BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY VỐI (Cleistocalyx operculatus Roxb) Khoa công nghệ sinh học Chuyên ngành: vi sinh- sinh học phân tử GVHD: Th.S Dương Nhật Linh SVTH: Nguyễn Thị Thảo MSSV: 1153010754 Niên Khóa: 2011- 2015 TP Hồ Chí Minh ngày 05 tháng năm 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy, cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy truyền đạt kiến thức để giúp em làm sở cho đề tài nghiên cứu Em xin gửi lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến Cô Dương Nhật Linh tận tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt suốt thời gian thực đề tài Em xin chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh người anh, người chị ủng hộ, giúp đỡ em lúc làm đề tài nghiên cứu Bên cạnh đó, xin cảm ơn bạn tôi, bạn sinh viên phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh – sinh học phân tử động viên giúp đỡ suốt trình thực đề tài Cuối xin cảm ơn Cha Mẹ, cảm ơn gia đình bên con, tạo điều kiện tốt để hoàn thành việc học Hoàn thành đề tài nghiên cứu với kỷ niệm đẹp học hỏi thêm nhiều kinh nghiệm áp dụng kiến thức học nghiên cứu Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất người thầy, người cô đáng kính khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày gặt hái nhiều thành công công việc sống Tôi xin chúc bạn hoàn thành tốt công việc học tập trường thành công sống Xin chân thành cảm ơn Sinh viên thực Nguyễn Thị Thảo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1.Minh họa vòng kháng khuẩn, kháng nấm………………………………… 31 Hình 3.1 Hình phân lập vi khuản nội sinh từ vối……………………………… 50 Hình 3.2 Hình ảnh đại thể, vi thể chủng BDL7.3………………………………….50 Hình 3.3 Hình ảnh đại thể, vi thể chủng BDT2…………………………………… 51 Hình 3.4 Hình ảnh đại thể, vi thể chủng BDR3…………………………………… 51 Hình 3.5 Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Escherichia coli………………………… 55 Hình 3.6 Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Staphylococcus aureus………………… 55 Hình 3.7 Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Samonella typhi………………………… 56 Hình 3.8 Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm T mentagrophytes……………… 60 Hình 3.9 Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm T rubrum……………………… 61 Hình 3.10 Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm M gypseum…………………… 61 Hình 3.11 Khả kháng vi khuẩn gây bệnh cao chiết……………………… 71 Hình 3.12 Khả kháng vi nấm gây bệnh cao chiết………………………… 75 Hình 3.13 Kết MIC mẫu cao chiết vối chiết methanol kháng vi khuẩn gây bệnh…………………………………………………………………………… 78 Hình 3.14 Kết MIC mẫu cao chiết vối chiết ethanol kháng vi khuẩn gây bệnh……………………………………………………………………………… 79 Hình 3.15 Kết MIC mẫu cao chiết vối chiết methanol kháng vi nấm gây bệnh……………………………………………………………………………… 80 Hình 3.16 Kết MIC mẫu cao chiết vối chiết ethanol kháng vi nấm gây bệnh………………………………………………………………………………… 81 SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO i KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Hàm lượng tinh dầu vối địa phương Nghệ An………………… Bảng 1.2 Thành phần hóa học tinh dầu vối………………………………………… Bảng 3.1 Kết quan sát đại thể,vi thể vi khuẩn nội sinh từ vối……………… 47 Bảng 3.2 Kết định tính khả kháng vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn nội sinh phân lập từ vối…… 53 Bảng 3.3 Đường kính vòng kháng vi khuẩn khuẩn nội sinh từ cây………………………………………………………………………………… 56 Bảng 3.4 Kết định tính khả kháng vi nấm gây bệnh vi khuẩn nối sinh từ vối……………………………………………………………………………… 58 Bảng 3.5 Đường kính vòng kháng vi nấm vi khuẩn nội sinh từ vối…………………………………………………………………………………… 62 Bảng 3.6 Kết định danh sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh…………………… 64 Bảng 3.7 Khối lượng cao chiết thu dung môi khác nhau…………… 65 Bảng 3.8 Kết số lượng nấm khuẩn sống có cao chiết………………… 67 Bảng 3.9 Kết định tính cao chiết kháng khuẩn………….………………… 68 Bảng 3.10 Đường kính vòng vô khuẩn cao chiết từ vối……………………… 69 Bảng 3.11 Kết định tính khả kháng nấm cao chiêt…………………… 72 Bảng 3.12 Đường kính vòng kháng nấm cao chiết từ vối…………………… 73 Bảng 3.13 Kết nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết kháng vi sinh vật……… 76 SVTH:NGUYỄN THỊ THẢO ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm 26 Sơ đồ 2.2 Quy trình chuẩn bị chiết xuất cao dược liệu……………………… 46 DANG MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng dung môi đến khối lượng cao chiết thu từ lá….66 Biểu đồ 3.2 So sánh kết kháng khuẩn loại cao chiết từ vối……… 70 Biểu đồ 3.3 So sánh kết kháng nấm loại cao chiết từ vối………… 74 SVTH:NGUYỄN THỊ THẢO iii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit- đơn vị hình thành khuẩn lạc Cs Cộng DMSO Dimethyl sulfoxid E coli Escherichia coli MHA Muller Hinton Agar M gypseum Microsporum gypseum MIC Minimum Inhibtory Concetration- Nồng độ ức chế tối thiểu NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PDA Potato Dextrose Agar S aureus Staphylococcus aureus SDA Sabouraud Dextrose Agar SE Standard Error S typhi Salmonella typhi TSA Trypticase Soy Agar T rubrum Trichophyton rubrum T mentagrophytes Trichophytonmentagrophytes SVTH:NGUYỄN THỊ THẢO iv KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY VỐI (Cleistocalyx operculatus Roxb) 1.1 Giới thiệu chung vối (Cleistocalyx operculatus Roxb) 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.1.2 Phân bố 1.1.3.Công dụng vối 1.1.4 Dược tính 1.1.5 Thành phần hóa học 1.2 TỔNG QUAN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI 11 1.2.1 Escherichia coli 11 1.2.2 Salmonella typhi 12 1.2.3 Staphylococcus aureus 12 1.2.4 Pseudomonas aeruginosa 13 1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI 14 1.3.1 Dermatophytes 14 1.3.1.1 Microsporum gypseum 14 1.3.1.2 Microsporum canis 15 1.3.1.3 Trichophyton 16 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 17 1.4.1 Ngoài nước 17 1.4.2 Trong nước 17 1.5 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU 18 SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO v KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC 1.5.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation) 18 1.5.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) 19 1.5.3 Kỹ thuật chiết Sohxlet 20 1.5.4 Cô đặc sấy khô 21 1.6 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM 22 1.6.1 Phương pháp khuếch tán 22 1.6.1.1 Nguyên tắc 22 1.6.1.2 Môi trường thực thử nghiệm 22 1.6.1.3 Phương pháp pha loãng liên tiếp 22 PHẦN II: 24 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG 24 PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1.VẬT LIỆU 25 2.1.1.Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.1.2.Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất môi trường 25 2.1.3.1 Thiết bị dụng cụ 25 2.1.3.2 Hóa chất 25 2.1.3.3 Môi trường 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 26 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh từ vối 27 2.2.2.1 Thu nhận mẫu 27 2.2.2.2 Xử lý mẫu 27 2.2.2.3 Phân lập vi khuẩn nội sinh 27 2.2.2.4 Làm thuầ n 28 SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC 2.2.2.5 Quan sát đa ̣i thể , vi thể 28 2.2.3 Định tính khả kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh 29 2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường: 29 2.2.3.2 Chuẩn bị dịch vi sinh vật thử nghiệm 29 2.2.4 Định danh vi khuẩn nội sinh thử nghiệm sinh hóa 32 2.2.4.1 Nhuộm gram 32 2.2.4.2 Thử nghiệm catalase 32 2.2.4.3 Indol 32 2.2.4.4.Amylase 33 2.2.4.5 Nitrate 33 2.2.4.6 Citrate 34 2.2.4.7 Urease 35 2.2.4.8 Voges – Proskauer (VP) 35 2.2.7.8 Các thử nghiệm lên men đường 36 2.2.4.9 Phát triển 10% NaCl 36 2.2.4.10 Khả phát triển 50oC 36 2.2.4.11 Kiểm tra khả phát triển điều kiện kỵ khí 37 2.2.4.12 Thủy phân casein 38 2.2.4.13 Xác định khả di động 38 2.2.5 Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ vối 39 2.2.6 Định tính khả kháng khuẩn kháng nấm cao chiết từ vối 41 2.2.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết với vi khuẩn vi nấm gây bệnh 42 2.2.7.1 Đối với vi khuẩn gây bệnh 42 SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO vii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC 2.2.7.2 Đối với vi nấm gây bệnh: 44 PHẦN III 45 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY THUỐC 46 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY VỐI 46 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY VỐI 52 3.3.1 Kết định tính khả kháng khuẩn gây bệnh 51 3.3.2 Kết định tính khả kháng vi nấm gây bệnh 58 3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH SINH HÓA CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH 63 3.5 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI CHIẾT ĐẾN KHỐI LƯỢNG CAO CHIẾT THU ĐƯỢC TỪ LÁ CÂY VỐI 65 3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY VỐI 67 3.6.1 Kết định tính khả kháng vi khuẩn gây bệnh cao chiết từ vối 67 3.6.2 Kết định tính khả kháng nấm gây bệnh cao chiết từ vối 71 3.7 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT 76 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI 82 ̣ 4.1 KẾT LUẬN 83 4.2 ĐỀ NGHỊ 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 PHỤ LỤC 92 SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO viii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO [52] Sen A and Batra A ( 2012), “Evaluation of antimicrobial activity of different solvent extracts of medicinal plant: melia azedarach L.”, International Journal of Current Pharmaceutical Research, 4(2), pp 0975 – 7066 [53].Silambarasan E., Praveen kumar., Murugan T., Saravanan D., and Balagurunathan R (2012), “Antibacterial and antifungal activities of Actinobacteria isolated from Rathnagiri hills”,Journal of Applied Pharmaceutical Science, (10), pp 099-103 [54] Sturz A.V., Matheson B G (1996), “Populations of endophytic bacteria which influence host – resitance to Erwinia- induced bacteria soft rot in potato tubers”, Plan soi,l 184, pp 265-271 [55] Strobel G.A., Daisy B (2003), “Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products, Microbiology and Molecular”, Biology views, pp 491–502 [56] Weitzman I., Summerbell R.C (1995),“The Dermatophytes, Clinical Microbiology Reviews”, 8(2), pp 240-259 [57] Xu H., Griffith M., Patten C L and Glick B R (1998),“Isolation and characterization of an antifreeze protein with ice nucleation activity from the plantgrowth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2”, Can J Microbiol 0T4T 44, 0T4T 64–73 [58].Ye Chun-Lin, Lu Yan-Hua, Wei Dong-Zhi (2004), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus”, Phytochemistry 65(4), pp 445–447 [59] Zinniel D K., Lambrecht P., HarrisN B., Harris Feng Z.,Kuezmarski D., P , Highley C., Ishimaru A., Arunakumari G., Barletta R., and Vidaver A K (2002), “Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants”, Appl SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO Environ Microbiol 59, 2198 -2208 91 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC Môi trường  Môi trường SDA (Sabourard Dextrose Agar) bổ sung Cloramphenicol Peptone 10g Dextrose 20g Cloramphenicol 0,05g Agar 20g Nước cất 1000 mL  Môi trường NA (Nutrient agar) Cao thịt 5g Peptone 10g NaCl 5g Agar 15g Nước cất 1.000 ml  Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar) Trypticase pepton 15 g Thytone pepton 5g NaC 5g Agar 18g Nước cất 1.000 ml pH = 7,3  Môi trường NB ( Nutrient Broth) Cao thịt SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 5g 92 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC Pepton bột 10g NaCl 5g Nước cất 1000 ml pH = 7,4-7,6  Môi trường MHA Mueller Hinton Broth 2,15g Nước cất 1.000 ml Agar 20g Hóa chất – Thuốc nhuộm  Crystal violet a) Crystal violet Cồn 960 0,4 g 10ml b) Phenol 1g Nước cất 100 ml Lưu ý: trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Bảo quản chai màu tránh ánh sáng  Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300 ml Lưu ý: hòa tan 2g KI vào ml nước cất, sau thêm 1g Iod Chờ cho Iod tan hết them nước vừa đủ 300 ml  Safranin O Safranin O (dung dịch 2% cồn 960 25 ml Nước cất 75 ml Lưu ý: Bảo quản chai màu SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 93 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC Kết định danh 2.1 Định danh Bacillus sp theo khóa phân loại Cowan and Steel SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 94 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC 2.2 Hình ảnh định danh chủng vi khuẩn nội sinh Thử nghiệm oxidaseThử nghiệm catalase Thử nghiệm phân giải tinh bộtThử nghiệm kị khí Thử nghiệm phân giải casein Thử nghiệm citrate SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 95 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC Thử nghiệm di động (+) Thử nghiệm nitrate Thử nghiệm NaCl 10% Thử nghiệm VP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 96 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC MANNOSE Các thử nghiệm lên men đường SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 97 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC Kết xử lí thống kê Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố cao chiết, vi khuẩn nội sinh thu dung môi chiết phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0  Kết khối lượng cao chiết thu từ vối (g)  Kết xử lý thống kê khối lượng cao chiết từ vối SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 98 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC  Kết đường kính vòng kháng S aureus (mm) SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 99 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC  Kết đừơng kính cao chiết vối kháng S typhi SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 100 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC  Kết cao chiết kháng nấm T ment  Kết cao chiết kháng T rubrum SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 101 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC  Kết cao chiết kháng M gypseum  Kết vi khuẩn nội sinh vối kháng khuẩn S aureus (mm)  Kết vi khuẩn nội sinh vối kháng khuẩn E coli (mm) SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 102 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC  Kết vi khuẩn nội sinh kháng nấm T ment  Kết vi khuẩn nội sinh kháng nấm T rubrum  kết vi khuẩn nội sinh kháng M gypseum SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 103 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO PHỤ LỤC 104 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO PHỤ LỤC 105 ... tài: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh cao chiết từ vối (Cleistocalyx operculatus Roxb)  Mục tiêu Nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn vi nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh cao chiết. .. tối thiểu cao dược liệu từ vối với vi khuẩn, vi nấm gây bệnh  Phân lập khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh từ vối  Định danh chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ vối SVTH:... HỌC CỦA CÂY THUỐC 46 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY VỐI 46 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY VỐI