BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐINH THỊ THU TRANG ĐỀ TÀI:NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GEN Mà HÓA ENZYM FIBRINAZA CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ ĐẬU TƯƠNG LÊN MEN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.NGUYỄN LAN HƯƠNG HÀ NỘI - 2010 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Mục lục Mục lục Lời mở đầu Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Fibrin I.1.1 Cơ chế hình thành fibrin thể .8 I.1.2 Cơ chế phân hủy Fibrin thể người 12 I.2 Enzym fibrinaza……………………………………………………………14 I.2.1 Cấu tạo tính chất 14 I.2.2 Cơ chế tác động Fibrinaza .15 I.3 Các vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme Fibrinaza .16 I.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzym Fibrinaza giới Việt Nam .20 I.5 Sử dụng kỹ thuật gen vào nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp 22 I.5.1 Vector tách dòng .22 I.5.2 Tế bào chủ .24 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 II.1 Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị sử dụng .26 II.1.1 Chủng vi khuẩn 26 II.1.2 Vector pET22b(+) 26 II.1.3 Môi trường .27 II.1.4 Hóa chất .28 II.1.5 Thiết bị sử dụng .28 II.2 Phương pháp nghiên cứu .29 II.2.1 Phương pháp vi sinh vật 29 II.2.3 Phương pháp hóa sinh 31 II.2.4 Điện di DNA gel agarose 34 II.2.5 Tách chiết DNA vi khuẩn 35 Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang II.2.6 Phương pháp khuyếch đại DNA phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction- PCR) .36 II.2.7 Xử lý DNA enzyme giới hạn 39 II.2.8 Ghép nối DNA 40 II.2.9 Biến nạp vector tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E.coli phương pháp sốc nhiệt 41 II.2.10 Tách chiết tinh DNA plasmid 42 II.2.11 Kiểm tra plasmid mang sản phẩm PCR mong muốn 44 Chương III .45 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 III.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fibrinaza 45 III.2 Định tên chủng vi khuẩn nghiên cứu 48 III.3 Nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza .52 III.3.1 Tách DNA vi khuẩn 52 III.3.2 Nhân đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza 53 III.3.3 Xử lý sản phẩm PCR enzym giới hạn 55 III.3.4 Ghép nối gen mã hóa enzym fibrinaza vector pET-22b(+) 56 III.3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli phương pháp sốc nhiệt .57 III.3.6 Chọn lọc dòng pET-22b(+) mang gen mã hóa fibrinaza 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .62 Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Danh mục kí hiệu chữ viết tắt Amp Ampicilin Bp Cặp bazơ dNTP Deoxynucleoside triphosphate DNA Deoxynucleic acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethidium bromide Kb kilo bazơ LB Luria – Bertani PCR Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction) RNA Ribomuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris – acetate - EDTA TE Tris - EDTA tPA Tissue – type plasminogen activator (chất hoạt hóa plasminogen mô) uPA Urokinase – type plasminogen activator (Chất hoạt hóa urokinase) Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Danh mục bảng Bảng 1.1: Vi khuẩn Bacillus sp phân lập từ số thực phẩm lên men truyền thống Bảng 1.2 Đặc tính số enzym fibrinaza sinh tổng hợp từ vi sinh vật Bảng 1.3 Bảng 2.1 Thành phần cấu tạo vector pET-22b(+) Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại gen Bảng 2.3 Chế độ nhiệt cho phản ứng PCR Bảng 2.4 Thành phần phản ứng xử lý plasmid enzym giới hạn Bảng 2.5 Thành phần phản ứng xử lý sản phẩm PCR enzym giới hạn Bảng 3.1 Khả lên men chủng nghiên cứu Bảng 3.2 Hoạt lực enzym tách chiết từ chủng phương pháp đo vòng thủy phân phương pháp so màu Bảng 3.3 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Danh mục hình Hình 1.1: Các sợi fibrin làm đông tụ máu Hình 1.2 Quá trình hình thành fibrin Hình 1.3 Cấu trúc vòng xoắn nattokinase Hình 2.1 Vector pET-22b(+) Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng nghiên cứu Hình 3.2 Kết định tên Kit API 50CHB chủng T19, T21 T23 Hình 3.3 DNA tổng số M1 Hình 3.4 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza chủng M, T19, T21 T23 Hình 3.5 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza chủng M1 Hình 3.6 Kết xử lý enzym giới hạn Hình 3.7 Kết tinh plasmid Hình 3.8 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli Hình 3.9 Chọn dòng pET-22b(+) mang gen ngoại lai mã hóa enzym fibrinaza Hình 3.10 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme fibrinaza phương pháp xử lý enzyme giới hạn Hình 3.11 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme fibrinaza kỹ thuật PCR Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Lời mở đầu Trong năm gần đây, bệnh tim mạch nguyên nhân hàng đầu gây tử vong giới Theo tổ chức Y tế giới (WHO), giây có người chết bệnh tim mạch, giây có trường hợp nhồi máu tim giây có trường hợp đột quỵ [46] Nguyên nhân bệnh cân hai trình: trình đông tụ máu trình hòa tan cục máu đông, thể có tới 20 loại enzym gây đông máu có loại có khả phá vỡ cục máu đông plasmin [34] Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi khoa hóa sinh trường đại học Dược Chicago (Mỹ) cộng phát loại enzym có khả thủy phân fibrin (nguyên nhân gây đông máu) vi khuẩn Bacillus trình lên men đậu tương tiết Đó enzym fibrinaza, enzym chiết xuất từ đậu tương lên men truyền thống Nhật Bản - Natto nên gọi Nattokinase Ở nước ta, theo thống kê Bộ y tế bệnh viện nước năm gần cho thấy, tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong bệnh tim mạch cao Một số hãng dược phẩm nước Mỹ Nhật Bản đưa thị trường số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Nattokinase, NattoK, Fibrinaza… nhiên sản phẩm thường đắt so với thu nhập người dân Việt Nam Tính đến gới có nhiều nghiên cứu sâu vào lựa chọn chủng vi sinh vật sinh enzym fibrinaza nghiên cứu đặc điểm enzym Bên cạnh để thu enzym fibrinaza có hoạt lực cao việc nghiên cứu để tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym fibrinaza cần thiết Tuy nhiên nước ta nghiên cứu dừng lại việc phân lập tối ưu điều kiện sinh trưởng số chủng sinh tổng hợp enzym fibrinaza, chưa có nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp enzym Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương dồi điều kiện thuận lợi để tiến hành nghiên cứu nhằm tạo sản phẩm mang thương hiệu Việt Nam Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài ”Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzym fibrinaza số chủng vi khuẩn phân lập từ đậu tương lên men” Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Fibrin Fibin loại protein dạng sợi polyme hóa để tạo thành dạng lưới bao quanh vết thương có tác dụng cầm máu Nó tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay gọi fibrinogen nhờ hoạt động thrombin Khi đó, fibrin tạo thành liên kết với nhân tố VIII để tạo thành cục máu Ngoài ra, fibrin tham gia vào số trình sinh học thể như: truyền tín hiệu, đông tụ máu mạch máu polyme hóa protein…[34] Hình 1.1: Các sợi fibrin làm đông tụ máu [44] I.1.1 Cơ chế hình thành fibrin thể Khi thể bình thường fibrin tồn dạng tiền chất hoạt tính, dạng fibrinogen Khi thể bị tổn thương, dạng tiền chất fibrinogen hòa tan máu chuyển hóa thành fibrin không hòa tan máu tạo nên cục máu đông bịt kín chỗ tổn thương cách vững Quá trình có tham gia Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang thành phần gây đông máu có huyết tương theo hai đường nội sinh ngoại sinh Fibrinogen loại glycoprotein 340-HD sinh tổng hợp gan có nồng độ khoảng 1,5 ÷4,0 g/l huyết tương Do người bệnh suy gan mắc bệnh di truyền liên quan đến gen nhiễm sắc thể số dẫn đến việc giảm nồng độ chất lượng fibrinogen gây bệnh trầm kha máu Fibrinogen đóng vai trò việc tạo cầu nối sợi tơ huyết việc kết hợp protein bề mặt GbIIb/IIIa chúng lại với hình thành fibrin để cầm máu [34] Fibrinogen có cấu trúc đối xứng cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta gramma) Trên chuỗi alpha beta có trình tự peptit ngắn gọi fibrinopeptit Chính chuỗi peptit ngắn cản trở việc fibrinogen bị polyme hóa cách tùy tiện [34] ™ Một số yếu tố tham gia vào trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin - Nhóm yếu tố tiếp xúc: gồm yếu tố XI, XII, prekallikrein Các yếu tố thuộc nhóm hoạt động không cần có mặt ion Ca2+ vitamin K - Nhóm yếu tố prothrombin: gồm yếu tố II, VII, IX, X Đặc điểm chung nhóm cần có mặt vitamin K để yếu tố gắn với ion Ca - Nhóm fibrinogen: gồm fibrinogen, V, VIII, XIII Nhóm chịu tác dụng thrombin, bền vững Tên số yếu tố tham gia vào trình đông máu: + Yếu tố I: fibrinogen + Yếu tố 2: prothrombin + Yếu tố 3: throboplastin mô + Yếu tố IV: ion Ca2+ + Yếu tố V: proacceletin Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Hình 3.3 DNA tổng số chủng vi khuẩn Giếng 1: Chủng M1 Giếng 2: Chủng T19 Giếng 3: Chủng T21 Giếng 4: Chủng T23 Kết điện di cho thấy: băng DNA tổng số chủng M1 có kết sáng rõ nét so với chủng lại Các băng DNA tổng số tách chiết cho kết rõ nét, không bị đứt gãy, băng gọn, đủ điều kiện để tiến hành thí nghiệm III.3.2 Nhân đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza Sử dụng DNA tổng số tách chiết làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu, chu trình nhiệt (mô tả phần phương pháp) để tiến hành phản ứng nhân gen mã hóa enzym fibrinaza Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết điện di thể hình 3.4 3.5: Khoa Công nghệ Sinh học 53 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Hình 3.4 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza chủng M1, T19, T21 T23 Kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu có kích thước phân tử khoảng 1,1 kb kích thước phù hợp với kích thước tính toán thiết kế cặp mồi Tuy nhiên, kết điện di hình 3.4 cho thấy sản phẩm PCR chủng T19, T21 T23 băng điện di mờ có nhiều sản phẩm phụ Hình 3.5 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza chủng M1 Băng điện di sản phẩm PCR chủng M1 cho kết sáng, đậm, rõ nét Sở dĩ có kết thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR thiết Khoa Công nghệ Sinh học 54 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang kế dựa vào trình tự gen mã hóa enzym fibrinaza chủng vi khuẩn Bacillus subtillis natto công bố ngân hàng gen Vì chủng phân lập từ tương Bần Việt Nam chứa trình tự khác biệt so với chủng phân lập từ natto nên cặp mồi, thành phần phản ứng hay chu trình nhiệt chưa phù hợp cho kết không mong muốn Do để đảm bảo chất lượng nghiên cứu tách dòng lựa chọn chủng M1 làm nguyên liệu cho thí nghiệm Sản phẩm PCR chủng M1 tinh trước sử dụng để tiến hành ghép nối gen III.3.3 Xử lý sản phẩm PCR enzym giới hạn Sau thu sản phẩm PCR, tiến hành chiết làm sản phẩm qua cột theo kit Invitrogen Sau tinh sạch, mẫu sản phẩm PCR xử lý hai enzym giới hạn EcoRI SalI Thành phần tình xử lý trình bày mục II.2.7 Phản ứng kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết xử lý enzym giới hạn thể hình 3.6 M: Marker 1kb Giếng 2: Sản phẩm PCR xử lý với EcoRI SalI Giếng 3: Plasmid cắt EcoRI SalI Giếng 4: Plasmid pET-22b(+) Hình 3.6 Kết xử lý enzym giới hạn Khoa Công nghệ Sinh học 55 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Kết điện di hình 3.6 cho thấy plasmid cắt mở vòng enzym giới hạn chưa loại RNA sản phẩm cắt tương đối PCR đủ điền kiện tiến hành phản ứng ghép nối Sản phẩm PCR plasmid xử lý enzym giới hạn tinh phương pháp gel loại RNA để thực tiếp phản ứng ghép nối gen Kết tinh plasmid thể hình 3.7 đây: Hình 3.7 Kết tinh plasmid Giếng 1: Plasmid xử lý enzym giới hạn tinh Giếng 2: Plasmid pET-22b(+) Qua kết điện di hình 3.7, nhận thấy sản phẩm plasmid xử lý enzym giới hạn tinh loại hết RNA Sản phẩm đủ điều kiện để thực phản ứng ghép nối III.3.4 Ghép nối gen mã hóa enzym fibrinaza vector pET-22b(+) Chúng tiến hành ghép nối đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza vector pET-22b(+) để tạo vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym fibrinaza Do sản phẩm PCR vector xử lý hai enzym giới hạn nên tác dụng enzym T4 ligase, sản phẩm PCR vector nối lại với tạo vector tái Khoa Công nghệ Sinh học 56 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang tổ hợp Thành phần phản ứng ghép nối vector sản phẩm PCR trình bày mục II.2.8 Phản ứng ghép nối tiến hành qua đêm 22ºC III.3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli phương pháp sốc nhiệt Sản phẩm lai vector sản phẩm PCR biến nạp tế bào chủ E coli chủng BL21 phương pháp sốc nhiệt phút 42ºC Các tế bào sau nuôi cấy môi trường LB có bổ sung Ampicillin (50mg/ml) 37ºC qua đêm Kết quả, thu nhiều khuẩn lạc có màu trắng (hình 3.8) Hình 3.8 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli Do môi trường có chất kháng sinh nên có tế bào mang vector mọc được, dòng tế bào vi khuẩn gồm hai loại tế bào khác nhau: loại tế bào mang vector không mang đoạn gen chèn vào loại tế bào mang vector cài đoạn gen mong muốn vào Vì để xác định dòng tế bào mang vector tái tổ hợp, tiến hành sàng lọc thông qua tách chiết plasmid, xử lý enzym giới hạn thực phản ứng PCR để nhân gen mã hóa fibrinaza Khoa Công nghệ Sinh học 57 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang III.3.6 Chọn lọc dòng pET-22b(+) mang gen mã hóa fibrinaza ™ Tách chiết DNA plasmid Plasmid tách chiết nhằm xác định vector mang đoạn gen chèn vào vector không mang gen Phương pháp tách plasmid trình bày mục II.2.10 Để tách chiết DNA plasmid, số khuẩn lạc nuôi cấy môi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicilin 37ºC từ 12 đến 14 Phương pháp tách chiết plasmid gồm bước chính: thu nhận phân giải tế bào, làm plasmid kết tủa DNA Theo lý thuyết DNA plasmid mang gen ngoại lai, chúng có kích thước tổng kích thước plasmid kích thước gen ngoại lai Do điện di đồ, chúng chạy chậm (thấp hơn) so với đối chứng âm (các plasmid chưa mở vòng), dựa vào kết luận sơ plasmid có kích thướng lớn chúng mang gen ngoại lai Hình 3.9 Chọn dòng pET-22b(+) mang gen ngoại lai mã hóa enzym fibrinaza Giếng 1: Đối chứng âm, pET-22b(+) Giếng 2: Plasmid mang gen ngoại lai Kết điện di cho thấy, plasmid chọn chạy chậm plasmid đối chứng Điều chứng tỏ plasmid gắn gen thành công Khoa Công nghệ Sinh học 58 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Để chứng minh xác xem đoạn xen vào plasmid có phải đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza hay không, tiếp tục kiểm tra enzym hạn chế tiến hành làm phản ứng PCR để kiểm tra ™ Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza xử lý enzyme giới hạn Hai enzym giới hạn EcoRI SalI sử dụng để tạo đầu bổ sung cho vector đoạn gen chèn vào nên để kiểm tra, sử dụng hai enzym nhằm kiểm tra dòng chọn có mang đoạn chèn hay không Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm xử lý enzym plasmid tái tổ hợp bao gồm hai đoạn gen, đoạn có kích thước tương ứng với vector gốc (vector mở vòng) đoạn có kích thước tương ứng với đoạn chèn vào (gen mã hóa enzym fibrinaza) Sản phẩm xử lý enzym điện di gel agarose 1% Kết xử lý vector tái tổ hợp enzym giới hạn thể hình 3.10 Hình 3.10 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme fibrinaza phương pháp xử lý enzyme giới hạn M : Marker 1kb Giếng 2: Plasmid tái tổ hợp xử lý enzym giới hạn Giếng 3: Sản phẩm PCR xử lý enzym giới hạn Khoa Công nghệ Sinh học 59 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Kết cho thấy, sau xử lý vector tái tổ hợp hai enzym giới hạn, thu hai băng có kích thước khác nhau, băng có kích thước khoảng 5,5kb (ứng với vector pET-22b(+)), băng có kích thước xấp xỉ 1,1kb ứng với gen mã hóa fibrinaza Như vậy, sơ kết luận chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen phù hợp với đoạn gen chèn vào ™ Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym fibrinaza kỹ thuật PCR Để khẳng định lại dòng plasmid tái tổ hợp chọn có mang đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza, tiến hành phản ứng PCR với việc sử dụng plasmid chọn làm khuôn để nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza với cặp mồi đặc hiệu Kết PCR trình bày hình 3.11 đây: Hình 3.11 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym fibrinaza kỹ thuật PCR M : Marker 1kb Giếng 2: Sản phẩm CR gen mã hóa fibrinaza Giếng 3: Sản phẩm PCR vector tái tổ hợp Khoa Công nghệ Sinh học 60 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR dòng mang kiểm tra xuất băng với kích thước 1,1kb, với kích thước đoạn gen cài vào Như vậy, dòng chọn làm khuôn phản ứng PCR có khả mang đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza Để kết luận xác đoạn gen cài vào đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza cần tiến hành giải trình tự đoạn gen tách từ dòng tái tổ hợp so sánh với trình tự công bố Ngân hàng Gen quốc tế Do thời gian nghiên cứu có hạn nên chưa thực việc Từ kết thu được, bước đầu tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym fibrinaza Khoa Công nghệ Sinh học 61 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Trong chủng vi khuẩn nghiên cứu thấy chủng phân lập từ natto có hoạt lực fibrinaza cao hơn chủng phân lập từ tương Chủng M1 có hoạt lực cao sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu tách dòng Đồng thời, thấy chủng phân lập từ tương Bần có hoạt tính fibrinaza cao Ba chủng phân lập từ tương Bần (T19, T23, T21) trực khuẩn, gram dương Dựa kết hình thái tế bào, khuẩn lạc số đặc điểm sinh hóa sơ định tên chủng sau: T19 T23 chủng Bacillus subtilis T21 chủng Bacillus amyloliquefacien Các chủng có khả lên men đậu tương tạo enzyme fibrinaza, làm tiền đề cho nghiên cứu Bước đầu tạo dòng vector tái tổ hợp pET -22b(+) mang đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza có kích thước khoảng 1,1kb Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu để biểu đoạn gen mã hóa enzyme fibrinaza biển vi khuẩn E coli chủng BL21 - Tối ưu hóa trình biểu gen mã hóa fibrinaza vector biểu thiết kế nhằm thu hàm lượng enzyme cao - Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn phân lập từ Việt Nam có hoạt tính fibrinaza nhằm tạo chủng có khả tạo enzym lớn phù hợp với điều kiện Việt Nam Khoa Công nghệ Sinh học 62 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Văn Cách (2005), Tin sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng biểu mini-proinsulin người tái tổ hợp Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr 155-160 Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2005), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lí ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh (1997), Thí nghiệm hóa sinh công nghiệp, Viện công nghệ sinh học thực phẩm, môn hóa sinh, trường đại học Bách Khoa – Hà Nội Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm (2006), Thí nghiệm vi sinh công nghiệp, Trường Đại học Bách Khoa, Hà Nội Nguyễn Lan Hương, Hà Thị Phương, Phạm Quốc Luân (2010) Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme nattokinaza từ số thực phẩm đậu tương lên men Tạp chí khoa học công nghệ trường đại học kỹ thuật (Đã chấp nhận đăng) Tiếng Anh Astrup, T., Sterndorff (1953), “A fibrinolytic system in human milk”, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 84, pp 605- 608 Axelsson F (1995), “Plasminogen”, Product monograph 10 Bergstrom K., Blombakc B., Kleen G., (1960), Studies on the plasma fibrinolytic activity in a case of liver cirrhosis, Acta Med Khoa Công nghệ Sinh học 63 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang 11 Chiang, C.J., Chen, H C., Chao, Y P., & Tzen (2005), “Efficient system of artificial oil bodies for functional expression and purification of recombinant nattokinase in Escherichia coli“, Journal of Agriciltural and Food Chemistry 53, pp 4799- 4804 12 Choi, N S., Chang, K T., Maeng, P.J., & Kim, S H (2004), “Cloning, expression, and fibrin (ogen)olytic properties of a subtilisin DJ-4 gene from Bacillus sp”, DJ-4 FEMS Microbiology Letters 236, pp 325- 331 13 Demaerschalk B.M., Yip T.R (2005), “Economic benefit of increasing utilization of intravenous tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke in the United States”, Stroke 36, pp 2500- 2503 14 Fayek, K I and S.T El-sayde (1980), “Fibrinolytic activity of an enzym produced by Bacillus subtilis”, Z Enaehrwiss, 19, 21-23 15 Fujita M., Nomura K., Hong K., Ito Y., Asada A and Nishimuro S (1993), “Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme in vegetable cheese, a popular soybean fermented food in Japan”, Biochem Biophys Res Coommun 3, pp 197 16 Fujita M., Hong K., Ito Y., Fujii R., Kariya K., Nishimuro S (1995), “Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat”, Biol Pharm Bull 10, pp 1378 – 1391 17 IkemurJeong SJ, Kwon GH, Chun J, Kim JS, Kwon DY, Kim JH (2007), “Cloning of fibrinolytic enzyme gene from Bacillus subtilis isolated from Cheonggukjang and its expression in protease deficient Bacillus subtilis strain”, J Microbiol Biotechnol 17, pp 1018-1023 18 a, H., Takagi, H., & Inouye (1987), ”Requirement of pro-sequence for the production of ative subtilisin E in Escherichia coli”, The Journal of Biological Chemistry 262, pp 7859 – 7864 19 Kim, S H., Choi (2000), “Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp strain DJ-4 screened from Doen-Jang” Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 64, pp 1722- 1725 Khoa Công nghệ Sinh học 64 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang 20 Kim, W., Choi, K., Kim, Y., Park, H., Choi, J., Lee, Y., Oh, H., Kwon, I., Lee (1996), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from chungkook-jang”, Applied and Environmental Microbiology 62, pp 2482- 2488 21 Liang X B, Zhang L X, Zhong J, Huan L D (2007), “Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactics”, Applied Microbiology and Biotechnology 75, pp 95 – 101 22 Luo L X Huang Z L, Pan L, Yang R D, Liang S Z (2003), “Expression of nattokinase gene in yeast Pichia pastoris”, Chinese Journal of Applied & Enviromental Biology 31, pp – 23 Maruyama M., Sumi H (1995), “Effect pf fermented soybean Diet on Blood Pressure”, JTTZAS 24 M W Mosesson (2005), “Fibrinogen and fibrin structure and functions”, Journal of Thrombosis and Haemostasis 3, pp 1894-1904 25 Nakamura, T., Yamagata, Y., & Ichishima (1992), “Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto)”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 56, pp 1869- 1871 26 Panuwan C., Anchalee O., Khanungkan K., Ekachai and Saisamon L (2002), “Characterrization of protease of Bacilus subtilis train 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailan2d”, Science Asia 28, pp 241 – 245 27 Peng, Y., X Yang, Y Zhang (2005), ”Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo”, Appl Microbiol Biotechnol (69), pp 126- 132 28 Peng, Y., Zhang, R H., & Zhang (2003), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douche, a traditional Chinese soybean food”, Comparative Biochemistry and Physiology B Biochemistry and Molecular Biology 134, pp 45- 52 Khoa Công nghệ Sinh học 65 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang 29 R.-H Zhang, L Xiao, Y Peng, H-Y Wang, F Bai, Y-Z Zhang (2005), “Gene expression and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) in Escherichia coli”, Letters in Applied Microbiology 41, pp 190- 195 30 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (2001), “Molecular Cloning: A laboratory manual”, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor 31 Sumi, H., Hamada, H., Tsushima, H., Mihara, H., Muraki (1987), “A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in vegetable cheese natto; a typical and popular soybean foof in Japanese diet”, Experientia 43, pp 1110- 1111 32 Sumi, H., Hamada, H., Nakanishi, K., Hiratani (1990), “Enhaucement of the fibrinolytic activity in plasma by oral adminidtration of nattokinase”, Acta Haematologica 84, pp 139- 143 33 Sumi, H., M Maruyama, T Yoneta and H Mihara (1983), “Activation of plasma fibrinolysis after intrarectal administration of high molecular weight urokinase and its derivative”, Acta Haematol 70, pp 289 – 295 34 Suzuki, Y., Kondo, K., Matsumoto, Y., Zhao, B Q., Otsuguro, K., Maeda, T., Tsukamoto, Y., Urano, T., Umemura (2003), “Dietary supplementation of fermented soybean, natto, suppresses intimal thickening and modulates the lysis of mural thrombi after endothelial injury in rat femoral artery”, Basic Life Sciences 73, pp 1289- 1298 35 Urano, T., Ihara, H., Umemura, K., Suzuki, Y., Okie, M., Akita, S., Tsukamoto, Y., Suzuki, I., Takada (2001) “The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified from Bacillus subtilis cleaves and inactivates plaminogen activator inhibitor type I”, The Journal of Biological Chemistry 27, pp 24690- 24696 36 Verstraete M., Collen D (1986), “Pharmacology of thrombolytic drugs”, J Am Coll Cardiol 8, pp 33- 40 [53] 37 Verstraete M (2000), “Thrid- generation thrombolytic drugs”, Am J Med 109, pp 52- 58 Khoa Công nghệ Sinh học 66 Lớp cao học k810 Luận văn cao học Đinh Thị Thu Trang 38 Visudhiphan, S., S Poolsuppasit, O Piboonukrintr and S Tumliang (1982), “The relationship between high fibrinolytic activity and daily capsicum ingestion in Thais”, Americal J.Clin Nutr 35, pp 1452 – 1458 39 Wang, C T., Ji, B P., Nout, R., Li, P L., Ji, H., Chen (2006), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese traditional Douchi”, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 33, pp 750- 758 40 Wang Kaimin2 Zhao Min1,2 Wang Fuxin (2009), “Expression of Nattokinase Gene in Saccharomyces Cerevisiae”, Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology 04, pp 016 41 Xiaobo Liang, Shifang Jia, Yufang Sun, Meiling Chen, Xiuzhu Chen, Jin Zhong, Liandong Huan (2005), “Secretory Expenssion of Nattokinase from Bacillus subtilis YF 38 in Escherichia coli”, Mol Biotechnol, pp 187- 194 42 Yong Peng, Xiao-Juan Yang, Lu Xiao, Yi-Zheng Zhang (2004), “Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) gene from Bacillus amyloliquefaciens DC-4 in Bacillus subtilis”, Research in Microbiology 155, pp 167- 173 43 Zhong-liang Zheng, Zhen-yu Zou, Zhi-gang Liu, Keng-chang Tsai, Ai-fu Liu, Gou-lin Zou (2004) “Construction of a 3D model of nattokinase, a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus natto A novel nucleophilic catalytic mechanism for nattokinase”, Journal of Molecular Graphics and Modelling 23, pp 373-380 44 www beta-glucan-info.com/enzyme_facts.htm 45 www.nattokinase.co.jp/en/nattokinase.pdf 46 www.thuocbietduoc.com Khoa Công nghệ Sinh học 67 Lớp cao học k810 ... fibrinaza Đoạn gen cần tách dòng thường tách từ chủng vi sinh vật phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống Bảng Một số nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza Nguồn phân lập Chủng Kích... cao học Đinh Thị Thu Trang Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzym fibrinaza số chủng vi khuẩn phân lập từ đậu tương lên men Khoa Công nghệ Sinh học Lớp cao... chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fibrinaza 45 III.2 Định tên chủng vi khuẩn nghiên cứu 48 III.3 Nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza .52 III.3.1 Tách DNA vi khuẩn