BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGÔ THỊ DUY NGỌC NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME ALGINATE LYASE TỪ GAN TỤY ỐC BÀN TAY LAMBIS CHIRAGRA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS QUẢN LÊ HÀ PGS TS BÙI MINH LÝ HÀ NỘI - 2012 LỜI CAM ĐOAN Học viên: NGÔ THỊ DUY NGỌC Nơi đào tạo: Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn 1: PGS TS QUẢN LÊ HÀ Ngƣời hƣớng dẫn 2: PGS TS BÙI MINH LÝ Tên luận văn: Nghiên cứu thu nhận xác định số đặc tính enzyme alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu dƣới bảo thầy cô hƣớng dẫn giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang - Viện khoa học công nghệ Việt Nam Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Học viên Ngô Thị Duy Ngọc i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết xin gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến hai ngƣời thầy hƣớng dẫn luận văn cho tôi: Thầy Bùi Minh Lý, Viện trƣởng Viện Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang, Cô Quản Lê Hà, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ thực phẩm – Công nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình hƣớng dẫn, quan tâm tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ thực phẩm - Công nghệ sinh học, Viện Sau đại học, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội quý thầy cô nhiệt tình giảng dạy suốt thời gian học tập Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo toàn thể cán Viện Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập, đặc biệt tập thể cán Phòng Công nghệ sinh học biển, giúp đỡ tận tình suốt trình làm luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn tới ngƣời thân yêu gia đình bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, tháng 09 năm 2012 NGÔ THỊ DUY NGỌC ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC BẢNG ix LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 SƠ LƢỢC VỀ ALGINATE LYASE 1.1.1 Khái niệm polysaccharide lyase alginate lyase 1.1.2 Các nguồn thu nhận alginate lyase 1.1.3 Cấu trúc alginate lyase 1.1.4 Cơ chế xúc tác alginate lyase 10 1.1.5 Các đặc tính alginate lyase 13 1.1.6 Chức sinh học alginate lyase 16 1.1.7 Ứng dụng alginate lyase 17 1.2 GIỚI THIỆU VỀ ỐC BÀN TAY LAMBIS CHIRAGRA 19 1.2.1 Phân loại khoa học 19 1.2.2 Đặc điểm hình thái 20 1.2.3 Phân bố sinh thái ý nghĩa kinh tế 20 1.3 NGHIÊN CỨU THU NHẬN ALGINATE LYASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 21 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 iii 2.2 PHƢƠNG PHÁP 25 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25 2.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 26 2.2.2.1 Giai đoạn : Khảo sát trình trích ly 26 2.2.2.2 Giai đoạn 2: Tinh alginate lyase phƣơng pháp kết tủa 26 2.2.2.3 Giai đoạn 3: Tinh alginate lyase phƣơng pháp lọc gel 27 2.2.2.4 Giai đoạn 4: Xác định số đặc tính chế phẩm alginate lyase 28 2.2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.3.1 Xác định hoạt độ enzyme alginate lyase 29 2.2.3.3 Xác định khối lƣợng phân tử phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 TRÍCH LY ENZYME ALGINATE LYASE TỪ GAN TỤY ỐC BÀN TAY LAMBIS CHIRAGRA 35 3.1.1 Xác định tỷ lệ khối lƣợng gan tụy/ dung môi (w/v) cho trình trích ly enzyme alginate lyase 35 3.1.2 Xác định pH trích ly 36 3.1.3 Xác định nhiệt độ trích ly 37 3.1.4 Xác định thời gian trích ly 39 3.2 KHẢO SÁT TINH SẠCH ALGINATE LYASE BẰNG PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA 40 3.2.1 Tinh enzyme alginate lyase dịch chiết từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra dung môi hữu (ethanol acetone) 40 3.2.1.1 Kết tủa alginate lyase ethanol 40 3.2.1.2 Kết tủa alginate lyase acetone 42 3.2.2 Tinh enzyme aginate lyase dịch chiết từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra (NH4)2SO4 43 3.2.3 Kết luận chung 44 iv 3.3 KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TINH SẠCH ALGINATE LYASE BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL 46 3.3.1 Kết lọc gel enzyme qua kết tủa ethanol 20:80 46 3.3.2 Kết lọc gel enzyme qua kết tủa ammonium sulphate 70% 47 3.3.3 Kết luận chung 49 3.4 XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ 50 3.5 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ALGINATE LYASE 52 3.5.1 Xác định nhiệt độ phản ứng tối ƣu 52 3.5.2 Xác định pH phản ứng tối ƣu 53 3.5.3 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến độ ổn định hoạt tính chế phẩm 55 3.5.5 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến độ ổn định hoạt tính chế phẩm 56 3.5.6 Ảnh hƣởng ion kim loại 57 3.5.7 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl 58 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1 KẾT LUẬN 60 4.2 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 69 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate BSA Bovine serum albumin cs Cộng G Guluronate kDa Kilo Dalton M Mannuronate MW Molecular weight OD Optical density PL Polysaccharide lyase SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N, N, N‟, N‟-tetremethylethylenediamine v/v Volume/ volume w/v Weight/ volume vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1 Mô hình cấu trúc không gian (A) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) ALY1-III từ Sphingomonas sp thuộc họ PL-5 Hình 1.2 Mô hình cấu trúc không gian (C) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (D) A1-II‟ từ Sphingomonas sp A1 thuộc họ PL-7 Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian (A) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) Atu3025 từ Agrobacterium tumefaciens thuộc họ PL-15 Hình 1.4 Cấu trúc alginate 11 Hình 1.5 Sự phân cắt alginate (A) endo alginate lyase (B) exo alginate lyase 12 Hình 1.6 Ốc bàn tay Lambis chiragra 20 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25 Hình 2.2 Đƣờng chuẩn nồng độ β-D-mannuronate 30 Hình 2.3 Đƣờng chuẩn protein theo Lowry dùng BSA làm chuẩn 32 Hình 3.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ gan tụy/dung môi đến trình trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra 35 Hình 3.2 Ảnh hƣởng pH dung môi đến trình trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra 37 Hình 3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra 38 Hình 3.4 Ảnh hƣởng thời gian trích ly đến trình trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra 39 Hình 3.5 Hiệu suất thu hồi độ tinh dịch trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa ethanol 41 Hình 3.6 Hiệu suất thu hồi độ tinh dịch trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa acetone 42 vii Hình 3.7 Hiệu suất thu hồi độ tinh dịch trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa ammonium sulphate 43 Hình 3.8 So sánh hiệu suất thu hồi độ tinh alginate lyase sau tinh phƣơng pháp kết tủa tác nhân khác 45 Hình 3.9 Sắc ký đồ kết tinh alginate lyase với Sephadex G-75 chế phẩm tủa ethanol 46 Hình 3.10 Sắc ký đồ kết tinh alginate lyase với Sephadex G-75 chế phẩm tủa ammonium sulphate 48 Hình 3.11 So sánh hiệu suất thu hồi độ tinh alginate lyase sau tinh sắc ký lọc gel 50 Hình 3.12 Kết điện di enzyme alginate lyase 51 Hình 3.13 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra 52 Hình 3.14 Ảnh hƣởng pH phản ứng đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra 54 Hình 3.15 Độ bền hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra theo thời gian nhiệt độ khác 55 Hình 3.16 Độ bền hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra theo thời gian pH khác 56 Hình 3.17 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra 58 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1 Trình tự amino acid bảo thủ số chủng vi khuẩn Bảng 1.2 Trình tự amino acid bảo thủ đầu tận C nhóm alginate lyase có khối lƣợng phân tử 40 kDa Bảng 1.3 Trình tự amino acid bảo thủ đầu tận C nhóm alginate lyase có khối lƣợng phân tử 30 kDa Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi độ tinh alginate lyase qua giai đoạn tinh phƣơng pháp kết tủa ethanol kết hợp với sắc ký lọc gel 47 Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi độ tinh alginate lyase qua giai đoạn tinh phƣơng pháp kết tủa (NH4)2SO4 kết hợp với sắc ký lọc gel 49 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng ion kim loại 57 Bảng 3.1 Kết trích ly alginate lyase với yếu tố trích ly khác 69 Bảng 3.2 Kết tinh alginate lyase ethanol 69 Bảng 3.3 Kết tinh alginate lyase acetone 70 Bảng 3.4 Kết tinh alginate lyase ammonium sulphate 70 Bảng 3.5 Tổng kết trình tinh alginate lyase phƣơng pháp tủa 70 Bảng 3.6 Giá trị OD 280nm hoạt độ alginate lyase phân đoạn sau lọc gel (mẫu enzyme qua kết tủa ethanol Venzyme:Vethanol=20:80) 71 Bảng 3.8 Giá trị OD 280nm hoạt độ alginate lyase phân đoạn sau lọc gel (mẫu enzyme qua kết tủa (NH4)2SO4 70% độ bão hòa) 72 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase 73 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase 73 Bảng 3.12 Độ bền hoạt độ enzyme alginate lyase theo thời gian nhiệt độ khác 74 Bảng 3.13 Độ bền hoạt độ enzyme alginate lyase theo thời gian pH khác 75 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl 76 ix TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Hữu Phụng, Võ Sĩ Tuấn, Nguyễn Huy Yết (1994), “Phân bố nguồn lợi động vật Thân mềm kinh tế thuộc lớp chân bụng (Gastropoda) lớp hai mảnh vỏ (Bivalvia) ven biển Việt Nam”, Tuyển tập báo cáo khoa học Hội thảo động vật Thân Mềm toàn quốc lần thứ nhất, NXB nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh, 2001, trang: 27-60 Tài liệu tiếng Anh Alkawash M.A., Soothill J.S., Schiller N.L (2006), “Alginate lyase enhances antibiotic killing of mucoid Pseudomonas aeruginosa in biofilms”, APMIS, 114, pp 131-8 Beer L.L., Boyd E.S., Peters J.W., Posewitz M.C (2009), “Engineering algae for biohydrogen and biofuel production”, Curr Opin Biotechnol., 20, pp 264-71 Boyd A., Chakrabarty A.M (1994), “Role of alginate lyase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa”, Appl Environ Microbiol., 60, pp 2355-9 Boyen C., Kloareg B., Polne-Fuller M., Gibor A (1990), “Preparation of alginate lyases from marine molluscs for protoplast isolation in brown algae”, Phycology, 29, pp 173-81 Cotton L.A., Graham R.J., Lee R.J (2009), “The role of alginate in P aeruginosa PAO1 biofilm structural resistance to gentamicin and ciorofloxacin”, J Exp Microbiol Immunol., 13, pp 58-62 Elyakova L.A., Favarov V.V (1974), “Isolation and certain properties of alginate lyase VI from the mollusk Littorina sp.”, Biochim Biophys Acta, 358, pp 341-354 62 Erasmus J.H., Cook P.A., Coyne V.E (1997), “The role of bacteria in the digestion of seaweed by the abalone Haliotis midae”, Aquaculture, 155, pp 377-86 Fu X.T., Lin H., Kim S.M (2007), “Purification and characterization of a Na+/K+ dependent alginate lyase from turban shell gut Vibrio sp YKW-34”, Enzyme and Microbial Technology, 41, pp 828-34 10 Gacesa P (1987), “Alginate-modifying enzymes: A proposed unified mechanism of action for the lyases and epimerases”, FEBS Lett, 212, pp 199202 11 Gacesa P (1988), “Alginates”, Carbohydr Polym, 8, pp 161-82 12 Gimmestad M., Ertesvåg H., Heggeset T.M.B., Aarstad O., Svanem B.I.G., Valla S (2009), “Characterization of three new Azotobacter vinelandii alginate lyases, one of which is involved in cyst germination”, J Bacteriol., 191, pp 4845-53 13 Haraguchi K., Kodama T (1996), “Purification and properties of poly(β-Dmannuronate) lyase from Azotobacter chroococcum”, Appl Microbiol Biotechnol, 44, pp 576-81 14 Hata M., Kumagai Y., Rahman M.M., Chiba S., Tanaka H., Inoue A., Ojima T (2009), “Comparative study on general properties of alginate lyases from some marine gastropod mollusks”, Fisher Scientific, 75, pp 755-63 15 Heyraud A., Colin-Morel P., Girond S., Richard C., Kloareg B., (1996), “HPLC analysis of saturated or unsaturated oligoguluronates and oligomannuronates Application to the dete rmination of the action pattern of Haliotis tuberculata alginate lyase”, Carbohydrate Research, 291, pp 115-26 16 Iwamoto M., Kurachi M., Nakashima T., Kim D., Yamaguch K., Oda T., Iwamoto Y., Muramatsu T (2005), “Structure-activity relationship of alginate oligosaccharides in the induction ofcytokine production from RAW264.7 cells”, FEBS Lett., 579, pp 4423-9 63 17 Iwasaki K., Matsubara Y (2000), “Purification of alginate oligosaccharides with root growth promoting activity toward lettuce”, Biosci Biotechnol Biochem., 64, pp 1067-70 18 Kawada A., Hiura N., Tajima S., Takahara H (1999), “Alginate oligosaccharides stimulate VEGF-mediated growth and migration of human endothelial cells”, Arch Dermatol Res., 291, pp 542-7 19 Kim D.E., Lee E.Y., Kim H.S (2009), “Cloning and characterization of alginate lyase from a marine bacterium Streptomyces sp ALG-5”, Mar Biotechnol, 11, pp 10-6 20 Kim H.S., Lee C.G., Lee E.Y (2011), “Alginate lyase: Structure, property and application”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16(5), pp 843-51 21 Kitamikado M., Tseng C.H., Yamaguchi K., Nakamura T (1992), “Two types of bacterial alginate lyases”, Applied and Environment Microbiology, 58(8), pp 2474-8 22 Kobayashi T., Uchimura K., Miyazaki M., Nogi Y., Horikoshi K (2009), “A new high-alkaline alginate lyase from a deep-sea bacterium Agarivorans sp.”, Extremophiles, 13, pp 121-9 23 Kraiwattanapong J., Tsuruga H., Ooi T., Kinoshita S (1999), “Cloning and sequencing of a Delaya marina gen encoding for alginate lyase”, Biotechnol Lett., 21, pp 169-74 24 Kumagai Y., Ojima T (2010), “Isolation and characterization of two types of beta-1,3-glucanases from the common sea hare Aplysia kurodai”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 155, pp 138-44 25 Li J.B., Yu W.G., Feng H., Han W.J., Kai S (2003), “Purification and characterization of a novel alginate lyase from marine Vibrio sp QY102”, Acta Microbiologica Sinica, 43, pp 753-7 26 Li L., Jiang X., Guan H., Wang P., Guo H (2011), “Three alginate lyase from marine bacterium Pseudomonas fluorescens HZJ216: Purification and characterization”, Appl Biochem Biotechnol, 164, pp 305-17 64 27 Linhardt R.J., Galliher P.M., Cooney C.L (1986), “Polysaccharide lyases”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 12(2), pp 135-76 28 Lloret L., Barreto R., León R., Moreno S., Martínez-Salazar J., Espín G., Soberón-Chávez G (2006), “Genetic analysis of the transcriptional arrangement of Azotobacter vinelandii alginate biosynthetic genes: Identification of two independent promoters”, Mol Microbiol., 21, pp 44957 29 Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J (1951), “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, J Biol Chem., 193, pp 265-275 30 Madgwick J., Haug A., Larsen B (1973), “Alginate lyase in the brown alga Laminaria digitata (Huds.) Lamour”, Acta Chemica Scandinavica, 27(2), pp 711-2 31 Madgwick J., Haug A., Larsen B (1978), “Ionic requirements of alginatemodifying enzymes in the marine alga Pelvetia canaliculata (L.) Dcne et Thur.”, Botanica Marina, 21, pp 1-3 32 Muramatsu T., Egawa K (1982), “Chemical composition of alginate lyase from the mid-gut gland of Turbo cornutus and chemical modification of Cys, Trp and Lys residues”, Agric Biol Chem., 46, pp 883-9 33 Murata K., Inose T., Hisano T., Abe S., Yonemoto Y, et al (1993), “Bacterial alginate lyase : enzymeology, genetics and application”, J Ferment Bioeng., 76, pp 427-37 34 Nakada H.I., Sweeny P.C (1967), “Alginic acid degradation by eliminases from abalone hepatopancreas”, The Joural of Biological Chemistry, 242(5), pp 845-51 35 Nikapitiya C., Oh C., Whang I., Kim C.G., Lee Y.H., Kim S.J., Lee J (2009), “Molecular characterization, gene expression analysis and biochemical properties of α-amylase from the disk abalone Haliotis discus discus”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 152, pp 271-81 65 36 Nishida Y., Suzuki K., Kumagai Y., Tanaka H., Inoue A., Ojima T (2007), “Isolation and primary structure of a cellulase from the Japanese sea urchin Strongylocentrotus nudus”, Biochimie, 89, pp 1002-11 37 Nisizawa K., Fujibayashi S., Kashiwabara Y (1968), “Alginate lyases in the hepatopancreas of a marine mollusk Dolabella auricula Solander”, J Biochem (Tokyo), 64, pp 25–37 38 Ochiai A., Yamasaki M., Mikami B., Hashimoto W., Murata K (2006), “Crystallization and preliminary X-ray analysis ofan exotype alginate lyase Atu3025 from Agrobacterium tumefaciens strain C58, a member of polysaccharide lyase family 15”, Acta Cryst, 62, pp 486-8 39 Osawa T., Matsubara Y., Muramatsu T., Kimura M., Kakuta Y (2005), “Crystal structure of the alginate (poly-α-L-gulur-onate) lyase from Corynebacterium sp at 1.2 Å resolution”, J Mol Biol., 345, pp 1111-8 40 Porzio, M.A., Pearson, A.M (1977), “Improved resolution of myofibrillar proteins with sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis”, Biochim Biophys Acta, 490, pp 27–34 41 Rahman M.M., Inoue A., Tanaka H., Ojima T (2010), “Isolation and characterization of two alginate lyase isozymes, AkAly28 and AkAly33, from the common sea hare Aplysia kurodai”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 157, pp 317-25 42 Russell N.J., Gacesa P (1988), “Chemistry and biology of the alginate of mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis”, Mol Asp Med., 10, pp 1-91 43 Ryu M., Lee E.Y (2011), “Saccharification of alginate by using exolytic oligoalginate lyase from marine bacterium Sphingomonas sp MJ-3”, J Ind Eng Chem accepted 44 Sadasivam S., Manickam A (1995), “Biochemical methods”, New Delhi, New Age International Publishers, Chapter 1: Carbohydrates, pp 5-6 66 45 Sawabe T., Ohtsuka M., Ezura Y (1997), “Novel alginate lyase from marine bacterium Alteromonas sp strain H-4”, Carbohydrate Research, 304, pp 6976 46 Seiderer L.J., Newell R.C., Cook P.A (1982), “Quantitative signifi-cance of style enzymes from two marine mussels Choromytilus meridionalisand and Perna pernain in relation to diet”, Mar Biol Lett, 3, pp 257-72 47 Shimizu E., Ojima T., Nishita K (2003), “cDNA cloning of an alginate lyase from abalone Haliotis discus hannai”, Carbohydrate Research, 338, pp 284152 48 Shiraiwa Y., Abe K., Sasaki S.F., Ikawa T., Nisizawa K (1975), “Alginate lyase activities in the extracts from several brown algae”, Botanica Marina, 18, pp 97-104 49 Suzuki H., Suzuki K., Inoue A., Ojima T (2006), “A novel oligoalgi nate lyase from abalone, Haliotis discus hannai, that releases disaccharide from alginate polymer in an exolytic manner”, Carbohydrate Research, 341, pp 1809-19 50 Takeshita S., Sato N., Igarashi M., Muramatsu T (1993), “A highly denaturantdurable alginate lyase from a marine bacterium: purification and properties”, Biosci Biotechnol Biochem., 57, pp 1125-28 51 Vasudevan P.T., Briggs M (2008), “Biodiesel production-current state of the art and challenges”, J Ind Microbiol Biotechnol., 35, pp 421-30 52 Wang Y., Han F., Hu B., Li J., Yu W (2006), “In vivo prebiotic properties of alginate oligosaccharides prepared through enzymeatic hydrolysis of alginate”, Nutr Res., 26, pp 597-603 53 Wang Y.H., Yu G.L., Wang X.M., Lv Z.H., Zhao X., Wu Z.H., Ji W.S (2006), “Purification and characterization of alginate lyase from marine Vibrio sp YWA”, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 38(9), pp 633-8 54 Watanabe T., Nisizawa K (1982), “Enzymeatic studies on alginate lyase from Undaria pinnatifida in relation to texture-softening prevention by ash67 treatment (Haiboshi)”, Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 48, pp 243-49 55 Wong T.Y., Preston L.A., Schiller N.L (2000), “Alginate lyase: Review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and application”, Annual Review of Microbiology, 54, pp 289-340 56 Yamamoto Y., Kurachi M., Yamaguchi K., Oda T (2007), “Stimulation of multiple cytokine production in mice by alginate oligosaccharides following intraperitoneal administration”, Carbohydr Res., 342, pp 1133-7 57 Yamasaki M., Ogura K., Hashimoto W., Mikami B., Murata K (2005), “A structural basis for depolymerization of alginate by polysaccharide lyase family-7”, J Mol Biol., 352, pp 11-21 58 Yonemoto Y., Tanaka H., Yamashita T., Kitabatake N., Ishida Y., Kimura A., Murata K (1993), “Promotion of germination and shoot elongation of some plants by alginate oligomers preparedwith bacterial alginate lyase”, J Ferment Bioeng., 75, pp 68-70 59 Yoon H.J., Mikami B., Hashimoto W., Murata K (1999), “Crystal structure of alginate lyase A1-III from Sphingomonas species A1 at 1.78 A resolution”, J Mol Biol., 290, pp 505-14 60 Zahura U.A., Rahman M.M., Inoue A., Tanaka H., Ojima T (2010), “An endo-β-1,4 mannanase, AkMan, from the common sea hare Aplysia kurodai”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 157, pp 137-43 61 Zhou M., Han F., Li J., Zhao X (2008), “Isolation and identification of a novel alginate-degrading bacterium, Ochrobactrum sp.”, Songklanakarin J Sci Technol., 30(2), pp 135-40 68 PHỤ LỤC Bảng 3.1 Kết trích ly alginate lyase với yếu tố trích ly khác Tổng hoạt độ alginate lyase (U) Yếu tố trích ly Tỷ lệ trích ly (w/v) pH trích ly Nhiệt độ trích ly (oC) Thời gian trích ly (phút) 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 10 Nƣớc cất 20 30 40 50 60 15 30 45 60 90 88,92 120,21 175,10 141,79 75,50 110,52 112,60 113,65 178,23 271,98 220,94 191,77 173,02 175,10 273,02 274,06 216,77 76,15 244,90 275,10 282,40 287,60 288,65 Bảng 3.2 Kết tinh alginate lyase ethanol Tỷ lệ Tổng protein Venzyme/ Vethanol 10:90 20:80 30:70 40:60 50:50 60:40 (mg) 33,62 31,91 30,16 13,11 6,01 2,71 Enzyme thô 63,45 Tổng hoạt độ Hiệu suất Hoạt độ riêng alginate lyase thu hồi (U) (U/mg protein) (%) 229,25 6,820 80,00 242,14 7,587 84,50 196,12 6,503 68,44 66,34 5,058 23,15 22,78 3,794 7,95 8,31 3,071 2,90 286,56 69 4,516 100 Độ tinh (lần) 1,51 1,68 1,44 1,12 0,84 0,68 Bảng 3.3 Kết tinh alginate lyase acetone Tỷ lệ Tổng protein Venzyme/ Vacetone 10:90 20:80 30:70 40:60 50:50 60:40 (mg) 42,98 44,70 36,76 22,22 7,33 6,74 Enzyme thô 63,45 Tổng hoạt độ Hiệu suất Hoạt độ riêng alginate lyase thu hồi (U) (U/mg protein) (%) 211,60 4,923 73,84 230,14 5,149 80,31 225,78 6,142 78,79 101,36 4,561 35,37 25,48 3,478 8,89 19,49 2,890 6,80 286,56 4,516 Độ tinh (lần) 1,09 1,14 1,36 1,01 0,77 0,64 100 Bảng 3.4 Kết tinh alginate lyase ammonium sulfate Độ bão hòa (NH4)2SO4 (%) 100% 90% 80% 70% 60% 50% (mg) 31,05 29,99 28,32 27,33 28,00 16,60 Tổng hoạt độ alginate lyase (U) 239,79 235,67 231,48 228,39 192,20 77,97 40% 14,90 47,77 7,723 7,858 8,175 8,355 6,865 4,697 3,207 Enzyme thô 63,45 286,56 4,516 Tổng protein Hoạt độ riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) 83,68 82,24 80,78 79,70 67,07 27,21 Độ tinh (lần) 1,71 1,74 1,81 1,85 1,52 1,04 16,67 0,71 100 Bảng 3.5 Tổng kết trình tinh alginate lyase phƣơng pháp tủa Tác nhân kết tủa Hoạt độ riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh (lần) 7,587 6,142 84,50% 78,79 1,68 1,36 8,355 79,7% 1,85 Dung môi hữu - Ethanol (Venzyme:Vethanol=20:80) - Acetone (Venzyme:Vacetone=30:70) Muối vô - (NH4)2SO4 70% độ bão hòa 70 Bảng 3.6 Giá trị OD 280nm hoạt độ alginate lyase phân đoạn sau lọc gel (mẫu enzyme qua kết tủa ethanol Venzyme:Vethanol=20:80) Phân đoạn OD 280nm Hoạt độ alginate lyase (U/ml) Phân đoạn OD 280nm Hoạt độ alginate lyase (U/ml) 01 0,033 26 0,207 1,539 02 0,035 27 0,168 1,107 03 0,035 28 0,098 0,238 04 0,037 29 0,086 05 0,038 30 0,081 06 0,068 31 0,079 07 0,122 32 0,077 08 0,178 33 0,077 09 0,232 34 0,076 10 0,152 35 0,083 11 0,121 36 0,097 12 0,088 37 0,096 13 0,058 38 0,134 14 0,055 39 0,123 15 0,055 40 0,091 16 0,052 41 0,066 17 0,052 42 0,063 18 0,069 0,158 43 0,059 19 0,139 0,631 44 0,055 20 0,239 1,796 45 0,054 21 0,340 2,840 46 0,054 22 0,380 3,669 47 0,051 23 0,374 3,588 48 0,049 24 0,362 3,418 49 0,046 25 0,298 2,420 50 0,047 71 Bảng 3.8 Giá trị OD 280nm hoạt độ alginate lyase phân đoạn sau lọc gel (mẫu enzyme qua kết tủa (NH4)2SO4 70% độ bão hòa) Phân đoạn OD 280nm Hoạt độ alginate lyase (U/ml) Phân đoạn OD 280nm Hoạt độ alginate lyase (U/ml) 01 0,011 26 0,259 3,338 02 0,013 27 0,271 3,506 03 0,013 28 0,228 2,904 04 0,015 29 0,165 2,022 05 0,016 30 0,117 1,350 06 0,017 31 0,075 0,762 07 0,018 32 0,061 0,566 08 0,033 33 0,05 09 0,052 34 0,041 10 0,072 35 0,037 11 0,089 36 0,043 12 0,094 37 0,058 13 0,087 38 0,078 14 0,062 39 0,075 15 0,042 40 0,059 16 0,032 41 0,045 17 0,031 42 0,033 18 0,029 43 0,03 19 0,03 44 0,028 20 0,031 45 0,025 21 0,029 46 0,025 22 0,039 47 0,021 23 0,056 0,496 48 0,018 24 0,115 1,322 49 0,015 25 0,187 2,330 50 0,013 72 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase Nhiệt độ o C Hoạt độ riêng (U/mg protein) 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10,66 14,51 18,14 20,86 22,68 18,82 13,15 9,98 6,12 Hoạt độ tƣơng đối (% so với hoạt độ cực đại) 47 64 80 92 100 83 58 44 27 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase pH Hoạt độ riêng (U/mg protein) 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 4,04 5,71 8,80 15,22 20,93 23,78 23,07 19,03 14,03 9,99 8,80 Hoạt độ tƣơng đối (% so với hoạt độ cực đại) 17 24 37 64 88 100 97 80 59 42 37 73 Bảng 3.12 Độ bền hoạt độ enzyme alginate lyase theo thời gian nhiệt độ khác Nhiệt độ Thời gian (phút) Đối chứng 20 40 60 120 180 240 20 40 60 120 180 240 20 30 40 50 60 Hoạt độ alginate lyase U/mg protein % 26,12 100 25,43 97,36 25,00 95,73 24,64 94,32 23,36 89,44 18,94 72,51 17,06 65,32 25,28 96,78 24,83 95,07 23,62 90,44 21,88 83,77 18,33 70,18 15,31 58,61 20 24,19 92,6 40 60 120 180 240 20 40 60 120 180 240 20 40 60 120 180 240 23,70 22,76 20,42 15,70 13,60 23,05 19,88 13,36 9,68 5,82 4,25 8,06 2,51 1,80 1,33 0,98 0,73 90,73 87,14 78,19 60,09 52,07 88,26 76,12 51,16 37,05 22,28 16,28 30,86 9,61 6,89 5,10 3,75 2,80 74 Bảng 3.13 Độ bền hoạt độ enzyme alginate lyase theo thời gian pH khác pH 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 Thời gian (phút) 20 40 60 120 180 240 20 40 60 120 180 240 20 40 60 120 180 240 Hoạt độ alginate lyase U/mg protein % 25,17 100,00 23,83 94,66 22,12 87,88 18,85 74,90 13,67 54,31 10,02 39,82 7,58 30,12 27,31 100,00 26,68 97,68 25,59 93,70 24,63 90,18 22,95 84,02 19,36 70,89 16,72 61,23 26,09 100,00 24,70 94,66 23,89 91,58 22,93 87,88 19,54 74,90 17,82 68,32 15,84 60,72 22,4 100,00 20 40 60 120 180 240 20 40 60 120 180 240 17,99 14,51 12,74 10,54 8,18 6,22 18,52 11,47 7,02 3,99 2,83 1,47 0,77 75 80,33 64,79 56,89 47,05 36,50 27,78 100,00 61,92 37,88 21,57 15,29 7,92 4,17 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl Nồng độ NaCl Hoạt độ riêng (U/mg protein) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 18,35 32,57 43,58 44,96 45,88 44,50 41,29 37,62 35,32 Hoạt độ tƣơng đối (% so với hoạt độ cực đại) 40 71 95 98 100 97 90 82 97 76 ... tinh alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra - Xác định số tính chất chế phẩm alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra  Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Đây nghiên cứu. .. chiragra thể hoạt tính phân giải alginate tƣơng đối tốt Chính vậy, tiến hành thực đề tài Nghiên cứu thu nhận xác định số đặc tính enzyme alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra Hiện... MINH LÝ Tên luận văn: Nghiên cứu thu nhận xác định số đặc tính enzyme alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu dƣới bảo thầy