BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - TRẦN THỊ HOA TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LÊN MEN DỊCH THUỶ PHÂN TỪ SINH KHỐI THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2010 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa MỞ ĐẦU Hiện vấn đề nhiên liệu sinh học trở thành mối quan tâm hàng đầu quốc gia Một số nguồn nhiên liệu sinh học đề cập đến có tính ứng dụng cao ethanol Ethanol nguồn nhiên liệu sinh học (còn gọi bio-ethanol) sử dụng thay phần nhiên liệu truyền thống Ethanol nhiên liệu cồn tuyệt đối (hay gọi cồn khan, có độ cồn 99,7 – 100 %) Nhiên liệu hóa thạch nguồn lượng cho kinh tế giới, nhiên theo thời gian nguồn nhiên liệu sớm muộn cạn kiệt Ngoài việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch thải vào không khí lượng lớn khí nhà kính (chủ yếu CO2), việc làm nhiệt độ không khí trái đất tăng lên, mực nước biển dâng cao Nếu không tích cực hành động dẫn tới thiên tai, lũ lụt, hạn hán Chính điều mà nhiều quốc gia, nhiều tập đoàn lượng giới có chiến lược kết hợp sử dụng tiết kiệm hiệu dầu mỏ, đồng thời đầu tư cho nghiên cứu sử dụng dạng nhiên liệu thay phần xăng dầu, có nhiên liệu sinh học Ở nước ta cồn sản xuất chủ yếu từ nguồn nguyên liệu tinh bột rỉ đường Sản lượng cồn thấp gặp nhiều khó khăn nguồn nguyên liệu Trên giới, việc nghiên cứu sử dụng ethanol để pha với xăng dầu tiến hành nhiều năm qua Ethanol nhiên liệu đặc biệt ý nước có nông nghiệp phát triển mục tiêu hướng đến đa số quốc gia có nhu cầu tiêu thụ lượng lớn (World ethanol production, 2008-2012) Theo (Prasad et al., 2006) loại vật liệu thô chứa đường vật liệu chuyển hoá thành đường sử dụng làm chất lên men sinh ethanol Vật liệu thô bao gồm: Nguyên liệu chứa tinh bột, nguyên liệu chứa cellulose, phế thải nông nghiệp nguyên liệu chứa đường Sinh khối thực vật nguồn lượng to lớn toàn sống hành tinh Phần lớn sinh khối thực vật thải từ hoạt động nông - lâm nghiệp, công nghiệp gỗ, chế biến bột giấy bị xem “chất thải” gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, nguồn vật liệu chuyển hoá thành sản Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa phẩm mang giá trị kinh tế cao, ứng dụng cho nhiều ngành công nghiệp như: hoá chất, nhiên liệu, thức ăn gia súc dinh dưỡng cho người Trong số nguồn nguyên liệu sinh học sử dụng cho sản xuất ethanol nguồn sinh khối thực vật giàu lignocellulose khai thác Để sản xuất ethanol sinh khối thực vật cần thủy phân thành đường đơn sau hỗn hợp đường hexose (chủ yếu glucose) pentose (chủ yếu xylose) lên men thành ethanol Việc sử dụng nguồn sinh khối thực vật như: bã mía, rơm rạ, phế thải công nghiệp (mùn cưa, mật rỉ) cho sản xuất ethanol không ảnh hưởng tới an ninh lương thực Sản phẩm thu trình thuỷ phân sinh khối thực vật hỗn hợp loại đường khác (chủ yếu glucose xylose xylose chiếm 20 – 30% lượng đường tạo ra) dùng làm nguyên liệu lên men ethanol Bản thân việc lên men đường xylose gặp nhiều khó khăn có chủng vi sinh vật có khả thực công đoạn cách hiệu (Võ Hồng Nhân cộng sự., 1993) Nhìn chung ethanol tạo từ lên men loại đường vi sinh vật: Vi khuẩn nấm men (Hahn- Hagerdal B et al., 2006) Vì việc tìm chủng vi sinh vật có khả lên men ethanol từ nguồn đường glucose, xylose có ý nghĩa mặt khoa học thực tiễn Với mục đích hướng tới sản xuất cồn nhiên liệu từ sinh khối thực vật tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng vi sinh vật lên men dịch thủy phân từ sinh khối thực vật” Với nội dung sau: ¾ Tuyển chọn chủng có khả lên men đường pentoza (xyloza) ¾ Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn ¾ Phân loại định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn dựa đặc điểm sinh lý, sinh hóa trình tự gen 16S rARN ¾ Đánh giá khả lên men ethanol nguồn đường ¾ Nghiên cứu động học trình lên men chủng vi khuẩn Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa ¾ Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng khả lên men sinh ethanol chủng vi khuẩn ¾ Đánh giá bước đầu khả lên men dịch thuỷ phân từ sinh khối thực vật (dịch thuỷ phân từ gỗ) chủng tuyển chọn Đề tài thực Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt nam, với hỗ trợ kinh phí từ đề tài: “Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất ethanol nhiên liệu từ gỗ phế liệu nguyên liệu giấy” Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sinh khối thực vật Sinh khối thực vật hay gọi biomass bao gồm: loại sản phẩm trồng gỗ, phế phụ phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ công nghiệp giấy…Các nguyên liệu chứa thành phần chủ yếu cellulose, hemicelluloses lignin Quá trình sản xuất ethanol thực nhiều loại chất khác nhau, phân loại nguyên liệu lên men thành dạng chính: nguyên liệu chứa tinh bột, nguyên liệu chứa đường sinh khối thực vật Về mặt chất loại nguyên liệu chứa hydratcacbon, chất chủ yếu cho lên men ethanol (Prasad et al., 2006), (Cardona Sanchez, 2007) - Nguyên liệu chứa tinh bột Nguyên liệu chứa tinh bột bao gồm: loại ngũ cốc ngô, gạo, đại mạch, khoai tây, khoai lang, sắn…Những nguyên liệu ứng dụng rộng rãi lên men cồn công nghiệp Một số nước điển Mỹ sản xuất cồn chủ yếu từ ngô, Thái Lan sản xuất từ sắn nước ta nấu rượu cổ truyền chủ yếu từ nguyên liệu sắn, gạo, ngô…Ngày nay, việc sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột gặp phải nhiều trở ngại, nguồn lương thực chủ yếu phục vụ đời sống người Vì vậy, việc mở rộng sản xuất cồn nhiên liệu có tác động tiêu cực đến an ninh lương thực toàn giới - Nguyên liệu chứa đường Nguyên liệu chứa đường bao gồm: mía đường, củ cải đường rỉ mật Rỉ mật phụ phẩm ngành sản xuất đường Khoảng 75% tổng rỉ mật giới sản xuất từ mía (Saccharum officinarum) đa phần lại có từ củ cải đường (Beta vulgaris) Mía trồng nước nhiệt đới (Châu Á Nam Mỹ), củ cải đường có nguồn gốc vùng ôn đới (Châu Âu Bắc Mỹ) Thành phần rỉ mật đường sucrose lượng nhỏ đường glucose, fructose Nói chung, sản lượng rỉ mật khoảng 1/3 sản lượng đường sản xuất Cứ khoảng 100 mía đem ép có - rỉ mật sản xuất Brazil, Cu ba, Ấn Độ sản xuất ethanol Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa chủ yếu từ mía đường Trong Pháp lại chủ yếu sử dụng nguyên liệu củ cải đường - Sinh khối thực vật Trong số nguồn nguyên liệu sinh học sử dụng cho sản xuất ethanol, nguyên liệu cellulose thực dồi khai thác Sản lượng sinh khối thực vật toàn cầu hàng năm vào khoảng 200 tỷ tấn, 90% số lignocellulose Có khoảng - 20 tỷ thực tế sử dụng để sản xuất ethanol Mặc dù có nhiều cố gắng việc sản xuất ethanol từ nguồn tài nguyên tái sinh quy mô công nghiệp gặp nhiều khó khăn Sinh khối thực vật giàu lignocellulose nguyên liệu phức tạp nhiều so với tinh bột Thành phần chủ chốt chúng bao gồm cellulose, hemicellulose lignin gắn kết chặt chẽ với liên kết hydro liên kết đồng hóa trị Để sản xuất ethanol, polysaccarit cần thủy phân thành đường đơn sau hỗn hợp đường hexose (chủ yếu glucose) pentose (chủ yếu xylose) lên men thành ethanol Việc thủy phân lignocellulose theo đường hóa học enzyme không đơn giản Ngoài ra, trình thủy phân sử dụng axit (một công đoạn thiếu công nghệ có) phân hủy lượng đáng kể đường tạo thành chất độc hại furfuran (tới 60% tùy theo chế độ thủy phân) vi sinh vật công đoạn lên men Bản thân việc lên men đường xylose (chiếm 20 - 30% lượng đường tạo ra) thành ethanol gặp nhiều khó khăn có chủng vi sinh vật có khả thực công đoạn cách hiệu So sánh khả sản xuất cồn từ nguồn nghuyên liệu khác (bảng 1.1) cho thấy, sinh khối thực vật cho sản lượng ethanol tương đối cao xếp sau ngô, gạo, đại mạch lúa mì Đây điều thực đáng mừng, nhằm giải lượng lớn phế thải từ hoạt động nông, lâm nghiệp nhằm bảo vệ môi trường Theo (Bohlamann, 2006) Sinh khối thực vật sản xuất 442 tỷ lít ethanol năm Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa Bảng 1.1 Năng suất cồn từ nguyên liệu (Linoj Kumar N.V et al., 2006) Hàm lượng ethanol (l/tấn) 70 110 125 110 180 360 430 250 340 60 280 Nguyên liệu Đường mía Củ cải đường Khoai tây đường Khoai tây Sắn Ngô Gạo Đại mạch Lúa mì Cao lương Bã mía sinh khối thực vật 1.2 Các qui trình thuỷ phân sinh khối thực vật 1.2.1 Thủy phân axit 1.2.1.1 Tiền xử lý nguyên liệu axit đặc Công nghệ dựa việc sử dụng axit đặc để phá hủy cấu trúc tinh thể cellulose sau thủy phân axit loãng Các khâu tách axit khỏi đường, thu hồi cô đặc axit công đoạn mấu chốt quy trình Trong công nghệ này, axit đặc phá hủy liên kết hydro mạch cellulose hình thành trạng thái dạng gelatin với axit trở nên mẫn cảm với phản ứng tự thủy phân Sau pha loãng với nước tác động nhiệt cellulose nhanh chóng bị thủy phân thành glucose Năm 1937 người Đức xây dựng đưa vào hoạt động số nhà máy sản xuất cồn theo công nghệ thủy phân axit đặc sử dụng axit clohydric Vào năm 1948 người Nhật phát triển công nghệ sử dụng axit sulfuric đặc sản xuất quy mô thương mại Họ đưa vào công nghệ lọc màng cho phép phân tách axit khỏi dung dịch đường với khả thu hồi 80% lượng axit sử dụng Công nghệ thủy phân axit đặc tiếp tục phát triển tài trợ Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ năm thập niên 1940 1980 Trong quy trình xử lý nguyên liệu sinh khối thực vật có hàm ẩm 10% xử lý axit sulfuric nồng độ 70 - 77% Lượng axit sử dụng so với sinh khối Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa 1,25:1 nhiệt độ giữ mức 500C Sau nước bổ sung để pha loãng axit tới nồng độ 20% - 30% gia nhiệt tới 100oC giữ 1h để trình thủy phân diễn Dịch dạng gel lấy khỏi bể phản ứng lọc ép để lấy dịch đường axit Phần chất rắn lại tái thủy phân lần Dịch đường axit phân tách sử dụng cột sắc ký Công đoạn lên men chuyển hóa đường thành ethanol với hiệu suất 85% với xylose 92% với glucose Arkenol tuyên bố thu hồi 97% axit quy trình sản xuất (Võ Hồng Nhân cộng sự., 1993) 1.2.1.2 Tiền xử lý nguyên liệu axit loãng Quá trình thủy phân thực thông qua giai đoạn Giai đoạn đầu thực chế độ tương đối ôn hòa cho việc thủy phân hemicellulose giai đoạn sau thích ứng để thủy phân dạng polysacarit bền vững nhiều cellulose Dịch thủy phân từ trình thu hồi, trung hòa lên men tạo ethanol Công nghệ sản xuất ethanol dựa công nghệ thủy phân dùng axit loãng người Đức phát triển từ trước Đại chiến giới Lần thứ I Công nghệ thương mại hóa Mỹ thông qua quy trình cải biến với bước thủy phân Hiệu suất công nghệ đạt 125 lít cồn/tấn nguyên liệu, nhiên với thời gian thủy phân ngắn nhiều Tất nhà máy sản xuất cồn từ gỗ kể đóng cửa sau Đại chiến I khả cạnh tranh thấp nhu cầu không Năm 1932, người Đức phát triển công nghệ thủy phân theo nguyên lý “dòng chảy” sử dụng axit sulfuric loãng Trong công nghệ axit loãng bơm qua lớp nguyên liệu gọi công nghệ Scholler Mặc dù hiệu suất thu hồi đường glucose cao (khoảng 70%) phương pháp có nhược điểm nồng độ đường dịch thủy phân thấp Trong giai đoạn thủy phân nguyên liệu xử lý dung dịch axit sulfuric 0,7% nhiệt độ 190oC với thời gian lưu phút Công đoạn thực 215oC với nồng độ axit 0,4% thời gian lưu phút Dịch thủy phân từ trình thu hồi, trung hòa lên men tạo ethanol Cellulose lignin lại dạng rắn sử dụng làm nhiên liệu cho sản xuất điện Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa (Neureiter M et al., 2002), (Sun Y Cheng J., 2005), (Võ Hồng Nhân cộng sự., 1993) 1.2.2 Thủy phân enzim Cellulase enzyme thủy phân cellulose, enzyme tạo nhiều sinh vật khác vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, thực vật, côn trùng… Cellulase tồn dạng enzyme đơn hay phức hệ enzyme gọi cellulosome Dựa vào chế xúc tác, cellulase chia làm loại chính: 1) endoglucanase hay 1,4-β-D-Glucan-4-Glucanohydrolase; 2) exoglucanase 3) βGlucosidase Trong sản xuất ethanol từ biomass, khả ứng dụng enzyme cụ thể thay công đoạn thủy phân dùng axit thủy phân dùng enzyme Với việc phân chia rõ ràng giai đoạn thủy phân lên men thường gọi tắt SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation) Một cải biến quan trọng ứng dụng enzyme công nghệ kết hợp hai trình đường hóa lên men công đoạn, hay gọi tắt SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) Trong quy trình SSF, enzyme cellulase vi sinh vật lên men cồn sử dụng đồng thời Lượng đường tạo enzyme tức thời chuyển hóa thành ethanol So với SHF, SSF làm tăng hiệu suất chuyển hóa cellulose thành ethanol lên 40% Một khó khăn khác nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzyme cellulase (45 - 55oC) nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật lên men ethanol (28 - 35oC) Ngoài ra, số thành phần dịch thủy phân ethanol tạo có tác động ức chế lên enzyme cellulase (Farrell AE et al., 2006), (Ghosh P Ghose TK., 2003), (Jones AM et al., 1994), (Lee J., 1997), (Rausch KD Belyea RL., 2006), (Lin Y Tanaka S., 2006) (Jones AM et al., 1994), (Võ Hồng Nhân cộng sự., 1993) 1.2.3 Dịch thuỷ phân từ sinh khối thực vật Nguyên liệu chứa cellulose hay gọi biomass bao gồm: loại sản phẩm trồng gỗ, phế phụ phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ công nghiệp giấy… Sản xuất ethanol từ phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm giai đoạn như: xử lý thủy phân nguyên liệu thành đường đơn, lên men nhờ vi sinh vật, lọc Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa dịch lên men tiến hành cất cồn (Gomez LD et al., 2008), (Moon HC et al., 2009) Trong đó, công đoạn chủ chốt định hiệu sản xuất cồn nhiên liệu từ biomass thủy phân nguyên liệu thành đường Hiện có nhiều hướng tiếp cận vấn đề thủy phân nguyên liệu thông qua tiền xử lý axit kiềm, nổ phá vỡ cấu trúc, xử lý nước nóng, sử dụng hóa chất CO2 chuyển hóa sinh học nhờ enzyme thủy phân (Sanchez OJ Cardona CA., 2008) Phương pháp sử dụng axit kiềm loãng kết hợp trình gia nhiệt nghiên cứu ứng dụng rộng rãi Axit có vai trò loại bỏ hemicellulose tạo sản phẩm xylose, arabinose, glucose, furfural phần lignin hòa tan…(Lavarack BPet al., 2002) Một số axit sử dụng axit hydrocloric, axit peractic, nitric, phosphoric (Balat M., 2008), (Sassner P et al., 2008), (Wei., bioethanol production), phổ biến axit sulfuric (Lloyd TA Wyman CE., 2005) (Sassner P et al.,2008), (Wei., bioethanol production) Vai trò kiềm loại bỏ lignin khỏi cấu trúc lignocellulose tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme cellulase tương tác với cellulose (Pandey A et al.,2000) Ngoài ra, tiền xử lý bã mía tác động kiềm phá vỡ cấu trúc thành tế bào thông qua hoạt động như: hòa tan hemicellulose, lignin silic; thủy phân uronic ester acetic; làm trương nở cellulose cuối dẫn đến phá vỡ cấu trúc tinh thể cellulose 1.2.4 Thành phần dịch thuỷ phân Sản phẩm thu trình thuỷ phân sinh khối thực vật hỗn hợp loại đường khác (chủ yếu glucose xylose xylose chiếm 20 – 30% lượng đường tạo ra) dùng làm nguyên liệu lên men ethanol Trong trình tiền xử lý, bên cạnh sản phẩm chính, số sản phẩm phụ hình thành như: aliphatic acids (acetic, formic and levulinic acid), đồng phân furan, hợp chất axit phenolic, furfural Đây sản phẩm phụ ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng trao đổi chất tế bào nấm mem, làm giảm đáng kể hiệu suất chí gây ức chế hoàn toàn trình lên men, làm giảm đáng kể hiệu suất chí gây ức chế hoàn toàn trình lên men Theo số nghiên cứu, chất gia tăng trình tiền xử lý Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa Kết cho thấy chủng D3 sinh trưởng tốt 30oC, nhiệt độ mật độ tế bào đo bước sóng 620nm đạt giá trị 3,22 cao so với dải nhiệt độ lại pH cuối 9,0 tăng lên đạt tới môi trường kiềm so với pH ban đầu 7,0 3.3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu Ảnh hưởng pH môi trường có ý nghĩa quan trọng khả sinh trưởng, phát triển VSV Kết nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường trình bầy bảng 3.7 hình 3.11 Từ kết trình bầy bảng 3.6 hình 3.11 cho thấy chủng vi khuẩn D3 sinh trưởng tốt pH= 6,5 Sinh thưởng pH= 4,0 pH cuối dao động khoảng môi trường kiềm Bảng 3.6 Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu lên sinh trưởng chủng D3 pH ban đầu pH cuối OD (λ620nm) 4,0 6,5 0,99 4,5 7,5 2,66 5,0 8,0 3,27 5,5 8,5 3,48 6,0 8,0 3,70 6,5 8,5 4,65 7,0 8,0 3,64 7,5 8,5 3,60 8,0 9,0 3,08 8,5 9,0 3,15 9,0 9,0 3,00 9,5 9,5 3,13 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 49 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa pH cuối, OD(620nm) 10 2 10 11 12 pH ban đầu pH cuối OD( λ620 nm ) Hình 3.11 Ảnh hưởng pH môi trường lên sinh trưởng chủng D3 3.3.3 Động thái sinh trưởng chủng D3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy có ý nghĩa quan trọng việc tiết kiệm thời gian, tiết kiệm lượng, tối ưu phát triển chủng giống điều kiện để tìm thời điểm chủng giống phát triển trẻ khoẻ phục vụ cho nghiên cứu Chúng nghiên cứu sinh trưởng chủng D3 sau 20, 24, 28, 44, 48, 55, 72, 76 96 nuôi cấy Kết trình bày bảng 3.8 hình 3.12 Bảng 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng chủng D3 Thời gian (h) pH cuối OD (λ620nm) 20 24 28 44 48 55 72 76 96 8,0 8,0 8,5 8,5 8,5 8,5 9,0 9,0 9,0 3,13 3,36 2,71 2,32 2,20 2,47 3,12 3,69 3,13 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 50 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa 10 6 pH cuối OD (620nm) 2 0 20 40 60 100 80 Thời gian (h) pH cuối OD620 Hình 3.12 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng chủng D3 Kết nghiên cứu cho thấy suốt thời gian sinh trưởng pH môi trường tăng từ giá trị ban đầu ~ lên 9,0 Sinh trưởng logarit hoàn thành sau 24 nuôi cấy Như thời gian thích hợp cho sinh trưởng chủng D3 24 với mật độ tế bào đo 3,36 Sau sinh trưởng logarit kết thúc, mật độ tế bào giảm dần 55h mật độ tế bào tiếp tục tăng đỉnh điểm 76h Điều cho thấy chủng vi khuẩn dùng sản phẩm tạo làm nguồn sinh dưỡng 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối(NaCl) Việc nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối liên quan tới việc cân áp suất thẩm thấu tế bào VSV Tìm nồng độ muối tối ưu cho sinh trưởng góp phần quan trọng phục vụ cho nghiên cứu Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ muối lên sinh trưởng chủng D3 Nồng độ muối (%) 0,3 OD (λ620nm) 0,43 O,51 1,40 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 0,5 51 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 3,22 2,99 2,34 2,37 1,99 1,78 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa Kết cho thấy chủng vi khuẩn D3 sinh trưởng tốt nồng độ muối 1% Ở nồng độ 2%, 3%, 4% sinh trưởng Như chủng vi khuẩn D3 thuộc loại chịu mặn yếu 3.4 Nghiên cứu lên men ethanol chủng vi khuẩn D3 Khả lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Chế độ nuôi cấy, nguồn dinh dưỡng sử dụng thay đổi môi trường Do đó, việc cải thiện môi trường điều kiện nuôi cấy cần thiết để giảm chi phí Tiến hành lên men 96h với lượng chất 3%, bổ xung giống 5% với mật độ tế bào OD(λ=620nm) = 2,46 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Chúng tiến hành lên men tạo ethanol chủng D3 khảo sát dải nhiệt độ khác từ: 28, 30, 32, 35, 37 40 45°C Mẫu lên men lặp lại lần Kết tạo thành dịch lên men thể bảng 3.9 hình 3.13 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả lên men ethanol chủng D3 Glucoza Nhiệt độ (oC) OD (λ=620nm) pH cuối Xyloza %V ethanol OD (λ=620nm) pH cuối %V Ethanol 28 0,30 ± 0,012 3,88 0,198 0,264 4,28 0,238 30 0,25 ± 0,022 3,87 0,213 0,292 4,17 0,242 32 0,257 ± 0,014 3,85 0,224 0,303 4,20 0,230 35 0,395 ± 0,017 3,81 0,239 0,271 4,24 0,212 37 0,207 ± 0,034 3,96 0,128 0,206 4,26 0,148 40 0,122 ± 0,015 4,02 0,076 0,171 4,48 0,096 45 0,114 ± 0,026 4,09 0,045 0,126 4,34 0,049 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 52 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa 4.5 3.5 OD(620nm) pH cuối %V ethanol Glucoza pH cuối Glucoza OD (l=620nm) 2.5 Glucoza %V ethanol Xyloza pH cuối 1.5 Xyloza OD (l=620nm) Xyloza %V Ethanol 0.5 28 30 32 35 37 40 45 Nhiệt độ (0C) Hình 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả lên men ethanol chủng D3 Kết cho thấy chủng D3 lên men cho %V ethanol cao nguồn glucose 350 C 0,239%, từ 400C trở lên lượng ethanol sinh không đáng kể Đồng thời sinh khối giảm dần theo chiều tăng nhiệt độ, số lượng tế bào 400, 450 C thấp Trong suốt qúa trình lên men pH giảm ổn định dải pH axit, điều có lợi lên men trnhs tượng tạp nhiễm Vì tiến hành lên men nguồn Glucose để thu sản phẩm, nhiệt độ nuôi nên 350C Chủng D3 lên men sinh ethanol có chiều hướng không giống sử dụng nguồn chất khác nhau, đồng thời nhiệt độ ảnh hưởng đến khả sinh trưởng lên men chủng không giống Trên nguồn xylose %V ethanol cao 300C 0,242%, lúc mật độ tế bào tập trung cao pH xuống thấp Khi nhiệt độ lên cao sinh trưởng kả lên men ethanol cảu chủng giảm dần Vì tiến hành lên men nguồn Xylose để thu sản phẩm, nhiệt độ nuôi nên 30ºC Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 53 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa 3.4.2 Ảnh hưởng pH Kết nghiên cứu ảnh hưởng pH lên khả lên men ethanol chủng nghiên cứu trình bầy bảng 3.11 hình 3.14 Bảng 3.10 Ảnh hưởng pH lên khả lên men ethanol chủng D3 pH ban đầu 4,5 5,5 6,5 7,5 Glucose OD %V (λ=620nm) ethanol 0,189 0,048 0,201 0,104 0,223 0,197 0,244 0,218 0,281 0,235 0,233 0,154 0,129 0,092 0,115 0,045 0,107 0,024 Xylose OD %V (λ=620nm) ethanol 0,17 0,051 0,159 0,103 0,283 0,249 0,262 0,225 0,256 0,198 0,242 0,145 0,163 0,098 0,121 0,047 0,102 0,015 pH cuối 4,30 4,27 4,28 5,00 4,15 4,21 4,90 4,53 4,92 pH cuối 4,26 4,38 4,20 4,21 4,7 4,37 4,39 4,21 4,54 4.5 3.5 Glucose pH cuối Glucose %V ethanol 2.5 OD (620nm) pH cuối %V ethanol Glucose OD (l=620nm) Xylose pH cuối Xylose %V ethanol 1.5 Xylose OD (l=620nm) 0.5 4,5 5,5 6,5 7,5 pH ban đầu Hình 3.14 Ảnh hưởng pH lên khả lên men ethanol chủng D3 Kết thu cho thấy chủng D3 lên men ethanol tối đa môi trường có pH ban đầu 5,0 nguồn Xylose, sau đến môi trường có pH ban đầu 4,5 Ở Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 54 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa pH khác chủng lên men thấp Như pH ban đầu thích hợp cho chủng lên men nguồn Xylose 5,0 Trên nguồn glucose chủng D3 sinh ethanol cao pH ban đầu 6, sau đến môi trường có pH ban đầu 5,5 Ở môi trường có pH ban đầu 7; 7,5 chủng sinh trưởng yếu lên men thấp Như pH thích hợp cho lên men nguồn glucose pH ban đầu 3.4.3 Động thái lên men ethanol Các kết nghiên cứu cho phép lựa chọn môi trường điều kiện lên men thích hợp cho chủng VK nghiên cứu Kết qủa nghiên cứu động thái lên men sinh ethanol chủng VK D3 nguồn chất Glucose cho thấy lượng sinh khối 20h đầu chưa cao, mật độ tế bào tăng dần đạt cực đại sau 92h, hàm lượng ethanol đạt cực đại sau 96h 0,228 %V Ở 92h %V ethanol cho giá trị không chênh lệch nhiều so với thời điểm 96h, để giảm chi phí lượng thời gian tốt để lên men ethanol nguồn glucose sau 92h Trên nguồn xylose hàm lượng ethanol đạt cực đại 0,256%V thời điểm 92h, lúc mật độ tế bào đạt giá trị cực đại So sánh cho thấy nguồn xylose chủng D3 lên men nhanh tạo ethanol cao sử dụng nguồn glucose Cả hai nguồn cho %V ethanol cao sau 92h lên men Bảng 3.11 Động thái lên men ethanol chủng vi khuẩn D3 Thời gian (h) 12 18 20 24 28 Glucose Xylose OD (λ=620nm) %V Ethanol OD (λ=620nm) %V Ethanol 0,132 0,140 0,241 0,245 0,248 0,041 0,085 0,168 0,187 0,195 0,130 0,145 0,249 0,241 0,240 0,056 0,095 0,167 0,189 0,197 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 55 Luận văn thạc sĩ khoa học 44 48 68 72 92 96 Trần Thị Hoa 0,350 0,351 0,352 0,355 0,362 0,359 0,201 0,206 0,212 0,217 0,227 0,228 0,334 0,335 0,337 0,341 0,353 0,392 0,205 0,216 0,223 0,235 0,256 0,249 0.4 0.35 OD (620nm) %wt ethanol 0.3 Xylose %V Ethanol - 0.25 Xylose OD (l=620nm) Ethanol - 0.2 Glucose OD (l=620nm) - 0.15 Glucose %V Ethanol - 0.1 0.05 12 18 20 24 28 44 48 68 72 92 96 Thời gian (h) Hình 3.15 Động thái lên men ethanol chủng vi khuẩn D3 3.4.4 Ảnh hưởng lượng giống tiếp Lượng giống tiếp tiến hành sở nhân giống lên men cấp I cấp II Giống cấp I nuôi cấy 24h, nhân giống cấp II, sau 24h tiến hành thu sinh khối lên men, ống lên men tiếp với lượng giống khác Bảng 3.13 Ảnh hưởng lượng giống lên khả lên men ethanol chủng D3 Glucose Lượng giống OD %V tiếp (λ=620nm) ethanol (%) 0,170 0,228 Xylose pH cuối OD %V (λ=620nm) ethanol pH cuối 4,25 0,170 0,225 4,26 0,189 0,231 4,24 0,179 0,237 4,38 0,213 0,235 4,33 0,224 0,240 4,20 0,226 0,237 4,24 0,236 0,252 4,21 0,359 0,239 4,21 0,262 0,249 4,27 0,362 0,250 4,16 0,359 0,250 4,37 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 56 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa 0,370 0,249 4,18 0,363 0,248 4,39 0,381 0,248 4,24 0,375 0,248 4,21 10 0,405 0,250 4,29 0,412 0,249 4,54 4.5 Glucose OD (l=620nm) 3.5 Glucose %V ethanol OD(620nm) pH cuối %V ethanol Glucose pH cuối 2.5 Xylose pH cuối 1.5 Xylose %V ethanol Xylose OD (l=620nm) 0.5 10 Lượng giống tiếp (%) Hình 3.16 Ảnh hưởng lượng giống lên khả lên men ethanol chủng D3 Kết cho thấy lượng giống tiếp 2% - 4% hàm lượng ethanol thu tương đương nguồn đường Khi tiếp giống 5% - 7% lượng ethanol có thay đổi đáng kể, 5% giống nguồn chất Xylose đạt 0,252%V ethanol, 7% giống nguồn Glucose đạt 0,250%V ethanol Trên 8% giống lượng ethanol sinh hai nguồn đường lượng ethanol tạo tương đương có chièu giảm xuống Chính lượng giống tiếp – 7% sử dụng cho nghiên cứu 3.4.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon Vi khuẩn thường chịu ảnh hưởng nhiều từ nguồn cacbon môi trường Nếu biết đặc điểm sử dụng nguồn cacbon chủng nghiên cứu có sở khoa học để lựa chọn nguồn nguyên liệu trình nhân giống, nuôi cấy, lên men Glucose, xylose, rỉ đường sucrose, với hàm lượng 1-5% chọn để nghiên cứu Riêng glucose xylose nghiên cứu rộng với hai nồng độ 7,5% 10% Kết trình bày bảng 3.14 hình 3.17 cho thấy chủng VK có Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 57 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa khả đồng hóa tất nguồn cacbon kiểm tra Khi tăng hàm lượng đường glucose từ 1% đến 4% %V ethanol mẫu tăng với tỷ lệ thuận, tới hàm lượng đường 5% %V ethanol đạt hàm lượng cao 0,203% V Sau hàm lượng ethanol không tăng hàm lượng glucose tiếp tục tăng Trong môi trường chứa xylose, rỉ đường sucrose chiều hướng lên men diễn tương tự hàm lượng ethanol đạt cao nồng độ nguồn cacbon 4%; 3% 3% 0,203% V; 0,197% V 0,208% V tương ứng Bảng 3.13 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên trình lên men chủng D3 Nguồn Cacbon Glucose Xylose Rỉ đường Sucrose Nồng độ (%) pH cuối 3,21 OD (λ=620nm) 0,31 3,55 0,32 0,180 3,77 0,32 0,182 3,15 0,35 0,189 3,88 0,47 0,200 7,5 3,86 0,46 0,197 10 3,96 0,46 0,198 3,26 0,33 0,181 3,12 0,41 0,188 3,94 0,45 0,193 3,82 0,55 0,203 3,21 0,50 0,197 7,5 4,55 0,51 0,198 10 4,77 0,52 0,198 3,57 0,42 0,166 3,15 0,49 0,187 3,88 0,51 0,197 3,86 0,45 0,178 3,96 0,48 0,175 3,83 0,50 0,179 3,65 0,51 0,185 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 58 % V ethanol 0,176 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa 3,57 0,62 0,198 3,56 0,59 0,197 3,74 0,52 0,196 Các kết xác định xylose 4% nguồn cacbon tốt cho lên men ethanol chủng D3 OD (620nm) pH cuối %V ethanol 4.5 3.5 pH cuối 2.5 OD (l=620nm) 1.5 % V ethanol 0.5 7,5 10 7,5 10 5 Glucose Rỉ đường Xylose Sucrose Nguồn cacbon (%) Hình 3.17 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên trình lên men chủng D3 3.4.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ Cùng với nguồn cacbon, nitơ nguồn dinh dưỡng thiếu có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng lên men ethanol VSV Nguồn nitơ khảo sát với nồng độ khác là: 0,05; 0,1; 0,15% Kết trình bày bảng 3.15 hình 3.18 Kết thu cho thấy chủng nghiên cứu sử dụng nguồn nitơ Nguồn hàm lượng nitơ tối ưu 0,1% (NH4)2SO4 cho hàm lượng ethanol cao hai nguồn cacbon glucose xylose 0,170%V 0,238%V Urea tỏ không thích hợp cho lên men ethanol chủng nghiên cứu Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 59 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa Bảng 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên trình lên men ethanol chủng D3 Nguồn nitơ Nồng độ (%) 0,05 (NH4)2SO4 NH4NO3 Glucose OD %V (λ=620nm) ethanol 0,283 0,135 OD pH cuối (λ=620nm) 4,88 0,412 Xylose %V ethanol 0,228 pH cuối 4,80 0,1 0,395 0,165 5,07 0,262 0,238 4,91 0,15 0,463 0,170 5,29 0,342 0,234 4,91 0,05 0,471 0,123 4,78 0,314 0,157 5,91 0,1 0,362 0,168 4,05 0,204 0.184 5,20 0,15 0,342 0,165 5,10 0,347 0,174 4,53 0,05 0,394 0,162 4,23 0,389 0,166 4,55 0,1 0,336 0,169 4,78 0,273 0,172 5,04 0,15 0,342 0,153 5,00 0,294 0,163 5,16 0,05 0,365 0,145 4,67 0,311 0,098 4,70 0,1 0,303 0,164 4,59 0,395 0,172 4,67 0,15 0,271 0,165 5,92 0,294 0,169 5,56 NH4Cl Urea OD(620nm) pH cuối %V ethanol Glucose pH cuối Glucose OD (l=620nm) Glucose %V ethanol 0,05 0,1 (NH4)2SO4 0,15 0,05 0,1 0,15 NH4NO3 0,05 0,1 NH4Cl 0,15 0,05 0,1 0,15 Urea Nguồn nitơ (%) Hình 3.18 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên trình lên men xylose chủng D3 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 60 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa OD(620nm) pH cuối %V ethanol Xylose pH cuối Xylose OD (620nm) Xylose %V ethanol 0,05 0,1 0,15 0,05 (NH4)2SO4 0,1 0,15 NH4NO3 0,05 0,1 NH4Cl 0,15 0,05 0,1 0,15 Urea Nguồn nitơ (%) Hình 3.19 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên trình lên men glucose chủng D3 3.5 Lên men dịch thuỷ phân từ gỗ chủng vi khuẩn D3 Nghiên cứu thử khả lên men chủng D3 số mẫu dịch thủy phân từ gỗ Kết cho thấy với dịch thủy phân axít chủng D3 lên men không lên men, dịch thủy phân enzym cho kết lên men tốt (Bảng 3.16) Áp dụng rộng khả lên men chủng D3 nguồn đường 5, đường khác nhau, so sánh với số chủng khác như: Pichia stipitis, Zymomonas mobilis, D5, phối hợp chủng D3 với chủng lại Kết trình bầy bảng 3.17 Bảng 3.15 D3 lên men dịch thủy phân từ gỗ chủng vi khuẩn D3 Tên chủng D3 Thủy phân bột giấy enzym, đường 15 g/l + Mẫu Dịch lên men Thủy phân Thủy phân Enzym mới, bột giấy H2SO4, nồng độ axit, đường g/l đường 13,8 6,0784 g/l g/l ± - Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 61 Enzym mới, nồng độ g/l + Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa Bảng 3.16 Phối hợp chủng lên men dịch thủy phân từ gỗ Mẫu dịch lên men pH dịch lên men Khả lên men chủng vi sinh vật D3 D5 Hỗn hợp D3và D5 Pichia stipitis Zymomonas mobilis + - - - - + - - - - + - + - - + +++ +++ ++ - 7,5 ++ ++ ++ ++ ++ + + Mẫu 2: Dịch thủy phân sơ gỗ keo tai tượng H2SO4 0,8%, 140145°C, 30 Mẫu 1,3,4: Dịch tiền thủy phân gỗ keo tai tượng enzym Mẫu 5: Dịch thủy phân gỗ keo tai tượng H2SO4 0,8%, 190-200°C; Trung hòa CaCO3 Ca(OH)2 đến pH 6,5-7 Mẫu 6: Dịch thủy phân gỗ keo tai tượng H2SO4 0,8%, 190-200°C; Trung hòa Ca(OH)2 đến pH 6,5-7 Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 62 Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Thị Hoa KẾT LUẬN Từ chủng vi khuẩn phân lập chọn chủng vi khuẩn D3 có khả lên men đường glucose xylose sinh ethanol Chủng vi khuẩn D3 thuộc loại vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hình que ngắn Kết hợp phương pháp phân loại truyền thống phương pháp sinh học phân tử xác định chủng vi khuẩn D3 thuộc giống Enterobacter ký hiệu Enterobacter sp.D3 Đã xác định điều kiện sinh trưởng chủng vi khuẩn D3 môi trường nhân giống cho lên men ethanol: Nhiệt độ 30oC; pH 6,5; thời gian nhân giống 24 Xác định điều kiện lên men ethanol chủng D3 nguồn đường tương ứng với nguồn đường chủ yếu có dịch thủy phân sinh khối thực vật xylose glucose: Nhiệt độ lên men 30÷35oC; pH 5,0÷6,5; lượng giống đưa vào lên men 5÷7%; hàm lượng ethanol sau 96h lên men đạt: Nguồn xylose: 0,25 %V; Nguồn glucose: 0,23 %V Đánh giá khả lên men chủng D3 dịch thủy phân từ gỗ cho thấy chủng vi khuẩn D3 có khả lên men dịch thuỷ phân từ gỗ KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả lên men hiệu dịch thủy phân sinh khối tạo chủng đột biến nhằm nâng cao hiệu suất lên men ethanol vi khuẩn Enterobacter sp D3 Đặc biệt xác định gen Xylose Dehydrogenase để tạo chủng tái tổ hợp có hiệu suất lên men cao Lớp cao học CNTP K810 - ĐHBKHN 63 ... hành nghiên cứu đề tài: Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng vi sinh vật lên men dịch thủy phân từ sinh khối thực vật Với nội dung sau: ¾ Tuyển chọn chủng có khả lên men đường pentoza... khả lên men sinh ethanol chủng vi khuẩn ¾ Đánh giá bước đầu khả lên men dịch thuỷ phân từ sinh khối thực vật (dịch thuỷ phân từ gỗ) chủng tuyển chọn Đề tài thực Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, ... (xyloza) ¾ Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn ¾ Phân loại định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn dựa đặc điểm sinh lý, sinh hóa trình tự gen 16S rARN ¾ Đánh giá khả lên men ethanol