BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẠO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC BÀI TẬP MÔN HỌC ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ NHANH SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: Hóa Công nghệ - Môi trường Người hướng dẫn khoa học : Cô Phạm Thanh Nga Sinh viên : Phạm Đăng Tuyên Lớp : K63B Hà Nội - 2016 Mục lục Trang Nghiên cứu phương pháp đánh giá nhanh sinh trưởng vi tảo điều kiện phòng thí nghiệm Trong trình nuôi cấy, nghiên cứu vi sinh vật, việc đánh giá sinh trưởng VSV công đoạn cần thiết Có nhiều phương pháp giúp ghi nhận thông số trình sinh trưởng VSV, với nguyên tắc chung dựa vào biến đổi số lượng, chất lượng VSV điều kiện nuôi cấy Với yêu cầu cụ thể đánh giá nhanh sinh trưởng VSV, phòng thí nghiệm thường sử dụng số phương pháp như: đếm trực tiếp buồng đếm (đếm tế bào), đo độ đục (mật độ quang – OD), đo sinh khối tế bào, đo gián tiếp nồng độ số chất môi trường nuôi cấy, …v.v Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng, phù hợp với điều kiện, trường hợp cụ thể I Chuẩn bị mẫu: Trước tiến hành phương pháp định lượng VSV thông thường phải thực việc chuẩn bị mẫu: gồm thao tác lấy mẫu pha loãng mẫu: Lấy mẫu: Việc lấy mẫu có số yêu cầu khối lượng số lượng để đảm bảo phù hợp với mục đích: − Lấy mẫu có tính chất đại diện − Lấy mẫu với lượng vừa phải, đủ để thực phân tích đặc tính lý hóa sinh − Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng − Lấy mẫu xong cần phân tích ngay, nhiệt độ thường không để 30’, hạ nhiệt độ xuống 0-5oC để lâu không để 24h − Mẫu phải có nhãn ghi vào sổ đặc điểm mẫu nơi thu mẫu Trên nhãn cần ghi thông tin sau: • Mã số mẫu • Loại mục đích lấy mẫu • Tên chức người lấy mẫu • Yêu câu phân tích Pha loãng mẫu: Chuẩn bị số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng số ống hút (1ml) vô trùng − Mẫu trạng thái lỏng : Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:   − − Dùng pipet lấy 1ml dung dịch từ ống nuôi cấy gốc ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất, ta dung dịch có nồng độ 10 -1 dung dịch gốc (hay dung dịch có độ pha loãng 101 hệ số pha loãng 10-1) Dùng pipet lấy 1ml dung dịch có độ pha loãng 10 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất ta dung dịch có độ pha loãng 10 (hoặc hệ số pha loãng 10-2) Tiếp tục ta dung dịch có độ pha loãng cao Nếu mẫu nghiên cứu trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm) Chuẩn bị bình hình nón có dung tích 250 ml + Bình chứa 90ml nước cất vô trùng + Bình vô trùng không chứa − − − − Khử trùng cối chày sứ cách cho cồn vào đốt lên Sau để nguội Cân g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ nghiền nát mẫu Dùng toàn nước bình để chuyển toàn mẫu sang bình Lắc phút, để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng mẫu mẫu trạng thái lỏng − Tuỳ theo ước đoán số lượng vi sinh vật mẫu mà pha loãng nhiều hay Sau có mẫu, bắt đầu tiến hành phương pháp phân tích lí hóa sinh II a − − − b ∗ − Phương pháp định lượng vi sinh vật: Phương pháp đếm trực tiếp: Nguyên tắc: Sử dụng kính hiển vi quan sát mẫu VSV buồng đếm, đếm trực tiếp số lượng tế bào vi khuẩn thể tích phòng đếm, kết hợp với độ pha loãng để tính toán mật độ tế bào dung dịch ban đầu Đối với tế bào động vật nguyên sinh ta dùng phòng đếm PetroffHausser, với tế bào sinh vật nhân nguyên thủy nhân chuẩn ta thường dùng phòng đếm Neubauer-Thomas (phòng đếm hồng cầu) để đếm Với tế bào sinh vật nhân sơ thường nhuộm màu sử dụng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phaseconstrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát Có thể đếm số lượng tế bào VSV theo phương pháp đếm trực tiếp lam phết kính (Breed) Nguyên tắc đếm trực tiếp số tế bào vi trường, lặp lại nhiều lần để có số tế bào trung bình, kết hợp với diện tích vi trường độ pha loãng để tính toán mật độ VSV mẫu gốc Ngoài sử dụng máy đếm điện tử Coulter Counter Nguyên lý hai bên lỗ nhỏ có điện cực nối điện Khi tế bào dịch huyền phù qua lỗ nhỏ thi tế bào qua điện trở lại tăng lên (hoặc tinh dẫn điện giảm xuống) sinh tin hiệu điện, máy đếm tự động ghi số Phương pháp tiến hành: Phương pháp đếm trực tiếp lam phết kính: Tiêu VSV nhuộm màu (nhuộm đơn) Phết kính: + Dùng lam bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ hình vuông S = 400 mm2, mặt lam Mục đích không cho vi sinh vật lan khỏi diện tích đếm + Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào hình vuông, mặt lam − + Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy đầu que dàn giọt mẫu xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông + Cố định tiêu bản, nhuộm đơn thuốc nhuộm blue methylen + Nhỏ giọt dầu soi, xem vật kính x100 Cách đếm: + Đếm số tế bào VSV đơn vị vi trường (VT) + Đếm hết tất 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính Sơ đồ di chuyển vật kính hình vuông phết kính để đếm số VSV/1VT − Công thức tính mật độ tế bào mẫu: Số tế bào/1ml mẫu = Trong đó: X số vi khuẩn đếm V S diện tích hình vuông phết kính (400mm2) S diện tích vi trường, πR2=0.0004mm2 => số lượng vi trường có S V thể tích giọt vi khuẩn phết kính H hệ số pha loãng mẫu ∗ − Phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm: Để quan sát vi tảo thông thường sử dụng buồng đếm hồng ngoại Cấu tạo buồng đếm: + Buồng đếm phiến kính trong, dày từ 2-3mm, hình chữ nhật + Giữa phiến kính phần lõm phẳng làm đĩa đếm, có kẻ hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ, xung quanh có rãnh nhỏ Đĩa đếm thấp bề mặt phiến kính khoảng 1/10mm, có hình tròn phủ lên kính độ sâu đĩa đếm đồng Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 Bên buồng đếm có ghi tên loại buồng đếm số thông số kĩ thuật đặc trưng: Cấu tạo buồng đếm − Cấu tạo khung đếm đĩa đếm: khung đếm thường có cấu tạo + Trường hợp 1: khung đếm có 16 ô lớn, ô lớn có 25 ô nhỏ Một khung có 400 ô nhỏ + Trường hợp 2: khung đếm có 25 ô lớn, ô lớn có 16 ô nhỏ Một khung có 400 ô nhỏ + Diện tích ô nhỏ 1/400mm2 Vậy thể tích ô nhỏ V= 0.1mm x 1/400mm2 = 1/4000mm3 Cấu tạo khung đếm − Cách tiến hành: + Trước tiến hành quan sát cần cho thêm vài giọt fomalin vào mẫu, trộn + Đặt lammen phủ lên khung đếm + Lắc mạnh dịch huyền phù pha loãng, sau dùng pipet hút dung dịch mẫu pha loãng, bỏ vài giọt đầu + Dùng đầu pipet đặt vào cạnh buồng đếm tiếp giáp lammen kính, dịch huyền phù vào buồng đếm nhờ chế mao dẫn Buồng đếm chuẩn bị có vùng không gian nằm kính buồng đếm phủ dịch huyền phù tế bào, rãnh chung quanh không bị dính ướt + Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn sang khoang Khi dịch khoang có độ dày 0.1mm + Đặt buồng đếm lên bàn kẹp kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm + Thao tác, điều chỉnh kính hiển vi, ban đầu dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ trước, sau sử dụng vật kính x40 để quan sát đếm Chú ý bắt đầu đếm sau nhỏ giọt dung dịch từ 3-5’ + Đếm số tế bào có ô lớn (4 ô cạnh ô giữa), đếm ô nhỏ ô lớn Trong tất ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn ô trước, sau đếm tế bào cạnh bên bên phải ô + Đếm tất 80 ô nhỏ ô lớn (TH1: ô lớn có 16 ô nhỏ) + Đếm tất 125 ô nhỏ ô lớn (TH2: ô lớn có 25 ô nhỏ) Thao tác thực đếm số tế bào − Công thức tính: Số tế bào/1ml mẫu = Trong đó: − a số tế bào trung bình có ô nhỏ V thể tích ô nhỏ (tính theo ml) H hệ số pha loãng Một số ý: + Nên tiến hành nhuộm màu tiêu (methylen blue) để dễ quan sát đếm xác + Nồng độ dịch huyền phù pha loãng thích hợp cho mật độ ô nhỏ không úa 10 tế bào + Sử dụng buồng đếm xong phải rửa buồng đếm lau khô + Để đạt độ xác cao, mật độ trung bình tế bào đếm ô nhỏ vào khoảng 2.5 < a < 10 c − − Ưu – nhược điểm: Ưu điểm: phương pháp đếm trực tiếp có ưu điểm nhanh chóng xác định nhanh chóng mật độ VSV mẫu, thao tác đơn giản Nhược điểm: + Không nhận biết tế bào VSV sống tế bào chết + Dễ nhầm lẫn tế bào VSV với dị thể mẫu + Độ xác mức tương đối + Không phù hợp với huyền phù VSV có mật độ thấp Phương pháp đo mật độ quang Nguyên tắc: Số lượng VSV có mẫu xác định gián tiếp thông qua phương pháp đo độ đục hay đo mật độ quang Nguyên tắc chung phương pháp tương quan nồng độ, hay mật độ tế bào VSV số lượng photon ánh sáng bị phân tán (thông thường với mẫu không đậm đặc mật độ VSV tỉ lệ thuận với số photon bị phân tán) Việc đo độ đục a 10 tiến hành theo cách là: đo quang phổ kế, dùng máy đếm điện tử sử dụng ống nghiệm có độ đục khác − Với việc đo quang phổ kế: + Sử dụng chùm sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa VSV cần đo Các tế bào VSV huyền phù làm phân tán bớt chùm tia sáng, tùy theo số lượng nhiều hay chúng mẫu Số tia sáng lại qua mẫu kích thích tế bào quang điện Cường độ chùm sáng qua làm dịch chuyển kim thước đo, cho ta biết phần trăm ánh sáng bị phân tán bảng thị Từ kết thu ta mang đối chiếu với bảng chuẩn kết hợp với độ pha loãng để biết mật độ VSV mẫu + + Lượng ánh sáng truyền qua mấu sinh khối tỉ lệ thuận với lượng tế bào tính theo công thức sau: T= Trong đó: Để có đơn vị đo thích hợp, người ta sử dụng đơn vị hấp thụ ánh sáng vật chất A (Absorance) thay cho đơn vị truyền ánh sáng T Ta có mối liên hệ: Độ hấp thụ tăng tỉ lệ thuận với mật độ tế bào Thuật ngữ độ hấp thụ (A) gọi mật độ quang (OD) Cách đo thứ sử dụng máy đếm điện tử, đo hàng ngàn tế bào vòng vài giây Nguyên tắc phép đo tế bào đưa + − 11 qua tia sáng máy điện tử, VSV cản tia sáng ghi dấu hiệu đếm máy − Cách thứ sử dụng ống nghiệm có độ đục khác (dãy ống nghiệm Macfaland) Một dãy ống nghiệm chứa BaSO4 có độ pha loãng khác tương ứng với độ pha loãng có bảng đối chiếu nồng độ vi khuẩn tương ứng Đối chiếu độ đục ống nghiệm chứa mẫu cần đo với dãy ống nghiệm Macfaland, sau đối chiếu với bảng ta biết nồng độ vi khuẩn tương ứng b Cách tiến hành: ∗ Phương pháp đo quang phổ kế: Tế bào VSV có chứa nhiều phân tử có khả hấp thụ ánh sáng bước sóng khác (AND từ 254-260nm; protein 280nm; xitocrom 400-500nm…) Khi đo độ đục tế bào người ta thường chọn bước sóng có độ hấp thụ nhỏ, hay dùng bước sóng 600-620nm Tùy vào đối tượng mang đo mà ta chọn bước sóng cho phù hợp Bên cạnh đó, ảnh hưởng thành phần bên tế bào khuếch tán hay hấp thụ ánh sáng mà phương pháp có tính đặc thù riêng với loại VSV Tiến hành đo: − Lấy ống nghiệm chứa mẫu VSV cần đo ống nghiệm vô trùng, tiến hành pha loãng theo dãy thập phân − Chuẩn bị máy quang phổ đo độ đục, sử dụng máy quang phổ đơn giản máy quang phổ UV-vis − Tiến hành đo độ đục mẫu pha loãng quang phổ kế 620nm, ứng với độ pha loãng mẫu thu giá trị OD Theo định luật Lambert độ hấp thụ tỉ lệ thuận với mật độ VSV khoảng giá trị từ 0.1-0.8 Nếu lớn 0.8 mật độ vật chất cao, VSV tạo bóng che khuất làm cho sai lệch kết − Song song với việc đo độ đục cần tiến hành nuôi cấy đếm số lượng tế bào độ pha loãng tương ứng môi trường thạch, từ thiết lập hàm tương quan độ hấp thụ số lượng tế bào sống Hàm có dạng bậc nhất: A = a + b Trong đó: 12 − ∗ − − − c − − Sau xây dựng hàm tương quan, lần đo ta cần đo giá trị mật độ quang (OD) sau dựa vào hàm tương quan để tính toán mật độ VSV mẫu Phương pháp dãy ống nghiệm có độ đục khác (dãy ống nghiệm Macfaland) Dùng 10 ống nghiệm sạch, trong, có kích thước Nhỏ vào ống lượng dung dịch BaCl2 theo thứ tự từ ống đến ống 10, ống nhỏ 0,1ml, ống nhỏ 0,2ml, đến ống 10 1ml Tiếp theo cho vào ống vừa đủ 10ml dung dịch H2SO4 hàn kín miệng ống Lấy ống nghiệm chứa mẫu cần đo cho vào máy li tâm, gạn rửa Cho nước cất vào tiếp tục li tâm, gạn rửa 2-3 lần Cuối cho nước cất vào lượng ngang với lượng dung dịch nuôi cấy Đặt ống nghiệm chứa VSV gạn rửa vào ống Macfaland chừng có màu tương tự Số lượng VSV có 1ml dung dịch nằm khoảng mức chuẩn ống Macfaland Ưu – nhược điểm: Ưu điểm: phương pháp đo mật độ quang cho kết nhanh chóng, dễ dàng, phương pháp đo với máy quang phổ thường ứng dụng để theo dõi, nghiên cứu sinh trưởng VSV PTN sản xuất Việc đo độ đục với máy quang phổ phân biệt tế bào sống tế bào chết Nhược điểm: + Phương pháp đo với máy quang phổ dễ bị sai số thao tác sai số máy đo 13 + Phương pháp dãy ống nghiệm Macfaland cho kết rơi vào khoảng, mật độ cụ thể + Cần lưu ý pha loãng mẫu để đo máy quang phổ cần pha cho OD rơi vào khoảng