VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS VIÊM GAN B TS Bạch Khánh Hoà Huế, 06-2006 Đặt vấn đề  Nhiễm virus viêm gan B: vấn đề mang tính toàn cầu • Việt Nam: vùng lưu hành dịch cao  Sự xuất đột biến hệ gen virus gây khó khăn cho việc chẩn đoán, dự phòng lây nhiễm & điều trị • Các đột biến vùng gen S gây biến đổi kháng nguyên bề mặt 2/29 Virus viêm gan B (HBV) • Thuộc họ Hepadnaviridae • Gây bệnh viêm gan B : o o Cấp tính Mạn tính (xơ gan, viêm gan, ung thư gan) • Con đường lây truyền: o o o Từ mẹ sang Tiêm chích Tình dục 3/29 HBsAg Pre-S1 Pre-S2 ADN HBcAg Hình Mô hình cấu trúc HBV 4/29 Hình Cấu trúc hệ gen virus viêm gan B 5/29 Vị trí vùng định kháng nguyên a: từ aa 110-160 Loop1 142 145 137 12 139 Loop2 147 Hình Mô hình định kháng nguyên “a” HBsAg 6/29 Các kỹ thuật phát virus viêm gan B • • • • Thử nghiệm miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA) Thử nghiệm miễn dịch gắn men (ELISA) Phản ứng khuếch đại trình tự gen (PCR) Phản ứng phát axit nucleic (NAT) 7/29 Các dạng đột biến virus viêm gan B • • • • Đột biến vùng gen S Đột biến gen lõi (precore, core) Đột biến gen polymerase Đột biến gen X 8/29 Mục đích nghiên cứu • • Tìm hiểu tần suất đột biến kháng nguyên bề mặt nhóm đối tượng mang HBsAg chưa qua điều trị Khảo sát số dạng đột biến hay gặp vùng gen S virus viêm gan B 9/29 Đối tượng phương pháp nghiên cứu (1) • Đối tượng: o o 75 bệnh nhân định theo dõi viêm gan B (1 - 12/2005) Viện Huyết học - Truyền máu TW Độ tuổi: 18-43 10/29 Điện di ADN gel agarose Tách ADN từ gel agarose Định lượng đánh giá độ tinh ADN Giải trình tự gen S Phân tích kết 15/29 Kết bàn luận (1)  Sàng lọc huyết học Trong tổng số 75 bệnh nhân tiến hành xét nghiệm hai kít, nhận thấy có 09 trường hợp (12%) có tỷ số OD mẫu/ngưỡng (S/CO) chênh lệch lớn Những mẫu nhiều khả chứa đột biến HBsAg, lựa chọn để tiếp tục tiến hành phản ứng PCR 16/29 Bảng Danh sách mẫu có tỷ số S/CO chênh lệch lớn tiến hành xét nghiệm hai kit STT Mẫu S/CO (plus) S/CO (utral) G7 0,12 17,42 G12 1,79 8,30 G27 34,43 48,21 G28 50,69 66,93 G41 50,50 68,50 G79 41,76 48,29 G88 49,85 68,05 G124 50,35 68,45 G130 8,20 34,48 17/29 Kết bàn luận (2)  Phản ứng PCR – Trong số mẫu tiến hành tách chiết ADN, khuếch đại phản ứng PCR có mẫu phát sản phẩm khuếch đại điện di gel agarose 1,5% – 01 mẫu không phát thấy sản phẩm điện di 18/29 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% 19/29 Kết bàn luận (3)  Giải trình tự nucleotide axit amin tương ứng - 08 mẫu băng sản phẩm PCR sử dụng tiếp cho việc giải trình tự nucleotide Trình tự thu xử lý phần mềm chuyên dụng để xác định trình tự axit amin tương ứng - Trình tự axit amin mẫu so sánh với trình tự axit amin chuẩn (bình thường) AB031266 nhằm tìm đột biến có 20/29 Hình Phần mềm giải trình tự nucleotide vùng gen S virus viêm gan B 21/29 So sánh trình tự axit amin mẫu HBV với mẫu chuẩn AB031266 Mẫu 108 118 AB03126 PLIPGSSTT S - - - - - - - - -G - - - - - - - - - - - - - - - -D-E T- - - - - - - - - - - -L- -T - - -R - I - - - - - - TGPCRTCTTP AQGTSMFPSC CCTKPTDGNC -F -A- - - - - - - - - - - - -A - - - - - - - - - - R- - - - - K - -P - S- - - - - - - - - - - - K - - - R - G12 G27 G28 G41 G79 G88 G124 G130 128 138 22/29 Mẫu 148 AB031266  TCIPIPSSWA - G12 G27 G28 G41 G79 G88 G124 G130   158 FAKYLWEWAS - -TF - - - - - F - - - -C - - - -F -TF - - - - - - 168 178 VRFSWLSLV -F- - - - - I- - -  PF - 23/29 Bảng Các đột biến phát sau giải trình tự Mẫu Đột biến sai nghĩa Đột biến im lặng Tổng số đột biến G12 G27 G28 1 G41 1 G79 6 12 G88 2 G124 G130 Tổng số 26 15 41 24/29 Kết bàn luận (4) Tần số phân bố ĐB điểm gen S: • • Trong số mẫu xác định 41 ĐB (26 ĐB sai nghĩa + 15 ĐB im lặng) 27 vị trí, trung bình: ĐB/mẫu Mỗi mẫu có đột biến sai nghĩa 25/29 Kết bàn luận (5) • Tần suất đột biến HBsAg nghiên cứu 10,7%, thấp kết TTT.Huy cs (2003), LTT.Thuy & cs (2005), do: o o Chưa giải trình tự nucleotide cho tất mẫu Đối tượng nghiên cứu không thuộc nhóm có áp lực miễn dịch cao 26/29 Kết bàn luận (6) • • Dạng đột biến: 100% đột biến thay nucleotide dẫn đến thay axit amin tương ứng Vị trí đột biến: tổng số 26 đột biến có đột biến xảy loop 1, đột biến loop 2, lại 22 đột biến nằm vùng thuộc loop – loop 27/29 Kết luận 1- Tần suất đột biến vùng gen S bệnh nhân mang HBsAg dương tính chưa qua điều trị 10.7% 2- Dạng đột biến phổ biến đột biến thay nucleotide dẫn đến thay axit amin tương ứng 28/29 - Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Huyết học Truyền máu TW, Labo trung tâm Y sinh - Đại học Y Hà Nội, công ty BioRad cán bộ, bệnh nhân giúp đỡ tiến hành nghiên cứu này; - Xin cảm ơn theo dõi quý vị đại biểu! 29/29