BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Duyên NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA - PARIS POLYPHYLLA VAR CHINENSIS FRANCHET THU THẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Duyên NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA - PARIS POLYPHYLLA VAR CHINENSIS FRANCHET THU THẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số: 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG KHOA HỌC: PGS TS Đỗ Thị Hà GS TS Phạm Quốc Long Hà Nội, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án công trình nghiên cứu riêng với hướng dẫn khoa học PGS.TS Đỗ Thị Hà GS.TS Phạm Quốc Long Các kết luận án trung thực chưa công bố công trình khoa học khác Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Duyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đỗ Thị Hà GS.TS Phạm Quốc Long - người Thầy (cô) giao đề tài hướng dẫn suốt trình thực luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn Thầy cô Trường Đại học Công nghiệp, Đại học Bách Khoa Đại học Khoa học Tự nhiên - Hà Nội nhà khoa học Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, giảng dậy môn học chuyển đổi, chuyên đề cho đính hướng nghiên cứu hiệu Tôi xin chân thành cảm ơn chị em công tác khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi suốt trình làm thực nghiệm khoa Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Trần Thị Hiền Phòng Thực nghiệm Dược học Đại học Lund - Thụy Điển nhiệt tình giúp đỡ thực nghiên cứu hoạt tính sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Vũ Xuân Phương, TS Nguyễn Thế Cường, ThS Bùi Hồng Quang - Viên Sinh thái Tài nguyên - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ths Nguyễn Quỳnh Nga - Khoa Tài Nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu giúp giám định tên khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, đồng nghiệp, bạn bè hỗ trợ động viên suốt trình học tập thực Luận án Luận án hỗ trợ kinh phí thực khuôn khổ đề tài sở Viện Dược liệu Ths Nguyễn Thị Duyên làm chủ nhiệm, Quỹ L'oreal National Fellowship2016 đề tài cấp Bộ Y tế năm 2017 PGS TS Đỗ Thị Hà làm chủ nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Thị Duyên MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Phân loại đặc điểm thực vật chi Paris 1.2 Công dụng số loài thuộc chi Paris 1.3 Thành phần hóa học chi Paris 1.3.1 Các hợp chất saponin 1.3.1.1 Các hợp chất saponin steroid 1.3.1.2 Các hợp chất saponin triterpenoid 16 1.3.2 Các flavonoid 16 1.3.3 Các hợp chất khác 17 1.4 Tác dụng sinh học loài thuộc chi Paris 18 1.4.1 Tác dụng chống ung thư 18 1.4.2 Tác dụng điều hòa miễn dịch 21 1.4.3 Tác dụng cầm máu tan máu 21 1.4.4 Tác dụng chống oxy hóa 22 1.4.5 Tác dụng kháng virus, kháng nấm chống ký sinh trùng 23 1.4.6 Tác dụng thần kinh 24 1.4.7 Tác dụng dày 24 1.5 Những nghiên cứu bảy hoa (Paris polyphylla var chinenesis Franchet) 24 1.5.1 Phân loại đặc điểm hình thái bảy hoa 24 1.5.2 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học bảy hoa 25 1.5.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 25 1.5.2.2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 26 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2 Các phương pháp hóa học 28 2.2.1 Phương pháp phân lập chất 28 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 28 2.2.3 Phương pháp dấu vân tay hóa học 29 2.3 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học 30 2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 30 2.3.2 Sử dụng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla để xác định hoạt độ hai yếu tố NF-κB AP-1 31 2.3.3 Sử dụng kỹ thuật Western blot phát biểu protein tế bào ung thư vú MCF-7 32 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM 33 3.1 Chiết tách phân đoạn phân lập chất 33 3.1.1 Chiết tách, phân lập hợp chất từ phần mặt đất 33 3.1.2 Chiết tách, phân lập hợp chất từ phần mặt đất 34 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ PPC 38 3.3 Xây dựng dấu vân tay hóa học 44 3.4 Hoạt tính sinh học 46 3.4.1 Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư phương pháp MTT 46 3.4.2 Xác định tác dụng chất paris II lên hoạt tính hai yếu tố NF-κB AP1 47 3.4.3 Xác định tác dụng chất paris II lên biểu protein tế bào ung thư vú MCF-7 48 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 4.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ thân rễ bảy hoa PPC 49 4.2 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ phần mặt đất bảy hoa PPC 49 4.3 Biện giải cấu trúc hợp chất phân lập từ PPC 50 4.3.1 Biện giải cấu trúc chất AB17 (PE29) 50 4.3.2 Biện giải cấu trúc chất AE6 (PE27) 56 4.3.3 Biện giải cấu trúc chất diosgenin steroid 59 4.3.4 Biện giải cấu trúc chất pennogenin steroid 81 4.3.5 Biện giải cấu trúc số sterol khác 95 4.3.6 Biện giải cấu trúc hợp chất flavonoid 97 4.3.7 Biện giải cấu trúc chất AE11 (thymidin) 102 4.4 Xây dựng dấu vân tay hóa học mẫu thuộc chi Paris 105 4.4.1 Xây dựng dấu vân tay phương pháp TLC 105 4.4.2 Xây dựng dấu vân tay phương pháp HPLC 109 4.5 Kết thử hoạt tính sinh học 111 4.5.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư cao chiết tổng, cao phân đoạn số hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC 111 4.5.2 Ảnh hưởng hợp chất Paris II lên hoạt độ hai yếu tố NF-κB AP-1 kỹ thuật phân tích luciferase Renilla 115 4.5.3 Kết đánh giá thay đổi mức độ biểu protein tế bào ung thư vú MCF-7 tác dụng hợp chất Paris II kỹ thuật Western Blot 116 KẾT LUẬN 120 KIẾN NGHỊ 122 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu NMR Tiếng Anh Nuclear Magnetic Resonance Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt Proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Carbon 13 Nuclear Magnetic nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt Resonance spectroscopy Heteronuclear Multiple Bond Correlation nhân cacbon Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp H→C 1 H-NMR 13 C-NMR HMBC H-1HCOSY DEPT DMSO H-1H chemical Shift Correlation Spectroscopy Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dimethyl sulfoxide Mp Hight Resolution Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Electron Spray Ionization Mass Spectra Melting point MeOH EtOAc DCM EtOH Methanol Ethyl acetate Diclo methane Ethanol IC50 Inhibitory Concentration at 50% EGF NF-κB Epidermal growth factor Nuclear factor kappa B HR-ESI-MS ESI-MS Phổ tương tác proton Phổ DEPT (CH3)2SO Phổ khối ion hóa phun mù điện tử phân giải cao Phổ khối lượng ion hóa phu mù điện tử Điểm chảy Nồng độ ức chế 50% đối tượng thực nghiệm Yếu tố tăng trưởng biểu bì Yếu tố phiên mã NF-κB AP1 Activator protein MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide LPS Lipo polysaccharides A549 Human lung cancer cells Human promyelocytic leukemia cells HL-60 Yếu tố phiên mã AP1 Dòng tế bào ung thư phổi Dòng tế bào ung thư bạch cầu Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela Cervical adenocarcinoma cells Caco-2 Heterogeneus human epithelial colorectal adenocarcinoma cells MCF-7 Human breast cancer cells PPC Paris polyphylla var chinensis PPCW Wild Paris polyphylla var chinensis PV Paris vietnamensis PPP Paris polyphylla var polyphylla PC PPY Paris caobangensis Paris polyphylla var yunnanensis δH Proton chemical shift δC Carbon chemical shift s: Singlet d: Doublet m: Multiplet Dòng tế bào ung thư trực tràng Dòng tế bào ung biểu mô vú Loài bảy hoa trồng Sapa - Lào Cai Loài bảy hoa thu hái tự nhiên Sapa Lào Cai Độ chuyển dịch hóa học proton t: Triplet Độ chuyển dịch hóa học cacbon overlap: Overlapped dd: doublet doublet DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các saponin sterol phân lập từ chi Paris 10 Bảng 1.2: Cấu trúc flavonol phân lập từ chi Paris 17 Bảng 3.1: Mẫu thực vật chi Paris sử dụng nghiên cứu dấu vân tay hóa học Bảng 3.2: Chương trình chạy HPLC phần mặt đất loài Paris 45 46 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ hợp chất AB17 (500MHz, DMSO-d6) 53 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ hợp chất AE6 (500MHz, MeOD) 58 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ hợp chất RE1 (CDCl3, 500Hz) 61 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ hợp chất AE16 Bảng 4.5: Dữ liệu phổ hợp chất AE15 64 67 Bảng 4.6: Dữ liệu phổ hợp chất RE3 gracillin Bảng 4.7: Dữ liệu phổ hợp chất AB18 Bảng 4.8: Bảng phổ hợp chất AB19 paris saponin II 71 75 80 Bảng 4.9: Dữ liệu phổ hợp chất RE4 (500MHz, DMSO-d6) Bảng 4.10: Dữ liệu phổ hợp chất RE5 paris saponin H 85 89 Bảng 4.11: Dữ liệu phổ hợp chất AB20 (500MHz, DMSO-d6) Bảng 4.12: Dữ liệu phổ hợp chất AE12 (500MHz, MeOD) resveratrol Bảng 4.13: Dữ liệu phổ hợp chất AE13 viniferin Bảng 4.14: Dữ liệu phổ hợp chất AE11 thymidin Bảng 4.15: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao tổng cao phân đoạn 93 100 102 104 111 Bảng 4.16: Giá trị IC50 hợp chất phân lập PPC dòng tế bào ung thư 112 Phụ lục hình Phụ lục hình Phụ lục hình Phụ lục hình [M+Cl]-=935,3 Phụ lục hình Phụ lục hình Phụ lục hình Phụ lục hình Phụ lục hình Phụ lục 10 hình [M+Cl]- Phụ lục 10 hình Phụ lục 10 hình Phụ lục 10 hình Phụ lục 10 hình [M+Na]+ =1053,3 Phụ lục 11 hình Phụ lục 11 hình Phụ lục 11 hình Phụ lục 11 hình Phụ lục 11 hình Phụ lục 12 hình [M+H]+=448.9 Phụ lục 13 hình Phụ lục 13 hình Phụ lục 13 hình Phụ lục 14, hình Phụ lục 15, hình ... 26-O-β-D-glc-nuatigenin-3-O-αL-rha-(1→2 )-[ β-D-glc-(1→3) ]- D-glc 26-O-β-D-glc-12α-hydroxynuatigenin 3-O-α-L-rha- (1→2)[α-L-rha-(1→4) ]- -D-glc 26-O-β-D-glc-nuatigenin-3-O-αL-rha-(1→4 )- -L-rha-(1→4 )-[ αL-rha-(1→2) ]- -D-glc... 26-O-β-D-glc-nuatigenin-3-O-αL-rha-(1→4 )- -L-rha-(1→4 )-[ αL-rha-(1→2) ]- -D-glc Nuatigenin-3-O-α-L-rha-(1→2)β-D-glc 26-O-β-D-glc-nuatigenin-3-O-αL-rha-(1→2 )- -D-glc 26-O-β-D-glc-nuatigenin 3-O-αL-rha-(1→4 )- -D-glc Abutilosid L 26-O-β-D-glc-(22R,25R )-1 2αhydroxy-nuatigenin... Pregna-5,16-diene-3-ol-20-one-3O-α-L-rha-(1→2 )-[ α-L-rha(1→4) ]- -D-glc Pregna-5,16-dien-3-ol-20-one-3O-α-L-rha-(1→4 )- -L-rha(1→4 )- [α-L-rha-(1→2) ]- -D-glc Hypoglaucin H 21-methoxyl pregna-5,16-dien3β-ol-20-one-3-O-α-L-rha(1→2 )-[ α-L-rha-(1→4)]-