HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA MÔI TRƯỜNG & - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP “NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN LAM MICROCYSTIS AERUGINOSA” Người thực : TRỊNH MINH SƠN Lớp : MTC Khóa : 57 Ngành : MÔI TRƯỜNG Giáo viên hướng dẫn : TS ĐINH THỊ HẢI VÂN TS DƯƠNG THỊ THỦY Hà Nội – 2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA MÔI TRƯỜNG & - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP “NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN LAM MICROCYSTIS AERUGINOSA” Người thực : TRỊNH MINH SƠN Lớp : MTC Khóa : 57 Ngành : MÔI TRƯỜNG Giáo viên hướng dẫn : TS ĐINH THỊ HẢI VÂN TS DƯƠNG THỊ THỦY Địađiểm thực tập : Phòng thủy sinh học - Viện CNMT Viện Hàn Lâm KHCN Việt Nam Hà Nội – 2016 2 MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt cs DNA DO Ecoli FE SEM LPS M.aeuginosa MCs PEG PST PVA PVP UV-vis Tên đầy đủ Cộng Deoxyribo nucleotide Dessoloved oxygen Escherichia Coli Field emission scanning electron microscopy Lypopoly saccharides Microcystis aeuginosa Microcystin Polyethylen Glycol Paralytic Shellfish Poisons Polyvinyl Alcohol Polyvinyl pyrrolidon Ultraviolet – visible spectroscopy DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việc gia tăng dân số, phát triển ngành công nghiệp, nông nghiệp làm gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu nitơ phốt pho) đáng kể vào thủy vực Ô nhiễm dinh dưỡng diễn ngày nghiêm trọng thuỷ vực sông, hồ, đầm nuôi trồng thuỷ sản,… kèm với tượng nở hoa nước mà thực chất phát triển mạnh mẽ quần xã thực vật chủ yếu vi khuẩn lam (VKL) Ở Việt Nam, ô nhiễm môi trường nước mà chủ yếu ô nhiễm chất hữu cơ, chất dinh dưỡng, kéo theo bùng nổ thực vật nổi, có tảo độc diễn phổ biến tác động hoạt động người lưu vực sông, hồ Tại hồ hồ Ba Bể, hồ Tây, hồ Hoàn Kiếm, hồ Thác Mơ, hồ chứa Dầu Tiếng, hồ chứa Cấm Sơn, hồ chứa Núi Cốc,… quan sát thấy diện vi khuẩn lam độc chủ yếu loài thuộc chi Microcystis Vì để ngăn ngừa, giảm thiểu tác động độc hại tảo lam độc độc tố tảo lam, số phương pháp kiểm soát tiến hành bao gồm kiểm soát phương pháp vật lý, sinh học hóa học Tuy nhiên, phương pháp sử dụng có ưu điểm nhược điểm định Trên giới việc sử dụng vật liệu nano để xử lý tảo nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm bước đầu cho thấy hiệu ức chế sinh trưởng số loài tảo Điều cho thấy tiềm ứng dụng rộng rãi kỹ thuật tiên tiến Tác động hạt nano tảo lam bao gồm: loại bỏ phốt sinh học, phá vỡ tế bào tảo lam, cố định độc tố microcysin ngăn chặn độc tố giải phóng môi trường Cho đến nay, chế tác động vật liệu nano lên số sinh vật chưa nghiên cứu nhiều Sự tiếp xúc loài tảo quang hợp nhân điển hình với nano dẫn đến suy giảm hàm lượng chất diệp lục, gây bất ổn nhiễm sắc thể xáo trộn 77 trình phân bào, liên quan tới dị tật hình thái học bên sợi tảo Trong hạt nano, nano bạc ý khả diệt khuẩn, nấm mốc hoạt tính sinh học chúng Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano diệt vi tảo hướng nghiên cứu chưa quan tâm nghiên cứu Đề tài: “Nghiên cứu chế tạo xác định độc tính nano Bạc vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa”nhằm hướng tới sử dụng vật liệu nano vào việc xử lý tượng nở hoa VKL độc thủy vực Mục tiêu nghiên cứu đề tài o o Chế tạo vật liệu nano bạc Đánh giá ảnh hưởng nano bạc đến sinh trưởng VKL M.aeruginosa Yêu cầu nghiên cứu  Chế tạo vật liệu nano bạc sử dụng NaBH4 làm chất khử với kích thước hạt nhỏ 10nm, hình cầu có tỷ lệ NaBH4/Ag+  0,3 Vật liệu nano bạc hạn chế sinh trưởng phát triển VKL M.aeruginosa qua 10 ngày thí nghiệm 88 PHẦN TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Vi khuẩn lam tác động độc tố chúng môi trường 1.1.1 Hiện tượng nở hoa VKL thủy vực 1.1.1.1 Định nghĩa nở hoa nước Sự nở hoa thực vật định nghĩa “sự bùng nổ” đáng ý đặc thù toàn cộng đồng sinh vật, có tác động trực tiếp gián tiếp đến hệ sinh thái hậu chúng thay đổi màu nước, làm giảm hàm lượng khí oxy hòa tan, làm cá động vật không xương sống bị chết hay gây ngộ độc cho người (Nguyễn Tác An, 1999) Theo Odum, vào khoảng thời gian nắng ấm kéo dài, nhiệt độ tăng cao thích hợp với phát triển tảo, số thủy vực thường xuất váng tảo kết đám mặt nước Hiện tượng gọi nở hoa nước Hiện tượng nở hoa nước kết giàu dinh dưỡng nước hay gọi phú dưỡng (Eutrophication) kết hợp với điều kiện thời tiết khí hậu thích hợp (Neilan cs, 2013) 1.1.1.2 Các nguồn gốc gây tượng nở hoa nước + Nước thải từ hoạt động sản xuất nông nghiệp Theo Zaimes Schultz (2002), tải lượng chất dinh dưỡng đổ vào hệ thủy văn có nguồn gốc từ nông nghiệp lớn tải lượng dinh dưỡng có nguồn gốc từ nguồn điểm thải Ở Mỹ, vào năm 1980 đất trồng trọt, đồng cỏ đất đồi góp phần chuyển tải 68% tổng P từ nguồn phát tán tới môi trường nước mặt Ở Châu Âu, khoảng 37-82% tổng nitơ 27-38% tổng phốtpho chuyển tải vào môi trường nước mặt từ hoạt động nông nghiệp Trong 270 dòng sông quan trắc Đan Mạch, 94% tổng nitơ 52% tổng phốtpho có nguồn gốc từ nguồn thải phát tán, chủ yếu từ hoạt động nông nghiệp 99 Như vậy, thấy hoạt động canh tác người có ảnh hưởng lớn tới trình chuyển tải chất dinh dưỡng từ đất vào môi trường nước mặt Ở Việt Nam, chế bơm tưới - tiêu phục vụ cho trồng lúa phức tạp Nhu cầu sử dụng nước tưới cánh đồng lúa thường lớn gấp 5-6 lần so với vùng đất trồng loại nông nghiệp khác Một số nghiên cứu trước đâycho thể tích nước tưới- tiêu đóng vai trò quan trọng việc chuyển tải chất dinh dưỡng vào hệ thống sông hồ Phân bón hóa học cho việc trồng rau loại hoa màu lớn Hàm lượng nitrat, amoni, phốtpho tổng mẫu nước thải từ vùng đất trồng rau hoa màu cao so với vùng đất rừng Theo trình rửa trôi, chảy tràn xói mòn lưu vực, lượng lớn chất dinh dưỡng từ phân bón dư thừa đặc biệt hai nguyên tố N P bị đổ vào hệ thống nước mặt góp phần gây phú dưỡng nguyên nhân gây tượng nở hoa nước góp phần gây ô nhiễm môi trường + Dư thừa thức ăn nuôi trồng thủy sản Các hoạt động nuôi trồng thuỷ sản gây ô nhiễm cho môi trường nước hồ nguồn thức ăn chăn nuôi Trong trình nuôi, lượng thức ăn dư thừa bị hoà tan phân huỷ môi trường nước, làm gia tăng hàm lượng muối dinh dưỡng hồ Thông thường động vật hấp thu 25 - 30% photpho thức ăn, số lại thải môi trường Theo tính toán cho diện tích ao nuôi 5,600 ha, sản lượng cá ước đạt 1,5×106 lượng chất thải môi trường khoảng 106 có 29×103 nitơ, 9,5×103 photpho (tính vật chất khô) 10 Hình 3.25 Chủng VKL M.aeruginosa công thức thí nghiệm có sử dụng vật liệu nano bạc nồng độ 1ppm Để nhìn rõ VKL M.aeruginosasử dụng kính hiển vi điện tử quét với kính hiển vi SEM ta thấy rõ hạt nano bạc bám bề mặt tế bào tảo tác động vào bên tế bào gây ức chế sinh trưởng M.aeruginosa B A Hình 3.26 Ảnh SEM chụp VKL M.aeruginosa công thức đối chứng (A) VKL M.aeruginosa công thức thí nghiệm bổ sung nano bạc 60 Vật liệu nano Bạc có độc tính chủng VKL M.aeruginosa, hạt nano bạc gây ức chế sinh trưởng tế bào VKL nồng độ 0,05; 0,1, 1ppm Theo Park cs, vật liệu nano bạc có tác động ức chế chọn lọc VKL gây hại M.aeruginosa(Park cs, 2010).Kết nghiên cứu dung dịch nano bạc thử nghiệm nồng độ 1ppm có hiệu xuất ức chế sinh trưởng >95% phù hợp với kết nghiên cứu Park cs cho nồng độ 1mg/L vật liệu nano bạc gây ức chế sinh trưởng 87% quần thể M.aeruginosaso với mẫu đối chứng (Park cs, 2010) 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết thu xin đưa số kết luận sau: Đối với vật liệu nano bạc kế thừa từ nghiên cứu trước thấy tổng hợp thành công vật liệu nano bạc sử dụng NaBH làm chất khửvì NaBH4 chất khử mạnh có xu hướng tạo hạt nano Ag kích thước nhỏ đồng Do nồng độ NaBH yếu tố định ảnh hưởng trực tiếp đến trình hình thành sản phẩm nano Ag Dung dịch keo nano bạc thu với điều kiện tối ưu: nồng độ 100 ppm với tỷ lệ nồng độ NaBH4/Ag+bằng 0,3, hạt bạc kích thước nanomet, có hình cầu, kích thước nhỏ 10 nm, nồng độ chitosan 80ppm tỷ lệ axit citric 15% Các tính chất vật lý đặc trưng dung dịch nano Ag kiểm tra phương pháp phân tích đại UV-vis, TEM Trong việc đánh giá độc tính nano bạc đến VKL M.aeruginosa qua công thức thí nghiệm thấy vật liệu nano bạc có khả ức chế sinh trưởng phát triển tế bào VKL M.aeuginosa nồng độ 0,05ppm, 0,1ppm 1ppm Còn nồng độ 0.01ppm bắt đầu có khả ức chế sinh trưởng tế bào VKL M.aeuginosa thấp Và nồng độ 0,001ppm 0,005ppm chưa ức chế sinh trưởng tế bào VKL M.aeuginosa 4.2 Kiến nghị Do thời gian có hạn nên đề tài chưa đánh giá đầy đủ, sâu sắc mặt vấn đề chưa đánh giá đầy đủ tính khả thi giải pháp Do vậy, đề nghị tiếp tục triển khai đề tài mức sâu rộng để đưa kết luận xác hoàn thiện Trên sở nội dung nghiên cứu, tiếp tục hoàn thiện quy trình tổng hợp nano Bạc sử dụng NaBH4làm chất khử làm tảng định hướng cho việc 62 tổng hợp kim loại khác cho việc tổng hợp nano bạc tác nhân khác Tiếp tục thử nghiệm hiệu xử lý M.aeruginosa vật liệu nano bạc nồng độ khác để tìm nồng độ thích hợp tạo điều kiện ứng dụng xử lý tảo lam M.aeruginosa loại tảo độc khác môi trường nước tự nhiên Từ đó, tạo sở cho việc đề xuất biện pháp giám sát, quản lý, phòng ngừa, giảm thiểu tác hại tảo độc cách hữu hiệu, góp phần bảo vệ cải thiện nguồn nước 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tài liệu tiếng việt [1] Nguyễn Đức Nghĩa, Công nghệ hóa học Nano, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ Hà Nội, (2007) [2] Nguyễn Tác An (1999), “Nghiên cứu động thái quần xã thực vật vực nước ven bờ có liên quan đến loài tảo gây hại”, Viện Hải dương học, TTKHTH&CNQG Tài liệu tiếng anh [3] Badr.Y, mahmoud.M.A Enhancement of the optical propertied of poly vinyl alcohol by doping with silver nanoparticles, J Appl Polym Sci, 99, (20060, pp.3068-3614 [4] Ball, A.S., Williams, M., Vincent, D., Robinson, J (2001) Algal growth control by a barley straw extract Bioresource Technology 77: 177-181 [5] Berger, J., Schagerl, M.( 2003) Allelopathic activity of Chara aspera Hydrobiologia, 501:109-115 [6] Blomqvist P., Petterson A., Hyenstrand P., (1994) Ammonium-nitrogen: a key regulatory factor causing dominance of non-nitrogen-fixing cyanobacteria in aquatic systems Archive fur Hydrobiology 132: 141-161 [7] Chen, J., Liu, Z., Ren, G., Li, P., Jiang, Y (2004): Control of Microcystis aeruginosa TH01109 with batangas mandarin skin and dwarf banana peel: Technical Note, Water SA., 30: 279–282 [8] Codd GA., Azevedo SMFO., Bagchi SN., Burch MD., Carmichael WW., Harding WR., Kaya K., Utkilen HC., (2005) CYANONET- A Global Network for Cyanobacterial Bloom and Toxin Risk Management Initial Situation Assessment and Recommendations [9] Cooke, G D., Welch, E B., Peterson, S A., Nichols, S A (2005) Restoration and Management of Lakes and Reservoirs 3rd edition Editor - Cooke, G.D., Taylor and Francis, Boca Raton, Florida: 591 pp 64 [10] Crayton A., (1993) Toxic cyanobacteria blooms A Field/ Laboratory Guide Pacific Lutheran University Tacoma Washington.18pp [11] Cronberg C., Annadotter H., (2006) Manual on Aquatic Cyanobacteria: A Photo Guide and a Synopsis of their Toxicology International Society for the Study of Harful Algae: 106 pp [12] Drabkova M., Marsalek B., (2007) A review of in-lake methods of cyanobacterial blooms control and management www.cyanodata.net [13] Franks PJS., (1995) Sampling techniques and strategies for coastal phytoplankton blooms In: Hallegraef, G M., Anderson, D M., Cembella, A D., Enevoldsen, H O (Eds.) Manual on Harmful Marine Microalgae: 25-43 [14] Hoeger SJ., Hitzfeld BC., Dietrich DR.,( 2005) Occurrence and elimination of cyanobacterial toxins in drinking water treatment plants Toxicol Appl Pharmacol 203: 231–242 [15] Imamura, N., Motoike, I., Shimada, N., Nishikori, M., Morisaki, H., Fukami, H.(2001) An efficient screening approach for anti-Microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem Journal of Antibiotics 54, 582-587 [16] Jancula D., Suchomelová J., Gregor J., Smutná M., Marsálek B., Táborská E.,(2007) Effects of aqueous extracts from five species of the family Papaveraceae on selected aquatic organisms Environ Toxicol 22: 480-486 [17] Lam, A.K.Y., Prepas, E.E., Spink, D., Hrudey, S.E (1995): Chemical Control of Hepatotoxic Phytoplankton Blooms - Implications for Human Health Water Research, 29, 1845-1854 [18] Nakai, S., Yamada, S., Hosomi, M (2005): Anti-cyanobacterial fatty acids released from Myriophyllum spicatum Hydrobiologia, 543, 71–78 65 [19] Neilan BA., Pearson LA., Muenchhoff J., Moffitt MC., Dittmann E., (2013) Environmental conditions that influence toxin biosynthesis in cyanobacteria Environ Microbiol 15:1239-1253 [20] Nguyen TTL., Cronberg G., Annadotter H Larsen J., (2007b) Planktic cyanobacteria from freshwater localities in Thuathien-Hue province, Vietnam II Algal biomass and microcystin production - Nova Hedwigia 85: 35-49 [21] NIES collection (1997), “List of train microalgae and protozoa “ , Microbial culture collection, Nationa Instiute for Enviromental Sudies Enviromen agency [22] Park MH., Kim KH., Lee HH., Kim JS., Hwang SJ, (2010) Selective inhibitory potential of silver nanoparticles on the harmful cyanobacterium Microcystis aeruginosa Biotechnol Lett 32 (3):423-428 [23] Philips J., Aldridge FJ., Schelske CL., Crisman TL., (1995) Relationships between light availability chlorophyll a and tripton in a large, shallow subtropical lake Liminology and Oceangraphy 40: 416-421 [24] Rapala J., (1998) Toxin Production by Freshwater Cyanobacteria: Effects of Environmental factors Ph.D Thesis University of Helsinki, Finland [25] Ressom R., Soong F.S., Filzgerald J., Turczynowicz L., El Saadi O., Roder D., Maynard T., Falconer I., (1994) Health effects of toxic cyanobacteria (blue-green algae) National Health and Medical Research Council (NHMRC), Australia, Canberra 111pp [26] Reynolds CS., Oliver RL., Walsby QA.E., (1987) Cyanobacterial dominance: the role of buoyancy regulation in dynamic lake environments N Z J Mar Fresh Water Res 21: 379-390 66 [27] Reynolds, C.S., Petersen, A.C (2000) The distribution of planktonic cyanobacteria in Irish lakes in relation to their trophic states Hydrobiologia 424: 91–99 [28] Rinta-Kanto JM., Konopko EA., Debruyn JM., Bourbonniere RA., Boyer GL., Wilhelm SW., (2009) Lake Erie Microcystis: relationship between microcystin production dynamics of genotypes and environmental parameters in a large lake Harmful Algae 8: 665– 673 [29] Robarts RD., Zohary T., (1987) Temperature effects on photosynthetic capacity respiration.and growth rates of bloomforming cyanobacteria New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research 21: 391–399 [30] Robson BJ., Hamilton DP., (2003) Summer flow event induces a cyanobacterial bloom in a seasonal Western Australian estuary Mar Freshw Res 54: 139-151 [31] Schrader, K.K Rimando, A.M.; Duke, S.O (1998): Natural compounds for the management of undesirable freshwater phytoplankton blooms Studies in natural Products Chemistry 26: 351-389 [32] Sigee, D.C., Glenn, R., Andrews, M.J., Bellinger, E.G., Butler, R.D., Epton, H.A.S., Hendry, R.D 1999 Biological control of cyanobacteria: principles and possibilities Hydrobiologia, 396, 161-172 [33] Sinoven K., Jones G.,( 1999) Cyanobacterial toxins In: Chorus I Bartram J (Eds) Toxic cyanobacteria in water Spon London [34] Tiwari DK, Behary J, Sen P, “Time and dose-dependent antimicrobial potential Ag nanoparticles synthesized by top-dow approach”, Current Science, 95(5),( 2008), pp.647-655 [35] Tsujimura, S (2004) Reduction of germination frequency in Anabaena akinetes by sediment drying: a possible method by which to inhibit bloom formation Water Research 38: 4361-4366 67 [36] Wang DY., Feng XZ., Zhou LG., Hao JY., Xu XX., (2008) Relationship between blue algal bloom and water temperature in Lake Taihu based on MODIS Journal of Lake Sciences 20 (2): 173–178 [37] Weast, R.C, J.A Spadaro, R.O.Becker, et al, ”Handbook of Chemistry and Physics”, 69th edu CRC press, Inc, Boca Raton, FL,(1989), pp.127-128 [38] Zaimes GN., Schultz RC., 2002 Phosphorus in Agricultural watersheds A literature Review Iowa State University Iowa 106 pp Tài liệu online [39] Đỗ Thị Hòa - Bùi Quang Tề - Nguyễn Hữu Dũng - Nguyễn Thị Muội Các điều kiện kích thích nở hoa tảo dại, tảo độc http://vibo.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=89/, 07/04/2015 68 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết đo OD bước sóng 680 Bướ Ngà c y sóng T0 T2 T6 T10 (nm) 680 680 680 680 Đối Ag chứn [0,001ppm g ] 0.014 0.030 0.216 0.412 0.016 0.032 0.214 0.398 Ag [0,005ppm ] Ag [0,01ppm ] Ag [0,05ppm ] 0.012 0.015 0.116 0.337 0.012 0.008 0.016 0.095 0.013 0.009 0.008 0.010 Ag Ag [0,1ppm [1ppm] ] 0.009 0.008 0.009 0.011 0.005 0.007 0.004 0.005 Phụ lục 2: Kết hiệu suất ức chế sinh trưởng ngày cuối Nồng độ (ppm) 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 T10 3,476 18,230 77,082 97,696 97,454 98,707 Phụ lục 3: Kết biến động mật độ trung bình tế bào VKL M.aeruginosa Nồng độ (ppm) 0,001 T0 79,07±6 72,24±4 T2 173,67±10 208,80±31 0,005 0,01 0,05 0,1 70,35±1 83,20±9 80,45±9 80,11±7 73,15±1 72,67±12 16,85±2 11,68±1 13,06±0 12,96±0 T6 T10 155,56±8 2931,73±78 285,28±6 3197,93±39 202,45±9 1404,67±68 140,08±8 247,33±48 7,93±2 4,15±0 5,15±0 1,16±0 1,65±1 1,54±0 Phụ lục 4: Hình ảnh nuôi tảo phòng thí nghiệm Phụ lục 5: Hình ảnh tảo qua ngày bổ sung vật liệu so với công thức đối chứng