Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐÀO THỊ HỒNG BÍCH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG THÀNH PHẦN TANSHINON IIA TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge) PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa : QH.2012.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 LỜI CẢM ƠN Trước hết, cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Hữu Tùng – giảng viên mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa toàn thể thầy cô giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung thầy cơ, cán thuộc Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc nói riêng dạy dỗ, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian năm học tập Khoa thực khóa luận tốt nghiệp Và em muốn cảm ơn tài trợ Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-YS.05-2015.05 để em tham gia thực nghiên cứu Và cuối lời cảm ơn em gửi tới gia đình tập thể lớp Dược K57QH.2012.Y, đặc biệt bạn nhóm nghiên cứu gồm Ngần, Huệ, Hào động viên, cộng tác giúp đỡ em suốt thời gian thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 23 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Bích Đào Thị Hồng Bích Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BuOH Butanol CC Sắc ký cột DAD Đầu dò UV (Diode array detector) EtOAc Etyl acetat HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance Liquid Chromatography) Hex Hexan IUPAC Tên hợp chất (International Union of Pure and Atrie Chemistry) LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp MS Phổ khối 10 Mp Nhiệt độ nóng chảy 11 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( Nuclear Magnetic Resonance) 12 PL Phụ lục 13 Rf Hệ số lưu giữ 14 RSD Độ lệch chuẩn tương đối 15 SKC Sắc ký cột 16 TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) 17 UV-VIS Phổ hấp thụ phân tử 18 UV Tia tử ngoại 19 Φ Đường kính cột 20  Hệ số chọn lọc 21 13 C-NMR Footer Page of 116 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13 Header Page of 116 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM 1.1.1 Đặc điểm thực vật .2 1.1.2 Phân bố, sinh thái .2 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng sinh học .5 1.1.5 Tác dụng công dụng theo y học cổ truyền .6 1.2.TỔNG QUAN VỀ TANSHINON IIA 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Đặc điểm tanshinon IIA .7 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG NGHIÊN CỨU 1.3.1 Phương pháp sắc kí cột .8 1.3.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 10 1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 13 1.3.5 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 14 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 16 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 16 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 16 2.1.3 Thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu .17 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Phương pháp chiết xuất tinh chế tanshinon IIA từ đan sâm 17 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc tanshinon IIA 17 2.2.3 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết phân tích tạp chất .17 2.2.4 Phương pháp phân tích định lượng HPLC 17 2.2.5 Phương pháp phân tích định tính, định lượng mẫu dược liệu đan sâm 19 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM 20 3.1.1 Phương pháp xử lý chiết mẫu 20 3.1.2 Phương pháp phân lập tinh chế 20 Footer Page of 116 Header Page of 116 3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC TANSHINON IIA 22 3.2.1 Tính chất vật lý 22 3.2.2 Các phương pháp phổ: phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân .22 3.2.3 Xác định cấu trúc 24 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘ TINH KHIẾT VÀ PHÂN TÍCH TẠP CHẤT… ……… 24 3.3.1 Sắc ký lớp mỏng .24 3.3.2 Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC .25 3.4 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG HPLC 25 3.4.1 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 25 3.4.2 Tính thích hợp hệ thống .26 3.4.3 Độ tuyến tính 27 3.4.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .27 3.4.5 Độ xác .28 3.4.6 Độ đặc hiệu .29 3.5 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM……29 3.6 BÀN LUẬN .30 3.6.1 Về phân lập xác định cấu trúc tanshinon IIA 30 3.6.2 Về phân tích HPLC 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 3.1 Kết phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 23 Bảng 3.2 Kết phân tích độ tinh khiết tanshinon tinh chế 25 Bảng 3.3 Chương trình gradient 45 phút 26 Bảng 3.4 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 26 Bảng 3.5 Kết khảo sát khoảng tuyến tính tanshinon IIA 27 Bảng 3.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) tanshinon IIA 28 Bảng 3.7 Kết phân tích độ lặp lại phương pháp 28 Bảng 3.8 Kết phân tích độ phương pháp 29 Bảng 3.9 Kết phân tích định lượng tanshinon IIA đan sâm thu hái Sapa 30 Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình vẽ Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Cây đan sâm Hình 1.2 Cấu trúc số abietane diterpenoid Hình 1.3 Cấu trúc số acid phenolic Hình 1.4 Cấu trúc số triterpenoid có đan sâm Hình 1.5 Cấu trúc hóa học tanshinon IIA Hình 1.6 Sắc ký đồ thơng số đặc trưng 10 Hình 2.1 Một số hình ảnh đan sâm huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai 16 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất phân lập hợp chất A 21 Hình 3.1 Phổ 13CNMR(CDCl3,100MHz) chất tanshinon IIA 22,23 Hình 3.2 Cấu trúc tanshinon IIA 24 Hình 3.3 Sắc ký lớp mỏng khảo sát tanshinon IIA tinh chế 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ tanshinon IIA (A) mẫu trắng (B) 25 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn tanshinon IIA 27 Hình 3.6 Sắc ký đồ cao chiết mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái Sapa 30 Footer Page of 116 Header Page of 116 ĐẶT VẤN ĐỀ Ðan sâm có tên khoa học Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae) thuốc quý dùng nhiều Đông y thuốc bổ máu điều trị bệnh tim mạch [21-23] Gần tác dụng chống ung thư đan sâm, đặc biệt thành phần tanshinon phát thu hút quan tâm nghiên cứu giới [21-23] Ở nước ta, nghiên cứu đan sâm quan tâm để phát triển ứng dụng loại dược liệu quý y học đại Nghiên cứu Viện Dược liệu cho thấy đan sâm trồng Sapa có hàm lượng tanshinon IIA cao bên cạnh số thành phần tanshinon khác [15,21] Gần đây, tác giả Nguyễn Thanh Hải cộng công bố phân lập thêm số thành phần tanshinon [23] hai hợp chất triterpen acid ursoli acid 2β-hydroxypomolic [23] Các kết nghiên cứu ban đầu tác dụng sinh học dược lý cho thấy dịch chiết đan sâm có tác dụng chống đông máu, kết tập tiểu cầu [22]; hợp chất tanshinon IIA có tác dụng ức chế phát triển nhiều dòng tế bào ung thư phổi PC9 [21] Theo tài liệu công bố, tanshinon IIA thành phần hoạt chất sử dụng làm chất đánh dấu để đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm qui định Dược điển Trung Quốc Ở nước ta, tanshinon IIA phân lập [21] chưa có nghiên cứu xa để định hướng xây dựng chất chuẩn đối chiếu cho hợp chất để phục vụ công tác đánh giá dược liệu đan sâm sản phẩm chứa đan sâm ngày có nhiều thị trường Theo hướng nghiên cứu này, thực đề tài ―Nghiên cứu phân lập định lƣợng thành phần tanshinon IIA từ đan sâm phục vụ công tác kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu đan sâm” với mục tiêu sau: Phân lập xác định hợp chất tanshinon IIA từ đan sâm Phân tích sắc ký lỏng hiệu cao HPLC tanshinon IIA đan sâm khảo sát tiêu chí làm chất chuẩn đối chiếu Footer Page of 116 Header Page of 116 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đan sâm Cây đan sâm có tên khoa học Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc chi Salvia, họ Bạc hà (Lamiaceae) Hình 1.1 Cây đan sâm 1.1.1 Đặc điểm thực vật Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) cịn gọi huyết sâm, xích sâm, huyết cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, tồn thân mang lơng ngắn màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu Thân vng có gân dọc Lá kép, mọc đối: 3-5 chét, đặc biệt có Lá chét mọc thường lớn Lá kép có cuống dài, cuống chét ngắn có dìa Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm Mép chét có cưa tù Mặt chét màu xanh, có lơng mềm màu trắng, mặt màu xanh tro, có lơng dài Gân mặt dưới, chia phiến thành nhiều múi nhỏ Cụm hoa mọc thành chùm đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm Hoa mọc vòng, vịng 3-10 hoa, thường hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, mơi, mơi trơng nghiêng hình lưỡi liềm, mơi xẻ thùy, thùy có cưa trịn Hai nhị mơi dưới, bầu có vịi dài lịi mơi Quả nhỏ, dài mm, rộng 1,5 mm [1,14] 1.1.2 Phân bố, sinh thái S miltiorrhiza phân bố rộng rãi miền Bắc Trung Quốc Nó có mặt Nhật Bản [31] Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc [1] thích hợp với đất cát ẩm, trồng rễ vào mùa xuân [6] Cây trồng trại thuốc Sa Pa (Viện Dược liệu) tỏ thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, hoa hàng năm, hạt giống thu gieo gieo lại nhiều năm Một số đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng [1] Cây trồng tốt vào tháng 2-3 để đến tháng Footer Page of 116 Header Page 10 of 116 11-12 thu hoạch [1] Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa tháng 6-9 [14] Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6] 1.1.3 Thành phần hóa học Cho đến có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học đan sâm Thành phần hóa học acid phenolic, diterpenoid, flavonoid số thành phần khác Bộ phận mặt đất có chứa flavonoid, triterpenoid monoterpenoid đặc biệt hoa Trong đó, diterpenoid acid phenolic lại tìm thấy chủ yếu rễ [28] a Diterpenoid Nhóm diterpenoid bao gồm nhiều chất có cấu trúc khác phân thành phân nhóm abietane diterpenoid, clerodane diterpenoid, pimarane diterpenoid labdane diterpenoid Chủ yếu abietane diterpenoid rễ, clerodane diterpenoid labdane diterpenoid [31] Thành phần nhóm abietane diterpenoid tanshinon tanshinon I, II III, sau đến isotanshinon I II, isocryptotanshinon cryptotanshinon [31] (hình 1.2) 19 R = R1 = H, Δ5(10),6(7),15(16) 20 R = R1 = H, Δ5(10),6(7) 22 23 Δ15(16) 24 15(16) 21 R = R1 = OH, Δ 25 R = R1 = H, Δ5(10),6(7) 19-21.Tanshinon I, II, III 24 Isocryptotanshinon 22-23 Isotanshinon I, II 25 Cryptotanshinon Hình 1.2 Cấu trúc số abietane diterpenoid b Các dẫn xuất acid phenolic Các acid phenolic thành phần nhóm chất tan nước đan sâm Thành phần nhóm acid rosmarinic acid salvianolic từ A - K [35] Footer Page 10 of 116 ... giá dược liệu đan sâm sản phẩm chứa đan sâm ngày có nhiều thị trường Theo hướng nghiên cứu này, thực đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập định lƣợng thành phần tanshinon IIA từ đan sâm phục vụ công tác kiểm. .. kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu đan sâm? ?? với mục tiêu sau: Phân lập xác định hợp chất tanshinon IIA từ đan sâm Phân tích sắc ký lỏng hiệu cao HPLC tanshinon IIA đan sâm khảo sát tiêu chí làm chất. .. lượng dược liệu đan sâm qui định Dược điển Trung Quốc Ở nước ta, tanshinon IIA phân lập [21] chưa có nghiên cứu xa để định hướng xây dựng chất chuẩn đối chiếu cho hợp chất để phục vụ công tác đánh