B ộ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ T H ự C PHẤM HUỲNH THỊ NGÂN TÂM NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP ĐỒ ÁN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHÉ BIÉN THỦY SẢN Nha T rang - 2012 B ộ GIÁO VÀ Đ ÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ T H ự C PHẤM HUỲNH THỊ NGÂN TÂM NGHIÊN CỨU KHẢ NẢNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP ĐÒ ÁN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIÉN THỦY SẢN Giảng viên hướng dẫn: Ks VŨ LỆ QUYÊN Th.s NGUYÊN THỊ THANH HẢI Nha T rang - 2012 NHẬN XÉT CỦA CÁN B ộ HƯỚNG DẪN Họ, tênSV: Huỳnh Thị Ngân Tâm Lóp: 50CB Ngành: Mã ngành: 102 Công nghệ chế biến thủy sản Tên đề tài: “NGHIÊN cứu KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CH1TOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP ” Số trang: 63 số chương: 03 Tài liệu tham khảo: ❖ NHẬN XÉT: ❖ KÉT LUẬN: Nha Trang, ngày thảng năm 2012 CẢN B ộ HƯỞNG DẴN Lội cảm ơn Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô Vũ Lệ Quyên, cô Nguyễn Thị Thanh Hải, trực tiếp hướng dẫn em thực đề tài Qua cho em gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu trường Đại học Nha Trang - Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm - Các thầy cô khoa Công nghệ Thực phẩm - Các cán quản lý phòng thí nghiệm, anh chị phòng thí nghiệm bạn sinh viên Đã quan tâm, đóng góp ý kiến, tận tình giúp đỡ em hoàn thành đồ án Mục lục Trang BẢNG CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG .ii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ iii MỞ ĐẦU iv CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan chitin-chitosan, chitosan phân từ lượng thấp 1.1.1 Chitin-chitosan 1.1.2 Chitosan phân tử lượng thấp 1.1.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất chitosan chitosan oligosaccharide 1.1.4 ứng dụng chitosan chitosan oligosaccharide 1) ứng dụng chitosan .8 2) ứng dụng chitosan oligosaccharide 16 1.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển số vi sinh vật .16 1.2.1 E.Coli 16 2.2 Staphylococcus aureus 17 1.2.3 Salmonella 18 1.2 Listeria 19 1.6.Cơ chế kháng khuẩn chitosan 20 • Đặc tính kháng khuẩn chitosan 20 • Cơ chế kháng khuẩn chitosan 20 1.7 Một số nghiên cứu khả kháng khuẩn chitosan phân tử lượng thấp 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 24 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 i 2.2 Máy móc thiết bị cần sử đụng 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.4 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết nghiên cứu vi khuẩn gram (-) 30 3.1.1 E.Coli 30 3.1.2 Salmonella 35 3.2 Kết nghiên cứu vi khuẩn gram (+) 39 3.2.1 S.aureus 39 3.2.2 Listeria 43 3.3 So sánh khả kháng vi khuẩn Gram(-) Gram(+) chitosan 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 50 I Kết luận 50 II Đề xuất ý kiến 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC ii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu vsv Vi sinh vật E.Coli Escherichia coli s.aureus Staphylococcus aureus Salmonella Salmonella typhi Listeria Listeria monocytogenes COS Chitosan olygosaccharide Giải thích iii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng STT Trang Bảng 1: Hàm lượng chitin số loại phế liệu thủy sản Bảng 2: Kết kháng E.Colỉ chitosan chitosan phân tử lượng 58 thấp (% E.Colỉ bị chết) Bảng 3: Kết kháng S.aureus chitosan chitosan phân tử lượng 58 thấp (% S.aureus bị chết) Bảng 4: Kết kháng Salmonella chitosan chitosan phân tử 58 lượng thấp (% Salmonella bị chết) Bảng 5: Kềt kháng Lỉsteria chitosan chitosan phân tử lượng thấp (% Lỉsterỉa bị chết) iv 59 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐÒ THỊ Tên hình STT Trang Hình 1: Chitosan dạng vảy Hình 2: Công thức cấu tạo chitin chitosan 11 Hình 3: Chitosan phân tử lượng thấp 12 Hình 4: Hình ảnh kết kháng E.Coli 36 Hình 5: Biéu đổ kết kháng E.Colỉ c , C1 60 phút (a), 90 phút 37 (b), 10 phút (c) Hình 6: Biếu đổ kết kháng E.Coli c (a), C1 (b) theo nống độ 39 thời gian Hình 7: Hình ảnh kết kháng Salmonella 39 Hình 8: Biếu đồ kết kháng Salmonelỉa c , C1 60 phút (a), 90 42 phút (b), 120 phút (c) Hình 9: Biếu đồ kết kháng Salmonella c (a), Cl (b) theo nồng độ 44 thời gian 10 Hình 10: Hình ảnh kết kháng S.aureus 45 11 Hình 11: Biếu đồ kết kháng S.aureus c , C1 60 phút (a), 90 47 phút (b), 120 phút (c) 12 Hình 12: Biếu đồ kết kháng S.aureus C (a), C1 (b) theo nồng độ 49 thời gian 13 Hình 13: Hình ảnh kết kháng Listeria 50 14 Hình 14: Biếu đồ kết kháng Lỉsterỉa C, C1 60 phút (a), 90 phút 51 (b), 120 phút (c) 15 Hình 15: Biếu đổ kết kháng Listeria C (a), C1 (b) theo thời gian 53 16 Hình 16: Biếu đồ so sánh khả kháng khuấn C (a), C1 (b) 120 54 phút bốn chủng v s v nghiên cứu V LỜI M Ở ĐẦU Việt Nam quốc gia ven biển Đông Nam Á, có 3260 km bờ biển từ Móng Cái đến Hà Tiên vùng biển nhiệt đới nên Việt Nam có tiềm phong phú nguồn lợi thủy sản [1] Là ngành kinh tể trọng tâm kinh tế quốc dân, ngành thủy sản góp phần không nhỏ vào kinh tế Cùng với nhịp độ phát triển kinh tế nước, ngành thủy sản năm gần đạt thành tựu đáng kể nuôi trồng, chế biến thủy sản xuất nhập Nhưng với phát triển ngành, vấn đề phế liệu chế biến thủy sản điểm hạn chế lượng phế liệu thải từ công nghiệp chế biến thủy sản hàng năm lớn Nếu biện pháp xử lý thích hợp gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Vì yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh mà chủ yếu vỏ tôm, cua, ghẹ ngày trở nên cấp bách Đây nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất chitin chitosan chitosan phân tử lượng thấp Do việc nghiên cứu phát triển sản xuất chitin-chitosan chitosan phân tử lượng thấp quan trọng để nâng cao giá trị sử dụng phế liệu làm môi trường Chitosan polysaccharide có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua, ghẹ Đặc tính chitosan không tan nước, hòa tan acide nhẹ có khả kháng khuẩn cao Hiện chitosan nhà công nghệ chế biến nghiên cứu sử dụng nhiều lĩnh vực công nghệ Trong công nghệ sau thu hoạch, chitosan sử dụng làm màng bao bên các loại trái xoài, chôm chôm, để hạn chế thoát hoi nước kháng khuẩn Vì nhúng chitosan bên trái tạo cho trái có cảm quan đẹp bóng, giúp kéo dài thời gian bảo quản trái Trong lĩnh vực chế biến thủy sản, chitosan dùng để xử lý thịt, cá, tôm nhằm hạn chế hao hụt khối lượng trình cấp đông hạn chế phát triển vsv gây hư hỏng sản phẩm, thủy sản có chất lượng cảm quan tốt Từ chitosan, Thái Viết Chiêu nghiên cứu thủy phân chitosan thành chitosan phân tử lượng thấp với mục đích nâng cao khả kháng khuẩn tăng khả hòa tan chitosan, từ mở rộng phạm vi ứng dụng chitosan vĩ Khi nồng độ tăng dần, tỷ lệ Salmonella bị ức chế tăng theo (ở nồng độ 0,005% 60 phút 72,67% lượng Salmonella bị ức chế) Ở nồng độ 0,01% hầu hết thử nghiệm khoảng thời gian khác cho hiệu ức chế 100% Salmonelỉa Sở dĩ loại chitosan có độ deacetyl có chiều dài mạch ngắn lại có khả ức chế Salmonella cao tác dụng nhóm NH3+ chúng có khả xâm nhập vào nội bào gây cản trở trình tổng họp mARN từ AND, ngăn cản trình tổng hợp protein hợp chất nội bào khác Khi chiều dài mạch phân tử ngắn, phân tử chitosan trở lên linh động, chúng dễ dàng hấp phụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn Do tác dụng nhóm NH3+ phân tử chitosan, nhóm kết hợp với vị trí tích điện âm thành tế bào làm thay đổi tính thẩm thấu màng tế bào Quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng Lúc vi sinh vật nhận chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển bình thường chúng Hơn phân tử chitosan có kích thước nhỏ đường kính lỗ mao quản màng tế bào khuếch tán vào bên tế bào gây rối loạn trình trao đổi chất đồng thời gây cản trở trình sinh tổng hợp protein hợp chất nội bào khác, kết chúng không phát triển K ế t q u ả n g h iê n c ứ u tr ê n v i k h u ẩ n G r a m (+) 3.2.1 S.aureus Mầu C1 đối chứng sau 60 phút Mau C1 0,0075% sau 60 phút H ìn h 10: H ìn h ả n h k ế t q u ả k h n g S.aureus c ủ a c h ito s a n v c h ito s a n p h â n tử lư ợ n g th ấ p th ò i g ia n x lý 60 p h ú t 38 Tỷ lê S.aureus bi ức chế (%) J Y f v rp, 1A c „ • , uẨ/o/\ Tỷ lệ s aureus bị ức chê (%) 120 Nồng độ C,C1 (%) 120 Nồng độ c, c 1(%) 39 120 0.001 0.0025 0.005 0.0075 0.01 1(c) H ìn h 11: B iểu đồ k ế t q u ả k h n g Nồng độ c , Cl (%) S.aureus c ủ a c, C1 60 p h ú t (a), 90 p h ú t (b ), 120 p h ú t (c) Để thấy tác dụng chitosan chitosan phân tử lượng thấp vi khuẩn Gram (-) Gram (+), thí nghiệm tiến hành s aureus, đại diện cho nhóm Gram (+) gây bệnh Kết nghiên cứu trình bày phụ lục hình 10, 11, 12 Kết khác biệt lớn hai nhóm vi khuẩn Khi cố định nồng độ Chitosan 0,001%, thời gian tác dụng 90 phút tỷ lệ S.aureus bị ức chế tương ứng với loại chitosan c, C1 13% 14,83% Khi tiếp tục kéo dài thời gian tác dụng lên 120 phút tỷ lệ s.aureus bị ức chế nhiều (23% 24,5%) Như thấy nồng độ 0,001% tiêu diệt Chitosan mức độ thấp Tuy nhiên, thí nghiệm tăng nồng độ Chitosan lên 0,005% 0,0075% tỷ lệ S.aureus bị ức chế tăng đáng kể Sau 120 phút xử lý với c C1 nồng độ 0,0050,0075% có tới 75,67- 89,5% s.aureus phát triển môi trường TSA Khi nồng độ tăng lên đồng nghĩa với mật độ nhóm NH3+ tăng lên Thêm vào nồng độ tăng lên bề mặt tế bào s.aureus bị bao vây làm giảm ngưng khả trao đổi chất vi sinh vật Từ ảnh hưởng đến trình sinh trưởng chúng 40 Điều hoàn toàn phù hợp với giải thích nghiên cứu trước chế việc kháng khuẩn chitosan Các tác giả cho nhóm NH3+ chitosan nguyên nhân làm vi sinh vật không phát triển Như nồng độ thời gian xử lý có tác dụng thuận tới khả kháng s.aureus Các yếu tố tăng lên làm tăng hiệu ức chế s.aureus chitosan Cùng thời gian nồng độ xử lý tỷ lệ s.aureus bị ức chế mẫu c thấp mẫu C1 (ở nồng độ 0,0075% với thời gian xử lý 60 phút tỷ lệ s.aureus bị ức chế tương ứng với mẫu c, C1 80,17% 83% ) Như chiều dài mạch phân tử ảnh hưởng tới khả ức chế v sv chitosan Như vậy, thấy nồng độ yếu tố quan trọng việc ức chế loại vi khuẩn Gram (+) Ở nồng độ chitosan thấp, tác dụng kháng khuẩn chưa cao Chỉ nồng độ chitosan đủ lớn để hình thành lên lớp màng polymer bề mặt tế bào, phá vỡ hoạt động bình thường trình trao đổi chất ức chế thể rõ ràng Ngoài thời gian yếu tố quan trọng mang tính định đến hiệu kháng khuẩn Trong dải thời gian mà tác giả nghiên cứu, thời gian dài khả kháng khuẩn cao 41 H ìn h 12: B iể u đ k ế t q u ả k h n g Nồng độ Cl (%) S.aureus c ủ a c (a ), C1 (b ) th e o n n g đ ộ v th ò i g ia n Ảnh hưởng chiều dài mạch phân tử chitosan đến tính kháng khuẩn vấn đề nhiều nhà khoa học giới quan tâm Trong nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng S.aureus, vi khuẩn Gram (+) Kết thu tưomg tự với vi khuẩn Gram (—) nghiên cứu trước Khi chiều dài mạch giảm hiệu kháng khuẩn tăng lên (mặc dù tăng không nhiều) Kết nghiên cứu có khác biệt so với kết luận số tác giả nghiên cứu chitosan phân tử lượng thấp Đồ Thị Liền (2008), “Nghiên cứu cat mạch chitosan Hydroperoxyt thử nghiệm khả khảng khuẩn chủng”, Luận văn thạc sỹ kỹ thuật, cho hiệu kháng khuẩn chitosan vi khuẩn Gram (-) tốt nhiều so với vi khuẩn Gram (+) vi khuẩn Gram (+) chiều dài mạch phân tử tăng khả kháng khuẩn tăng Bàn chế kháng s aureus chitosan số tác giả cho chitosan có khả phá huỷ màng tế bào thông qua tương tác nhóm NH3+ với nhóm phosphoryl thành phần phospholipid màng tế bào vi khuẩn Quan sát kính hiển vi phá hủy tế bào s aureus, phân chia tế bào bị rối loạn, tạo thành tế 42 bào không theo qui luật: tế bào tạo thành màng màng tế bào tạo thành mỏng gây nên rò rỉ hợp chất nội bào.[5] 2 Listeria Mâu C1 đôi chứng sau 60 phút H ìn h : H ìn h ả n h k ế t q u ả k h n g Mâu C1 0,0075% sau 60 phút Listeria chitosan thời gian x lỷ 60phút j5' 53 $ «uH (a) Nồng độ c , C1 (%) 43 N Ox® '«D J£ o o -B 2' Q 03 ưi >