BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LA NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG INDAPAMID TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG LC-MS/MS PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ TƢƠNG ĐƢƠNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LA NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG INDAPAMID TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG LC-MS/MS PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ TƢƠNG ĐƢƠNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60 72 04 10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đoàn Cao Sơn TS Tạ Mạnh Hùng HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đoàn Cao Sơn, TS Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tận tình hướng dẫn quan tâm giúp đỡ suốt trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô công tác Bộ môn Hóa Phân tích - độc chất giúp đỡ thời gian học tập trường Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương chia sẻ giúp đỡ trình thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ động viên để có đủ nghị lực, tâm hoàn thành luận văn Hà nội, ngày 03 tháng 04 năm 2017 Học viên: Lê Thị La MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………… CHƢƠNG TỔNG QUAN……………………………………………… 1.1 INDAPAMID…………………………………………………………… Công thức cấu tạo tính chất hóa l ………………………………… Liều dùng dược động học………………………………………… Một số phương pháp định lượng INDA dịch sinh học SẮC KÝ LỎNG – KHỐI PHỔ (LC-MS)………………………………… 1.2.1 Nguyên l hoạt động thiết bị phân tích khối phổ………………… 2.2 Cấu tạo phận thiết bị phân tích khối phổ loại tứ cực chập ba… 1.2.2.1 Bộ phận nạp mẫu………………………………………………………… 1.2.2.2 Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)………………………………… 10 1.2.2.3 Bộ phận phân tích khối tứ cực chập ba………………………………… 10 1.2.2.4 Bộ phận phát (detector)…………………………………………… 11 PH NG PHÁP PH N T CH THUỐC TRONG D CH SINH H C 12 K thuật x l mẫu…………………………………………………… 12 1.3.1.1 Kỹ thuật tủa protein……………………………………………………… 12 1.3.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng………………………………………………… 13 1.3.1.3 Kỹ thuật chiết pha r n…………………………………………………… 14 3.2 Th m định phương pháp LC-MS MS phân tích thuốc dịch sinh học…………………………………………………………………………… 1.3.2.1 ộ ch n l c………………………………………………………………… 15 16 1.3.2.2 Giới hạn định lượng (LLOQ)……………………………………… 16 1.3.2.3 ng chu n khoảng tuyến tính…………………………………… 17 1.3.2.4 Ảnh hưởng mẫu………………………………………………… 17 1.3.2.5 ộ nhiễm chéo……………………………………………………………… 17 1.3.2.6 ộ đ ng, độ ác ngày khác ngày…………………… 18 1.3.2.7 T lệ thu hồi………………………………………………………………… 18 1.3.2.8 Nghiên cứu độ ổn định hoạt chất dịch sinh h c………… 19 CHƢƠNG Đ I TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 20 NGUY N VẬT LIỆU………………………………………………… 20 2.2 ĐỐI T 21 NG NGHI N C U………………………………………… 2.3 NỘI DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHI N C U…………………… 21 2.3 Xây dựng phương pháp phân tích…………………………………… 21 2.3.1.1 ây dựng điều kiện khối phổ ác định IN 21 chu n nội………… 2.3.1.2 Khảo sát điều kiện s c k ………………………………………………… 22 2.3.1.3 Khảo sát qui tr nh l mẫu huyết tương……………………………… 22 2.3.2 Th m định phương pháp phân tích…………………………………… 23 2.3.3 Xác định nồng độ INDA mẫu huyết tương người tình nguyện… 25 CHƢƠNG 27 ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………… KẾT QUẢ X Y D NG PH NG PHÁP PH N T CH……………… 27 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng INDA chu n nội……… 27 3.1.1.1 iều kiện khối phổ định lượng IN …………………………………… 27 3.1.1.2 Khảo sát lựa ch n chu n nội…………………………………………… 30 .2 Khảo sát điều kiện sắc k …………………………………………… 32 3.1.3 Nghiên cứu quy trình x l mẫu huyết tương………………………… 36 3.1.4 Kết xây dựng phương pháp LC-MS MS định lượng INDA huyết tương………………………………………………………………… NG PHÁP PH N T CH…………… 39 40 3.2 Độ chọn lọc phương pháp………………………………………… 40 3.2.2 Xác định giới hạn định lượng (LLOQ)………………………… 43 3.2 KẾT QUẢ TH M Đ NH PH 3.2.3 Xây dựng đường chu n khoảng tuyến tính……………………… 44 3.2.4 Ảnh hưởng mẫu……………………………………………… 45 3.2.5 Độ nhiễm chéo………………………………………………………… 46 3.2.6 Độ đúng, độ xác ngày khác ngày …………………… 46 3.2.7 Xác định tỷ lệ thu hồi chất phân tích chu n nội 51 3.2.8 Nghiên cứu độ ổn định………………………………………………… 53 3.2.8.1 ộ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng th i gian ng n……… 53 3.2.8.2 ộ ổn định sau chu kỳ đông – rã đông……………………………… 54 3.2.8.3 ộ ổn định mẫu sau l (trong autosampler)………………… 54 3.2.8.4 ộ ổn định dài ngày mẫu huyết tương…………………………… 55 3.2.8.5 ộ ổn định dài ngày dung dịch chu n nội gốc………………………… 56 3.2.8.6 ộ ổn định dung dịch chu n nội làm việc nhiệt độ phòng………… 57 3.3 KẾT QUẢ Đ NH L NG INDA TRONG MẪU HUYẾT T NG NTN………………………………………………………………………… 58 CHƢƠNG BÀN LUẬN………………………………………………… 63 PH HUYẾT T NG PHÁP PH N T CH Đ NH L NG INDA TRONG NG NG ỜI 63 Phương pháp định lượng INDA 63 4.1.2 K thuật x lý mẫu 64 4.1.3 Th m định phương pháp phân tích 65 4.2 KẾT QUẢ PH N T CH MẪU HUYẾT T NG NTN 66 IẾN NGHỊ 68 ẾT LUẬN VÀ TÀI LIỆU THAM HẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AN : Chất phân tích (Analyte) AUC : Diện tích đường cong (Area under the curve) Cmax : Nồng độ cực đại CLR : Cloramphenicol CTPT : Công thức phân t CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) DĐH : Dược động học EMA : Cơ quan quản l Dược Châu u (European Medicines Agency) ESI : Ion hóa kiểu phun điện t (Electrospray ionization) GLB : Glibenclamid GLP : Glipizid HPLC : Sắc k lỏng cao áp (High performance liquid chromatography) HQC : Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High quality control) HT : Huyết tương IS INDA : Chu n nội (Internal standard) Indapamid ISMN : Isosorbid mononitrat LC-MS : Sắc k lỏng khối phổ (Liquid chromatography – Mass spectrometry) LC-MS/MS : Sắc k lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography – tandem mass spectrometry) LLOQ : Giới hạn định lượng (Lower limit of quantitation) LQC : Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Low quality control) m/z : Khối lượng điện tích MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MF : Hệ số mẫu (Matrix factor) MQC : Mẫu kiểm tra nồng độ (Medium quality control) NTN : Người tình nguyện PRED : Prednison SKD : Sinh khả dụng S Đ : Sắc k đồ SPE : Chiết pha rắn (Solid phase extraction) SQC : Mẫu kiểm tra bổ sung (Supplement quality control) STT T1/2 : Số thứgian tự bán thải Thời TĐSH : Tương đương sinh học Tmax : Thời gian đạt nồng độ cực đại ULOQ : Giới hạn định lượng (Upper limit of quantitation) US-FDA : Cơ quan quản l thuốc thực ph m M (United States – Food and Drug Administration) v/v : Thể tích thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Trang Bảng 1.1- Tóm t t thông số dược động h c INDA số nghiên cứu…………………………………………………………………………… Bảng 1.2- Một số phương pháp định lượng INDA huyết tương Bảng 2.1- ách chu n bị mẫu huyết tương……………………… 24 Bảng 2.2- ách chu n bị mẫu Q huyết tương……………………… 24 Bảng 3.1- iều kiện khối phổ định lượng IN IS……………….………… 40 Bảng 3.2- Ảnh hưởng mẫu tr ng th i gian lưu INDA…………………………………………………………………………………… 42 Bảng 3.3- Ảnh hưởng mẫu tr ng th i gian lưu IS 42 Bảng 3.4- Kết ác định giới hạn định lượng dưới………………………… 43 Bảng 3.5- Kết khảo sát đư ng chu n………………………………………… 44 Bảng 3.6- Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu……………………… 45 Bảng 3.7- Kết đánh giá độ nhiễm chéo……………………………………… 46 Bảng 3.8-1 - 3.8-5- Kết độ đ ng, độ ác ngày 47 Bảng 3.9- Kết ác định độ đ ng, độ ác khác ngày 49 Bảng 3.10- Kết ác định t lệ thu hồi IS 51 Bảng 3.11- Kết ác định t lệ thu hồi IN 52 …………………………… Bảng 3.12- Kết độ ổn định mẫu HT nhiệt độ phòng gi … 53 Bảng 3.13- Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông – rã đông…………………………………………………………………… 54 Bảng 3.14- Kết độ ổn định mẫu sau l autosampler……… 55 Bảng 3.15- Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương……………… 56 Bảng 3.16- Kết độ ổn định dài ngày dung dịch IS gốc……………… 57 Bảng 3.17- Kết độ ổn định dung dịch IS làm việc nhiệt độ phòng 57 Bảng 3.18- Kết nồng độ IN 60 huyết tương NTN…………………… DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang H nh 1.1- ông thức cấu tạo indapamid…………………………………… Hình 1.2- Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ………………………………… Hình 1.3- ấu tạo chế hoạt động phổ khối tứ cực chập ba……… 11 Hình 3.1- Phổ khối MS dung dịch chu n IN 27 ………………………………… Hình 3.2- Giản đồ tối ưu điện “thấu kính hội tụ” ion có số khối 364 a 28 Hình 3.3- Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [INDA-H] -………………………… 28 Hình 3.4- Giản đồ lượng phân mảnh [INDA-H] -………………………… 29 H nh 3.5- SK mẫu huyết tương có chu n IN GLP, GLB, ISMN, LR, PRE …………………………………………………………………………………… H nh 3.6- SK mẫu chu n chứa IN IS sử dụng hệ pha động MeOH : acid formic 0,1% (90 : 10, v/v)…………………………………………………… 31 32 H nh 3.7- SK mẫu chu n chứa IN IS sử dụng hệ pha động MeOH : amoni format 2mM (90 : 10, v/v)………………………………………………… 33 H nh 3.8- SK mẫu chu n chứa IN IS sử dụng pha động với t lệ MeOH : amoni acetat 10 mM (70 : 30, v/v)………………………………… 33 H nh 3.9- SK mẫu chu n chứa IN IS sử dụng cột 18 (150 4,6 mm; µm)…………………………………………………………………………… 34 H nh 3.10- SK mẫu chu n chứa IN IS sử dụng cột (100 2,1 mm; 1,9 µm)…………………………………………………………………………… H nh 3.11- SK mẫu chu n chứa IN IS với điều kiện s c k ây dựng…………………………………………………………………………………… Hình 3.12- Sơ đồ chiết IN HT phương pháp LLE…………… Hình 3.13- SK dòng ion IN 34 35 36 IS phân tích mẫu huyết tương tr ng l tủa protein Me N…………………………………………… Hình 3.14- SK dòng ion IN IS phân tích mẫu huyết tương tr ng l tủa protein MeOH…………………………………………… Hình 3.15- SK dòng ion IN IS phân tích mẫu huyết tương tr ng chiết lỏng - lỏng tert-butyl methyl ether………………………… Hình 3.16- SK mẫu huyết tương tr ng………………………………………… 37 38 39 41 Bảng 3.18- Kết nồng độ INDA huyết tương NTN Thời gian Nồng độ INDA IS Tỉ lệ 14763 0,000 0,0 2591 14790 0,175 3,2 5620 11869 0,474 8,7 9829 13789 0,713 13,2 12769 14462 0,883 16,3 14278 14391 0,992 18,3 18148 14322 1,267 23,4 10 19900 13181 1,510 27,9 11 21868 14265 1,533 28,3 12 18207 13020 1,398 25,8 14 15373 13042 1,179 21,8 16 16610 15299 1,086 20,1 24 10265 14366 0,715 13,2 36 8439 14766 0,572 10,5 48 3940 13689 0,288 5,3 72 992 13377 0,074 1,3 (giờ) (ng/mL) Cmax (ng/mL) 28,3 Tmax (giờ) 11 T1/2 (giờ) 14,7 AUC0-72 (ng/mL*giờ) 710,4 AUC0-∞ (ng/mL*giờ) 739,0 AUC0-72 giờ/AUC0-∞ (%) 96,1 60 H nh 3.21- ng cong nồng độ thuốc - th i gian NTN Kết nghiên cứu tiến hành th nghiệm NTN cho thấy: + Trên sắc k đồ mẫu huyết tương NTN trước uống thuốc (hình 3.18), mảnh ion đặc trưng INDA (m/z 364 → 89) CLR (m z 32 → 52) mẫu huyết tương không ảnh hưởng đến độ chọn lọc phương pháp Pic INDA IS mẫu huyết tương người sau dùng thuốc có hình dạng cân đối (hình 3.20) Như vậy, s dụng phương pháp xây dựng để định lượng INDA huyết tương người + Tất mẫu có nồng độ INDA giới hạn định lượng Giá trị Cmax (28,3 ng/mL) b ng khoảng nồng độ cao đường chu n (100 ng/mL) nên tiến hành pha loãng mẫu trình định lượng Giá trị LLOQ (0,5 ng mL) b ng khoảng 50 lần giá trị Cmax với mức liều ,5 mg Như vậy, khoảng tuyến tính xây dựng phù hợp để định lượng nồng độ INDA huyết tương người + Tỷ lệ phần trăm giá trị AUC0-72 giờ/AUC0-∞ 96,1% (lớn 80%) chứng tỏ thời điểm lấy mẫu đáp ứng yêu cầu US-FDA EMA nghiên cứu tương đương sinh học 61 + Có nồng độ mẫu QC (LQC SQC) n m khoảng nồng độ NTN làm tăng độ đúng, độ xác kết định lượng Do việc bổ sung mẫu SQC cần thiết phù hợp với yêu cầu US-FDA EMA Như vậy, phương pháp phân tích INDA xây dựng th m định áp dụng để nghiên cứu DĐH, SKD TĐSH chế ph m chứa INDA 62 CHƢƠNG BÀN LUẬN Nghiên cứu tiến hành thực dựa việc tham khảo tài liệu định lượng INDA dịch sinh học [25], [20], [22], [33], [26], [30], [13], [21], điều kiện trang thiết bị có trung tâm đánh giá tương đương sinh học (Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương) Phương pháp định lượng INDA huyết tương b ng k thuật LC-MS MS th m định đầy đủ đạt yêu cầu phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học theo hướng dẫn hành US-FDA EMA Kết áp dụng phương pháp để định lượng nồng độ INDA mẫu huyết tương NTN cho thấy phương pháp xây dựng có tính khả thi 4.1 PHƢƠNG PHÁP PH N T CH ĐỊNH LƢỢNG INDA TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI 4.1.1 Phƣơng pháp định lƣợng INDA Nghiên cứu luận văn s dụng k thuật phổ khối lần để định tính định lượng INDA mẫu huyết tương So với k thuật khối phổ lần để định lượng INDA dịch sinh học số tác giả khác [33], [20] phổ khối lần có ưu điểm vượt trội tính đặc hiệu, chọn lọc độ nhạy phương pháp Với hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng, chọn cột sắc ký cỡ hạt bé 1,7 µm; đường kính 2,1 mm; có thời gian phân tích ngắn, tốn dung môi hóa chất, gây ô nhiễm môi trường phương pháp HPLC định lượng INDA khác [13], [20], [22], [30], [33] Hơn nữa, thời gian phân tích mẫu khoảng 2,5 phút nên phương pháp LC-MS MS xây dựng góp phần giảm đáng kể tổng thời gian phân tích số lượng mẫu huyết tương nhiều nghiên cứu SKD TĐSH 63 4.1.2 Kỹ thuật xử lý mẫu Nguồn ion hóa ESI thiết bị LC-MS MS, với chế nhiễm điện bề mặt thích hợp để ion hóa INDA Quá trình ion hóa INDA nguồn ESI bị ảnh hưởng chất đồng r a giải dòng pha động sắc k Do vậy, phương pháp x l mẫu huyết tương loại bỏ tạp chất, loại bỏ tác nhân ảnh hưởng đến trình ion hóa INDA nguồn ESI thu hồi chất cần phân tích với tỷ lệ cao, lặp lại có vai trò quan trọng phân tích b ng LC-MS/MS So với k thuật chiết SPE [26], [13] để định lượng INDA, phương pháp x l mẫu xây dựng đơn giản, dễ thực kinh tế So với k thuật kết tủa protein, mẫu thu b ng phương pháp chiết với dung môi tert-butyl methyl ether có mẫu hơn, tín hiệu thu sắc k đồ ổn định (hình 5) Phương pháp x l mẫu nghiên cứu s dụng dung môi chiết tertbutyl methyl ether Sau kiềm hóa b ng dung dịch amoniac 0,1 M khả hòa tan INDA dung môi hữu không phân cực (tert-butyl methyl ether, cloroform, diethyl ether, ethyl acetat) tăng lên [12] Kết cho thấy với thể tích 250 µL dung dịch amoniac 0,1 M tỉ lệ thu hồi hoạt chất từ mL huyết tương có chứa INDA cao Trong nghiên cứu khác, mẫu huyết tương có INDA kiềm hóa trước chiết lỏng – lỏng b ng 00 µL dung dịch Na2CO3 0,5 mol L 500 µL huyết tương [20], 100 µL dung dịch NaOH 0, M 200 µL huyết tương [33] Tuy nhiên, dạng muối khó bay có khả làm tăng lượng ion mẫu, gây tượng ion suspression Ngược lại, với tác nhân kiềm hóa amoniac (một chất dễ bay dòng dung môi) ảnh hưởng mẫu lên kết phân tích không nhiều (diện tích pic thu từ dung dịch mẫu so với dung dịch nồng độ pha động xấp xỉ – bảng 3.6) Phương pháp chiết tiết kiệm thời gian so với x l mẫu b ng hỗn hợp dung môi chiết khó bay n-hexan dicloromethan [22] 64 Qui trình x lý mẫu mà xây dựng có tỷ lệ thu hồi cao ổn định, lớn 60% khoảng nồng độ thấp, trung bình cao (bảng 3.11) Quá trình x lý mẫu đơn giản, kinh tế phù hợp với điều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm có Việt Nam Do vậy, triển khai phương pháp chiết để x lý hàng loạt mẫu nghiên cứu SKD TĐSH 4.1.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích Phương pháp phân tích th m định đầy đủ theo hướng dẫn USFDA EMA th m định phương pháp phân tích dịch sinh học với tiêu: độ chọn lọc (hình 3.16, 3.17 bảng 3.2, 3.3), xác định giới hạn định lượng (bảng 3.4), xây dựng đường chu n khoảng tuyến tính (bảng 3.5), ảnh hưởng mẫu (bảng 3.6), độ nhiễm chéo (bảng 3.7), độ độ xác ngày (bảng 3.8-1 đến 3.8-5) khác ngày (bảng 3.9), tỷ lệ thu hồi chất phân tích (bảng 3.11) chu n nội (bảng 3.10), nghiên cứu độ ổn định chất phân tích huyết tương bảo quản điều kiện khác (nhiệt độ phòng thời gian ngắn - bảng 3.12, sau chu kỳ đông – rã đông - bảng 3, độ ổn định mẫu sau x lý autosampler - bảng 3.14 độ ổn định dài ngày - bảng 3.15), độ ổn định dung dịch chu n nội gốc (bảng 3.16) dung dịch chu n nội làm việc nhiệt độ phòng (bảng 3.17) Phương pháp phân tích xây dựng có giới hạn định lượng (LLOQ) khoảng 0,5 ng mL thấp b ng so với số phương pháp công bố [33], [26], [30], [13], [22], [20], [25] Giá trị LLOQ tương đương với kết công bố Yan Liang cộng [33] Tuy nhiên, thời gian phân tích phương pháp nghiên cứu (2,5 phút) ngắn so với phương pháp phân tích Yan Liang cộng (khoảng phút) So với kết công bố Tai-Jun Hang [30] Dragica Zendelovska [13], phương pháp nghiên cứu có giá trị LLOQ nhỏ 20 lần Giá trị LLOQ b ng khoảng 50 Cmax mức liều thông thường 1,5 mg nên s dụng phương pháp nghiên cứu khác với mức liều thấp (1,25 mg) 65 Trên sắc k đồ mẫu LLOQ (hình 3.17), giá trị S N pic INDA đạt xấp xỉ 50 Như vậy, giá trị LOQ phương pháp (tương ứng với mẫu có S N = 0) đạt xấp xỉ 0,1 ng/mL (1/5 nồng độ LLOQ) Với giá trị LOQ LLOQ nhỏ, phương pháp xác định nồng độ INDA mẫu huyết tương người xa thời điểm dùng thuốc nghiên cứu SKD, TĐSH thuốc chứa INDA người Trong nghiên cứu này, khoảng tuyến tính đánh giá đường chu n riêng biệt để lựa chọn hệ số weighting phù hợp ( x2) Với hệ số weighting lựa chọn, đường chu n có hệ số tương quan tuyến tính r > 0,990 nồng độ tính từ đường chu n so với nồng độ l thuyết n m giới hạn cho phép Điều chứng tỏ có tương quan tuyến tính nồng độ đường chu n tỉ lệ đáp ứng pic INDA/IS Do có khoảng tuyến tính rộng (0,5 – 100 ng/mL), phương pháp ứng dụng để đánh giá tương đương sinh học chế ph m chứa INDA nhiều hàm lượng khác Đây ưu điểm bật so sánh với khoảng tuyến tính cho phép định lượng INDA huyết tương công bố trước 10 – 200 ng/mL [30], 25 – 200 ng/mL [27]; 0,5 – 50 ng/mL [25], – 50 ng/mL [26], – 100 ng/mL [20] Do khoảng tuyến tính rộng nên quy trình th m định phương pháp đánh giá thêm mức nồng độ SQC nh m đảm bảo có mẫu QC n m khoảng nồng độ NTN Ngoài ra, kết th m định tiêu độ đúng, độ xác (được đánh giá ngày khác với mức nồng độ bao gồm LLOQ) cho thấy phương pháp có độ đúng, độ xác ngày khác ngày n m giới hạn cho phép 4.2 ẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU HUYẾT TƢƠNG NTN Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng INDA huyết tương người, kết cho thấy: - Trên SKĐ mẫu huyết tương NTN s dụng INDA ,5 mg (trừ mẫu HT thời điểm trước s dụng thuốc) xuất pic tương ứng với 66 pic INDA CLR mẫu chu n Như vậy, phương pháp LC-MS/MS nghiên cứu có tính đặc hiệu - chọn lọc cao - Tất mẫu có nồng độ INDA LLOQ, giá trị Cmax b ng khoảng 1/3 nồng độ cao đường chu n khoảng 60 lần giá trị LLOQ, mẫu n m khoảng tuyến tính th m định (0,5 – 100 ng/mL) - Có nồng độ QC khoảng nồng độ NTN phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu EMA phân tích thuốc dịch sinh học [15] - Giá trị Cmax, Tmax, T1/2 AUC phù hợp với tài liệu công bố [26] Do vậy, phương pháp xây dựng áp dụng nghiên cứu TĐSH chế ph m chứa INDA với hàm lượng khác 67 ẾT LUẬN VÀ IẾN NGHỊ ẾT LUẬN Nghiên cứu đạt mục tiêu đề xây dựng th m định phương pháp định lượng INDA huyết tương người b ng k thuật LCMS MS, ứng dụng cho đánh giá tương đương sinh học Dựa kết thực nghiệm, rút số kết luận sau: Về ây dựng phƣơng pháp phân tích Đã xây dựng phương pháp phân tích định lượng INDA huyết tương người b ng phương pháp LC-MS/MS với thông số sau: - Chất chu n nội: Cloramphenicol - iều kiện khối phổ: Kiểu phổ khối: MS MS, nguồn ion hóa ESI (-), phân mảnh 28 V với INDA 20 V với cloramphenicol - iều kiện s c k : + Cột C18; 100 x 2,1 mm; 1,7 µm Nhiệt độ cột 40°C ; + Pha động: MeOH – amoni acetat 10 mM (90:10, v/v); + Tốc độ dòng: 0,2 mL phút; + Thể tích tiêm mẫu: µL; + Nhiệt độ autosampler: 4°C - Qui trình xử lý mẫu: Lấy mL huyết tương, thêm 100 L dung dịch IS 250 µL NH4OH 0,1 M; lắc, sau chiết với mL dung môi tert-butyl methyl ether Lắc, ly tâm 3000 vòng/phút x phút Hút mL lớp trên, bốc dòng khí nitơ 40°C thu cắn Hòa tan cắn 0,5 mL pha động tiêm sắc ký Về thẩm định phƣơng pháp phân tích Đã tiến hành th m định đầy đủ theo hướng dẫn US-FDA EMA th m định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học 68 Kết th m định cho thấy, phương pháp xây dựng có độ chọn lọc cao với INDA; có giới hạn định lượng thấp 0,5 ng/mL (khoảng 50 Cmax mức liều ,5 mg); khoảng nồng độ tuyến tính rộng (0,5 – 100 ng/mL); không bị ảnh hưởng mẫu với giá trị CV nhỏ (dưới 2%); không bị nhiễm chéo; độ cao (giá trị trung bình độ khác ngày từ 91,8% đến 105,6%); độ lặp lại tốt với CV ≤ 15%; tỷ lệ thu hồi hoạt chất cao ổn định (trên 60%) ổn định điều kiện bảo quản khác (6 nhiệt độ phòng, 70 autosampler, sau vòng đông - rã đông 71 ngày nhiệt độ -35 ± 5°C) Xác định nồng độ INDA mẫu huyết tƣơng ngƣời tình nguyện Đã áp dụng phương pháp để xác định nồng độ INDA mẫu huyết tương NTN thời điểm khác với liều 1,5 mg Kết cho thấy phương pháp phân tích xây dựng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng nồng độ INDA mẫu huyết tương người IẾN NGHỊ Sau thực đề tài này, có số kiến nghị sau: - Tiếp tục triển khai áp dụng phương pháp nghiên cứu SKD TĐSH chế ph m có chứa dược chất INDA với hàm lượng khác chế ph m đa thành phần có chứa INDA - K thuật LC-MS/MS có ưu điểm vượt trội độ nhạy, tính đặc hiệu chọn lọc Do vậy, k thuật nên áp dụng nghiên cứu SKD TĐSH, đặc biệt cho chế ph m có hàm lượng, liều dùng thấp 69 TÀI LIỆU THAM HẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (20 2), Hoá phân tích, tập 2, tr 07-121, 295-318, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2015), ược thư Quốc gia Việt Nam, tr.804-806, Nhà xuất khoa học k thuật, Hà Nội Bộ Y tế (20 0), Thông tư 08 20 TT-BYT, Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/tương đương sinh h c đăng k thuốc Bộ Y tế (2009), ược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội, PL 14 Tạ Mạnh Hùng, Lê Thị Thu Huyền cộng (20 3), “Hướng dẫn th m định phương pháp sắc k lỏng hiệu cao để phân tích thuốc huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu tương đương sinh học”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, tập (số 40), tr -4 Tạ Mạnh Hùng (20 6), Nghiên cứu định lượng atenolol đồng phân đối quang số chế ph m thuốc dịch sinh h c, Luận án tiến s dược học, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Phạm Luận (20 4), Phương pháp phân tích s c k chiết tách Nhà xuất Bách khoa Hà Nội, tr 28-99, 193-314, 364-368 TÀI LIỆU TIẾNG ANH A.C Moffat, J.V.Jackson, M.S.Moss, B.Widdop (2004), “ larke’s Isolation and Indentification of Drug”, 2rd Edition, 681 Annesley, Thomas M (2003) "Ion Suppession in Mass Spectromerty" Clinical Chemistry 49 (7), 1041-1044 10 Asean (2015), Asean guideline for the conduct of Bioequivalent studies 11 Chinese Pharmacopoeia Commission, The pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2005), Guidances invivo bioavailability and bioequivalence studies for drug preparations, Volume II, Appendix XXB, A.207 - A.210 12 Dollery, C (1999), Therapeutic drugs, second edition Churchill livingstone, Edinburgh, United Kingdom 13 Dragica Zendelovska (2003), “Optimization of a solid-phase extraction method for determination of indapamide in biological fluids using highperformance liquid chromatography”, Journal of Chromatography B, 788 (2003), 199 - 206 14 Eduard Rogatsky, Daniel Stein (2005) “Evaluation of Matrix Effect and Chromatography Efficiency: New Parameters for Validation of Method Development”, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 16, 1757-1759 15 European Medicines Agency (2012), Guideline on bioanalytical method validation 16 European Pharmacopoeia Commission (2005), European pharmacopoeia Fifth edition, 2, 1032-1033 17 Food and Drug Administration-United states (2001), Guidance for industryBioanalytical method validation 18 Food and Drug Administration-United states (2013), Guidance for industryBioanalytical method validation, Draft Guidance 19 Food and Drug Administration-United states (2003): Guidance for Industry – Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products – General Consideration 20 G Li, X.Zhang (2012), “Pharmacokinetics and Bioequivalence Study of Two Indapamide Formulations after Single-dose Administration in Healthy Chinese Male Volunteers”, China Pharmaceutical University, 63, 13-18 21 Guilherme Araújo Pinto (2014), “An improved LC-MS/MS method for quantitation of indapamide in whole blood: application for a bioequivalence study”, Biomedical Chromatography, 28, 1212-1218 22 J Tang et al (2005), “Rapid and sensitive determination of indapamide in human blood by liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometric detection: application to a bioequivalence study”, Pharmazie 60, 819 - 822 23 Kole PL, Venkatesh G, Kotecha J, Sheshala R (20 ), “Recent advances in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods” Biomedical Chromatography; 25(1-2), 199-217 24 Lakshmana Prabu S., Suriyaprakash T.N.K (2012), Applied Biological Engineering - Principles and Practice Chapter 21: Extraction of Drug from the Biological Matrix: A Review InTech Publisher, 479-503 25 Natalija Nakov (2013), “High-throughput SPE-LC-MS/MS method for determination of indapamide in human serum”, Macedonian pharmaceutical bulletin, 59, 15-22 26 N Nakova (2013), “Development and validation of automated SPE-LCMS/MS method for determination of indapamide in human whole blood and its application to real study samples”, Biomedical Chromatography, 27, 1540 - 1546 27 Peter E Grebow (1981), “Semiautomated Assay for Indapamide in Biological Fluids”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 306-308 28 Somenath Mitra (2003), Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry John Wiley & Sons Publication, 37-131 29 Steen Honoré Hansen, Stig Pedersen-Bjergaard, Knut Einar Rasmussen (2015), Bioanalysis of Pharmaceuticals: Sample Preparation, Separation Techniques and Mass spectrometry John Wiley & Sons Publisher – UK., 73 - 122 30 Tai-Jun Hang (2006), “A selective HPLC method for determination of indapamide in human whole blood: Application to a bioequivalence study in Chinese volunteers”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40, 202 - 205 31 Thermo scientific (2010), TSQ Series: Hardware manual 32 Wilfried M.A Niessen (2006), Liquid Chromatography – Mass Spectrometry Third Edition, Taylor and Francis Group LLC, 23-150 33 Yan Liang (2006), “Simple, Sensitive, and Rapid LC–MS Method for the Quantitation of Indapamide in Human Plasma - Application to Pharmacokinetic Studies”, Journal of Chromatography B, 842, 58-63 PHỤ LỤC - Giấy chứng nhận đăng tạp chí kiểm nghiệm thuốc - Sắc k đồ mẫu đường chu n mẫu kiểm tra - Sắc k đồ mẫu huyết tương NTN trước sau dùng thuốc ... Indapamid huyết tương ngư i L -MS/ MS phục vụ đánh giá tương đương sinh h c” thực với mục tiêu sau: Xây dựng th m định phương pháp định lượng INDA huyết tương người b ng sắc k lỏng khối phổ (LC- MS/ MS)...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LA NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG INDAPAMID TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG LC- MS/ MS PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ TƢƠNG ĐƢƠNG SINH HỌC LUẬN VĂN... động học INDA số nghiên cứu tương đương sinh học nghiên cứu dược động học mẫu huyết tương NTN trình bày bảng Bảng 1.1- Tóm t t thông số dược động h c INDA số nghiên cứu Thiết kế Cmax nghiên cứu