thấy tế bào chết không theo apoptosis Như vậy, chế phẩm có tác dụng gây chết theo chương trình MCF7 nồng độ 10µg/ml tín hiệu Annecxin V thí nghiệm không đại điện cho quần thể apoptosis giai đoạn sớm Thời điểm đánh giá 24 muộn so với tác động chế phẩm dòng MCF7 Kết gây u thực nghiệm cho chuột thí nghiệm Sau nuôi cấ y in vitro tế bào nghiên cứu , thu lươ ̣ng tế bào đủ cho viê ̣c cấ y ghép thể chuô ̣t với tỉ lê ̣ 1,5x106 tế bào/conx30con Trong thí nghiệm cũng thực hiê ̣n c ghép tế bào da vùng ngực (lệch phía bên trái).Kết gây u thực nghiệm thể qua hình 3.27 Hình 3.27: U thực nghiệm dƣới da số chuột thí nghiệm Qua hình ảnh thu cho thấy khả tạo u rắn chuột dòng tế bào Sar.180 tốt ổn định, đạt tỷ lệ 100% cá thể chuột lên u, khối u quan sát rõ Kết ảnh hưởng chế phẩm lên tăng trọng chuột Trong trình thử nghiệm, để tìm hiểu tác động chế phẩm đến tăng trọng lượng chuột thí nghiệm, tiến hành theo dõi trọng lượng chuột sau 58 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học ngày ghi lại trọng lượng sau ngày lô, sau sử dụng chương trình Microsoft Office 2010 tính trọng lượng trung bình, sai số lô Đồng thời, tiến hành theo dõi biểu hoạt động, ăn, uống, vận động học chúng Kết lần cân thể Bảng 3.1 Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lƣợng trung bình chuột lô thí nghiệm Lần cân Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 12 Ngày 15 Ngày 18 Ngày 21 Ngày 24 Lô Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần ĐCSH Lần cân 20.2±1.3 23±0.9 26.4±1.0 34.2±1.1 38±2.4 43±1.6 46±2.7 47.4±2.1 49±4 ĐCUT 20.3±1.3 22.9±1.5 26.3±1.5 32.9±1.8 35.1±2.6 40.1±2.5 41±3.1 43.2±3.1 44.1±4.4 UT+6MP 20.4±1.1 23±1.2 25.9±1.2 28.3±1.6 31.6±3.3 29.6±2.05 30.9±2.1 33.3±2.7 33.3±3.6 UT+CPSH 20.2±1.4 23.3±1.8 27.1±1.8 29.3±1.7 32.1±3.03 35.9±2.9 37.5±5.1 39.7±3.2 39.5±2.8 P (g) Trọng lƣợng chuột trình thí nghiệm UT+CPSH Lần cân Hình 3.28: Đồ thị biểu diễn tăng trọng lƣợng lô ung thƣ trình thí nghiệm Về hình thái chung , chuột mang u rắn thử nghiệm với chế phẩm cũng các lô ĐCSH và ĐCUT đề u có th ể trạng tốt tượng bỏ ăn , tính chất phân không bất thường , lông không sù, chậm chạp hay số biểu đặc biệt run rẩy, co giật Trọng lượng thể chuột lô đối chứng tăng đều, phản ánh tình trạng sức khỏe đạt yêu cầu để làm đối chứng Ở lô UT+6MP có các biể u hiê ̣n sau thử nghiê ̣m ở lầ n (ngày thứ 14 sau cấ y ghép ) chuô ̣t bắ t đầ u ăn uố ng ít, lông xù, sút cân, hoạt động lần thử sau thể rõ Hiện 59 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học tượng tác dụng phụ thuốc 6MP ảnh hưởng đến thể chuột Qua đó, thấy chế phẩm tác động gây độc, an toàn cho chuột mang u rắn thử nghiệm với liều Kết kháng u rắn Sarcoma 180 da chế phẩm 30 chuột cấy ghép u với tế bào ung thư Sarcoma 180 chia làm lô, lô 10 ĐCUT, UT+CPSH, UT+6MP.Kết quan sát khối u tính đến ngày thứ 32 sau cấy ghép u ngày kết thúc đợt thử nghiệm CPSH, kích thước khối u lô chuột thử nghiệm với thuốc 6MP (chứng dương) nhỏ tiêu biến đáng kể so với ban đầu (Hình 3.29) Kích thước khối u lô ĐCUT không thử nghiệm thuốc có thích thước lớn thời điểm hầu hết khố i u ở lô này đề u to và có xuấ t hiê ̣n lõi hoa ̣i tử rõ ràng Đối với lô UT+CPSH, 1/3 số khố i u xuất lõi hoại tử Như vậy, ngày 32, kích thước khối u lô UT+CPSH nhỏ lô ĐCUT lớn lô đối chứng dương UT+6MP Sự chênh lệch kích thước khối suốt trình thí nghiệm thể rõ qua bảng 3.4 ĐCUT UT+6MP 2.90cm 0.44cm3 UT+CPSH 1.37cm3 Hình 3.29: Hình ảnh khối u chuột lô thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau cấy u Trong trình thử nghiệm đo kích thước khối u (cm3) đư ợc xác định theo công thức (1) từ ngày thứ sau cấ y ghép u ngày b đầu thử nghiệm 60 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học CPSH Từ kết đo, xác định đươ ̣c kích thư ớc trung bình khối u lô chuột thí nghiệm Bảng 3.4: Theo dõi kích thƣớc khối u trình thử nghiệm Ngày Ngày Ngày Ngày 11 Ngày 13 Ngày 16 Ngày 19 Ngày 21 Ngày 23 Ngày 26 (lần 1) (lần 2) (lần 3) (lần 4) (lần 5) (lần 6) (lần 7) (lần 8) (lần 9) ĐCUT 0.05±0.02 0.25±0.08 0.55±0.2 1.04±0.3 1.43±0.3 2.37±0.3 2.57±1.0 2.69±1.1 2.91±1.2 UT+6MP 0.05±0.02 0.19±0.1 0.26±0.2 0.28±0.2 0.39±0.2 0.38±0.2 0.39±0.2 0.46±0.2 0.44±0.2 UT+CPSH 0.06±0.01 0.17±0.1 0.37±0.2 0.62±0.4 0.92±0.4 1.22±0.9 1.276±0.6 1.29±0.7 1.37±0.9 Lô Qua bảng 3.4 hình 3.30, kích thước khối u cấy ghép da lô chuột đối chứng ung thư tăng qua lần đo không điều trị với thuốc Đến lần đo thứ (cuối cùng), kích thước khối u tăng trung bình khoảng 58,2 lần (từ 0,05 đến 29,1 cm3) Kích thước khối u lô UT+6MP, điều trị với thuốc đối chứng 6MP nên kích thước khối u tăng chậm so với hai lô lại Sau 26 ngày, kích thước khối u tăng 8,8 lần (từ 0,05 đến 0,44 cm3), chí giảm nhẹ ngày điều trị cuối Điều lần khẳng định hiệu điều trị kháng u 6MP lựa chọn 6MP làm đối chứng dương xác Kích thƣớc u lô thí nghiệm 4.5 Kích thước (V m3) 3.5 2.5 ĐCUT UT+6MP UT+CPSH 1.5 0.5 Lần đo Hình 3.30: Đồ thị tăng trƣởng kích thƣớc trung bình u rắn lô thí nghiệm Đồ thị hình 3.28 cho thấy CPSH có khả kháng u tốt Kích thước khối u tăng 22,8 lần (từ 0,06 đến 1,37 cm3) So với kích thước khối u lô ĐCUT, 61 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học CPSH kìm hãm phát triển khối u xấp xỉ 53%, hiệu kháng u 38,6% thuốc 6MP Dựa kết đánh giá mức độ phát triển khối u tác dụng chế phẩm Khả ức chế phát triển khối u CPSH thông qua tỷ số ức chế IR% tỷ số phát triển GR% Từ hai tỷ số dựa vào thang đánh giá hiệu lực kháng u H Itokawa (Bảng 2.9) để xác định hiệu lực kháng Kết thu tiêu nghiên cứu tổng hợp bảng 3.5 Bảng 3.5: Tổng hợp kết khảo sát tác dụng kháng u CPSH chuột mang u rắn Sar.180 TT Các tiêu theo dõi ĐCUT UT+CPSH UT+6MP Số lượng chuột thí nghiệm 10 10 10 Số lượng chuột kết thúc thí nghiệm 10 10 Tỷ lệ tạo u (%) 100 100 100 Tỷ lệ không tạo u (%) 0 Kính thước trung bình u(mm) 2.900 1,370 0.440 GR (theo Kích thước trung bình u) 100 47.35 15.26 IR (theo Kích thước trung bình u) 52.65 84.74 Hiệu lực kháng u (theo Itokawa) + ++ Như vậy, dựa vào thang đánh giá hiệu lực kháng u H Itokawa, kết thu hiệu kháng u sau: - Đối với CPSH (UT+CPSH) tỷ số ức chế IR% tương ứng 52.65%, đạt hiệu lực kháng u (+) - Đối với thuốc chứng dương 6MP tỷ số 84.74%, đạt hiệu lực kháng u (++) Kết ảnh hưởng chế phẩm lên số số huyết học máu ngoại vi chuột nghiên cứu Các lô thí nghiệm sau thử nghiệm thuố c và CPSH cách đưa thuốc qua thực quản (per.os), lô đối chứng: đối chứng sinh học đối chứng ung thư sau đợt thử nghiệm các cá thể chuô ̣t đư ợc mổ, lấy máu ngoại vi đem phân tích 20 thông số máy phân tích sinh hóa máu tự động Swelab Alpha , Thụy Điể n t ại Học viện Quân Y 103 Kết bảng 3.6 62 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Bảng 3.6: Các số huyết học chuột lô thí nghiệm đối chứng STT Chỉ số huyết học ĐCSH ĐCUT UT+6MP UT+CPSH 3.10 Bạch cầu(3,0-14,2) 5.40 11.72 Hồ ng cầ u (5,0-9,5) 7.77 7.58 2.18 7.40 Hemoglobin 12.58 12.16 3.80 12.16 Hồng cầu máu (%) 38.46 37.24 10.62 36.60 0.40 0.35 0.66 0.39 Thể tić h khố i tiể u cầ u Tế bào Lympho (3,22-11,2) 4.70 9.16 2.90 8.28 Bạch cầu hạt 0.14 0.54 22.83 0.05 1.03 Qua bảng số liệu (Bảng 3.6) thấy số huyết học hồng cầu, lượng bạch cầu loại lô ĐCSH nằm mức bình thường [6] Chuột lô ĐCUT có nhiều số tăng so với ĐCSH nằm giới hạn sinh lý bình thườngchứng tỏ ổn định tình trạng sức khỏe chuột thí nghiệm Chuột lô thử nghiệm thuốc có nhiều thay đổi số huyết học Lô UT+6MP có thay đổi hồng cầu, tiểu cầu loại bạch cầu chúng có xu hướng giảm, chất có tính độc có mặt thể chuột Điều thể 6MP gây nhiều tác dụng phụ chuột khiến chuột ăn chết sớm bình thường (mặc dù hiệu kháng u tốt).Ngoài ra, thuốc 6MP ảnh hưởng xấu đến số quan sinh miễn dịch tuyến ức nên lượng bạch cầu lympho giảm đáng kể Lô chuột UT+CPSH có số bạch cầu tăng số hồng cầu giữ mức sinh lý bình thường.CPSH làm kích thích hệ thống miễn dịch, tăng khả đáp ứng thể, qua kìm hãm khối u phát triển.Nhưng kết cần xác định xác kích thích miễn dịch CPSH hay yếu tố ngoại lai hay tổn thương khác Do giữ số huyết học cân so với 6MP nên chuột lô UT+CPSH có sức sống tốt lô UT+6MP Điều phù hợp với ghi nhận từ thí nghiệm chuột CPSH không gây biểu bất thường chuột thí nghiệm.Nhóm nghiên cứu Zhang Y, Yi Y cho biết chất colochiroside A có khả ức chế mạnh Sarcoma 180 mặt miễn dịch, chất không tác động đáng kể đến phát triển tuyến ức [20] nên tác động lên hệ thống miễn dịch CPSH lô chuột thí nghiệm vai trò chất colochiroside A Như vậy, CPSH thể tính kháng u không mạnh đối chứng 6MP không gây ảnh hưởng nhiều lên số huyết học máu ngoại vi chuột thí nghiệm 63 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học KẾT LUẬN Từ kết thu thí nghiệm trên, rút kết luận sau: Phân lập hai hợp chất tritecpen saponin colochiroside A philinopside A từ loài hải sâm Cercodemas anceps thu thập vùng biển Đông Bắc Việt Nam Hợp chất philinopside A lần công bố từ loài hải sâm C anceps Hợp chất colochiroside A philinopside A thể hoạt tính diệt tế bào ung thư dòng tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma 180 với giá trị IC50 tương ứng 12,59 30,20 µg/ml.Hoạt tính diệt bào ung thư dòng MCF7 có giá trị IC50 6,97 7,93 µg/ml Hai hợp chất chưa ảnh hưởng đến dòng tế bào ung thư HCT116 dải nồng độ khảo sát Chế phẩm sinh họccó khả ứng chế dòng tế bào Sarcoma180 MCF7 với IC50 5,26 6,46 µg/ml; có hoạt tính gây chết tế bào ung thư Sarcoma 180 MCF7 từ nồng độ 10 µg/ml; có tác dụng ức chế tăng trưởng khối u rắn in vivo, giảm 52,65% kích thước u, đạt hiệu lực kháng u (+) cộng so với thuốc điều trị ung thư đối chứng 6MP đạt hiệu lực kháng u (++) KIẾN NGHỊ Thử tác dụng hợp chất nhiều dòng tế bào ung thư để đánh giá độ đặc hiệu chất dòng ung thư Nghiên cứu đường tín hiệu gây chết theo chương trình hợp chất Phối hợp loại saponin vốn có khả diệt tế bào ung thư với hợp chất phân lập để tăng hiệu kháng u thực nghiệm 64 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Như Hiền, Trịnh Xuân Hậu (2006), "Tế bào học" Nhà xuất Đạihọc Quốc Gia Hà Nội Phùng Phướng, Nguyễn Văn Cầu, Nguyễn Trần Thúc Huân (2005), "Ung thưhọc đại cương" Đại học Y Dược Huế Lê Đình Sáng (2010), "Bệnh học ung thư" Đại học Y Khoa Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Freshney RI (2005), Culture of specific cell types, Wiley Online Library, Teicher BA, Andrews PA (2004), Anticancer drug development guide, Springer Science & Business Media, Freshney RI Culture of animal cells, a manual of basic technique, John Wiley and Sons, inc, Abou-Ghali M, Stiban J (2015), "Regulation of ceramide channel formation and disassembly: Insights on the initiation of apoptosis".Saudi journal of biological sciences, 22 (6), p 760-772 Drozdova OA, Avilov SA, Kalinin VI, Kalinovsky AI, Stonik VA, Riguera R, Jiménez C (1997), "Cytotoxic Triterpene Glycosides from Far‐ Eastern Sea Cucumbers Belonging to the Genus Cucumaria".Liebigs Annalen, 1997 (11), p 2351-2356 Dzieciolowska EW (2009), "Selected peripheral blood cell parameters in twelve inbred strains of laboratory mice".Animal Science Papers and Reports, 27 (p 69-77 Hanahan D, Weinberg RA (2011), "Hallmarks of cancer: the next generation".cell, 144 (5), p 646-674 Kalinin VI, Silchenko AS, Avilov SA, Stonik VA, Smirnov AV (2005), "Sea cucumbers triterpene glycosides, the recent progress in structural elucidation and chemotaxonomy".Phytochemistry Reviews, (2-3), p 221-236 65 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Kennedy BK (2014), "Similarities and differences between mice and humans revealed".Pann State, p 10 Lee M-S, Chan JY-W, Kong S-K, Yu B, Eng-Choon VO, Nai-Ching HW, Mak Chung-Wai T, Fung K-P (2005), "Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer cells and in xenograft".Cancer biology & therapy, (11), p 1248-1254 11 Man S, Gao W, Zhang Y, Huang L, Liu C (2010), "Chemical study and medical application of saponins as anti-cancer agents".Fitoterapia, 81 (7), p 703714 12 Mariño G, Kroemer G (2013), "Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure".Cell research, 23 (11), p 1247-1248 13 Rao A, Sung M (1995), "Saponins as anticarcinogens".The Journal of nutrition, 125 (3 Suppl), p 717S-724S 14 Sharpless NE, DePinho RA (2006), "The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development".Nature reviews Drug discovery, (9), p 741-754 15 Silchenko AS, Kalinovsky AI, Avilov SA, Andryjashchenko PV, Dmitrenok PS, Kalinin VI, Stonik VA (2012), "3β-O-Glycosylated 16β-acetoxy-9β-H-lanosta7, 24-diene-3β, 18, 20β-triol, an intermediate metabolite from the sea cucumber Eupentacta fraudatrix and its biosynthetic significance".Biochemical Systematics and Ecology, 44 (p 53-60 16 Sparg S, Light M, Van Staden J (2004), "Biological activities and distribution of plant saponins".Journal of ethnopharmacology, 94 (2), p 219-243 17 Tong Y, Zhang X, Tian F, Yi Y, Xu Q, Li L, Tong L, Lin L, Ding J (2005), "Philinopside a, a novel marine‐ derived compound possessing dual anti‐ angiogenic and anti‐ tumor effects".International journal of cancer, 114 (6), p 843-853 18 Yi YH, Xu QZ, Li L, Zhang SL, Wu HM, Ding J, Tong YG, Tan WF, Li MH, Tian F (2006), "Philinopsides A and B, two new sulfated triterpene glycosides 66 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học from the sea cucumber Pentacta quadrangularis".Helvetica chimica acta, 89 (1), p 54-63 19 ZHANG Y-j, YI Y-h "Antitumor activities in vitro of the triterpene glycoside Colochiroside A from sea cucumber Colochirus anceps" p 20 Zhang Y, Yi Y (2011), "[Studies on antitumor activities of triterpene glycoside colochiroside A from sea cucumber Colochirus anceps]".Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi= China journal of Chinese materia medica, 36 (4), p 504-507 21 Zhang Y J LXJ, Yi Y H (2005), "A new triterpene glycoside from the seacucumber Colochirous anceps".Chinese Journal of Marine Drugs, 24(2) (p 1317 22 Phùng Phướng NVC, Nguyễn Trần Thúc Huân (2005), "Ung thư học đại cương".Đại học Y Dược Huế, p 23 Sáng LĐ (2010), "Bệnh học ung thư".Đại học Y Khoa Hà Nội., p 24 Diwan FH(1) A-HI, Mohammed ST (2000 Mar-May), "Effect of saponin on mortality and histopathological changes in mice".East Mediterr Health J, 6(23):345-51 (p 25 Voigt W (2005), Sulforhodamine B assay and chemosensitivity, Springer, 26 Adams J, Cory S (2007), "The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy".Oncogene, 26 (9), p 1324-1337 27 Bhowmick NA, Neilson EG, Moses HL (2004), "Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression".Nature, 432 (7015), p 332-337 28 Cheng N, Chytil A, Shyr Y, Joly A, Moses HL (2008), "Transforming growth factor-β signaling–deficient fibroblasts enhance hepatocyte growth factor signaling in mammary carcinoma cells to promote scattering and invasion".Molecular Cancer Research, (10), p 1521-1533 29 Grivennikov SI, Greten FR, Karin M (2010), "Immunity, inflammation, and cancer".Cell, 140 (6), p 883-899 67 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học 30 Lowe SW, Cepero E, Evan G (2004), "Intrinsic tumour suppression".Nature, 432 (7015), p 307-315 68 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm ... kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps với mục đích: Phân lập xác định cấu trúc từ đến hợp chất saponin từ loài hải sâm Cercodemas anceps Đánh giá hoạt tính diệt tế bào ung thư chất phân. .. kích thư c khác nhau .Tế bào nuôi cấy dòng tế bào phân lập dòng tế bào thư ng mại ngân hàng tế bào Trong mô hình này, tế bào nuôi hai dạng: bám dính trôi Một số dòng tế bào ung thư tế bào ung thư. .. NHIÊN NGUYỄN KHẮC SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ TỪ HẢI SÂM CERCODEMAS ANCEPS Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.0114 CÁN BỘ HƯỚNG