TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH KHOA HÓA HỌC ỨNG DỤNG - - BÁO CÁO THỰC HÀNH HÓA PHÂN TÍCH Người hướng dẫn: Huỳnh Thị Hồng Hoa Sinh viên thực hiện: Nhóm Nguyễn Minh Lưng Thạch Ngọc Sơn Lê Tuấn Sang Trà Vinh, /6/2017 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích NHẬN XÉT Trà Vinh, ngày tháng năm 2017 Người hướng dẫn Huỳnh Thị Hồng Hoa GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích MỤC LỤC Nội dung trang SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ 1.Lịch sử hình thành sắc ký 2.Định nghĩa Sắc ký 3.Phân loại sắc ký : 4.Những kĩ thuật sắc ký phổ biến SẮC KÝ LỚP MỎNG 1.Sơ lược sắc ký 2.Định Nghĩa 3.Thành phần hệ thống sắc ký mỏng 4.Nguyên tắc hoạt động 5.Quá trình chuẩn bị cách tiến hành 6.Các tượng thường gặp TLC 16 7.Ưu điểm nhược điểm 17 8.Tài liệu tham khảo 17 GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ Lịch sử hình thành sắc ký Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 ông nghiên cứu chlorophyll [2] Chữ sắc sắc ký có nghĩa màu; vừa tên Tsvet nghĩa tiếng Nga, vừa màu sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc Tên tiếp tục dùng dù phương pháp đại không liên quan đến màu sắc Năm 1952 Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge trao giải Nobel Hoá học cho phát minh họ sắc ký phân bố.[3] Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng suốt kỉ 20 Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc tảng sắc ký Tsvet áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ xuất nhiều loại sắc ký khác Đồng thời, kĩ thuật thực sắc ký tiến liên tục, cho phép phân tích phân tử tương tự Định nghĩa Sắc ký Sắc ký phương pháp tách hỗn hợp dựa vào phân bố khác chúng hai pha động tĩnh thành thành phần để phân tích, nhận biết, tinh chế định lượng hỗn hợp hay thành phần + Pha tĩnh trì hoãn di chuyển thành phần mẫu.(lớp chất cố định).Trì hoãn di chuyển thành phần CPT tùy thuộc cấu trúc CPT Giữ mạnh : trễ Giữ yếu : xớm + Pha động : dung môi đưa lên lien tục sau cho mẫu vào.pha động di chuyển cột trọng lực đem cấu tử khác theo chúng trình gọi rửa giải.nếu thành phần di chuyển với tốc độ khác chúng tách khỏi thu hồi với pha động + Hợp chất có lực nhiều với pha động có xu hướng khỏi cột trước + Hợp chất có lực nhiều với pha tỉnh bị giử lâu cột sau Phân loại sắc ký : Theo chế trình tách : + Sắc ký hấp phụ + Sắc ký phân bố + Sắc ký trao đổi ion GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích + Sắc ký rây phân tử Những kĩ thuật sắc ký phổ biến Sắc lý lỏng (Liquid Chromatography-LC) Sắc ký khí (Gas Chromatography- GC) Sắc ký mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC Sắc ký giấy ( Paper Chromatography Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) SẮC KÝ LỚP MỎNG (Thin layer chromatography) Sơ lược sắc ký Phương pháp sắc ký lớp mỏng nhà bác học Nga Izmailov Shraiber mô tả từ năm 1938 đến 1958 - 1959 sau công trình E.Stahl công bố ứng dụng rộng rãi ngày cải tiến Định Nghĩa Sắc ký lớp mỏng hay gọi sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào tượng hấp thu pha động dung môi hỗn hợp dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh chất trơ (thí dụ như: silicagel) Pha tĩnh tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên phẳng kiếng, nhôm hay plastic Do chất hấp thu tráng thành lớp mỏng nên phương pháp gọi sắc ký lớp mỏng GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích Hình Thành phần hệ thống sắc ký mỏng Bình sắc ký: Một chậu, hủ, lọ thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, ) tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên kiếng, nhôm, hay plastic Chất hấp thu nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay lọai polymer hữu Mẫu cần phân tích: thường hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác Sử dụng khoảng 𝜇l dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ vi quản để chấm thành điểm gọn pha tĩnh, vị trí phải cao chút so với mặt thoáng chất lỏng chứa bình Pha động: dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo lớp mỏng, lôi kéo mẫu chất theo Dung môi di chuyển cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất di chuyển với vận tốc khác nhau, phía sau mực dung môi Vận tốc di chuyển phụ thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích tĩnh muốn níu giữ mẫu chất lại pha tĩnh tùy thuộc vào độ hòa tan mẫu chất dung môi Bảng GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích Hình : Thành phần hệ thống sắc ký mỏng Nguyên tắc hoạt động Sắc ký tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt chất cần tách Giọt dung dịch mẫu nhỏ đường xuất , rìa nhúng vào dung môi thích hợp Dưới tác dụng lực mao quản , dung môi chuyển động dọc theo lớp hấp phụ chuyển vận cấu tử chủa hỗn hợp với vận tốc khác đưa đến việc tách cấu tử Sự khếch tán cấu tử lớp hấp phụ vừa theo chiều dọc vừa theo chiều ngang xem trình sắc ký thực theo chiều GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích Hình 3: Nguyên tắc hoạt động Quá trình chuẩn bị cách tiến hành a Quá trình chuẩn bị * Bản mỏng sắc ký: - Phải chuẩn bị sắc ký mỏng tráng silicagel Hình :Bảng mỏng tráng silicagel GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích * Chuẩn bị Dung môi Dung môi phải loại tinh khiết, thường dùng hỗn hợp 2-3 dung môi Các dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần (sức đẩy, phản hấp phụ): hexan, heptan, cyclohexan, carbon tetraclorid, benzen, cloroform, butyl acetat, ethet, ethyl acetat, pyridin, aceton, ethanol, methanol, nước * Bình sắc ký Có thể bình chuyên dụng lọ rộng miệng, ống hình trụ, có nắp * Ống vi quản Hình 5: Ống vi quản Hai tay cầm ống thủy tinh hơ lửa xanh đèn cồn vừa xoay tròn để vi quản nóng Khi vi quản vừa nóng chảy vừa đem vi quản khỏi lửa vừa kéo dài đầu ống xa khoảng từ đến cm giữ yên cho thủy tinh đặc cứng trở lại GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 10 SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích b.Cách tiến hành * Chấm dung dịch lên mỏng Kẻ vạch thẳng nằm ngang bút chì, cách mép mỏng cm làm vạch xuất phát Dùng mao quản hay micropipet chấm vết dung dịch thử dung dịch chuẩn lên Các vết phải cách cách mép mỏng cm Hình : Chấm dung dịch lên mỏng * Khai triển sắc ký Là trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển pha tĩnh Đặt mỏng vào bình sắc ký bão hoà dung môi pha động, mép phía chấm mẫu nhúng vào dung môi động không cho điểm chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động Sau dung môi chạy nửa hay hai phần ba mỏng ta lấy để khô hay sấy khô GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 11 SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích Hình 7: Khai triển sắc ký c Phát vết mỏng mắt thường không nhìn thấy : *phương pháp vật lý: Sử dụng đèn chiếu tia UV 254 nm : ánh sáng dung để nhận hợp chất hấp thụ tia uv.các hợp chất tạo thành vết có màu nâu sẩm Đèn chiếu tia UV 366nm ánh sáng dùng để phát hợp chất có tính huỳnh quanh vết chất mẫu có màu sáng nên mỏng sẩm màu GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 12 SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích Hình 8: Sắc phổ quan sát ánh sáng thường đèn UV * Phương pháp hóa học Ninhydrin (2,2-dihydroxyindane-1, 3-dion) hóa chất sử dụng để phát amoni amin bậc thứ cấp Khi phản ứng với amin tự cho màu xanh đậm tím gọi tím Ruhemann sản xuất Ninhydrin sử dụng phổ biến để phát dấu vân tay , amin cuối dư lượng lysine peptide protein bị đứt dấu vân tay phản ứng với ninhydrin Hình : Phương pháp hóa học GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 13 SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích d Đọc kết Vị trí vết sở để định tính chất Trong SKLM, vị trí vết biểu thụ số Rf (retention factor-hệ số lưu giữ) Có thể nói, sắc đồ có vết chất chưa biết nằm ngang (có số Rf) với vết chất chuẩn chất chưa biết chất chuẩn Rf chất X tính sau: Rf = x1/xo với < Rf < X1 X0 Hình 10 Ví dụ 1: Hình 11: GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 14 SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích Ví dụ 2:Tách chất màu thực vật xanh làm với hệ dung môi khác phương pháp sắc kí lớp mỏng? Bình khai triển bình thủy tinh hình trụ cao 25 cm đường kính miệng 10 cm, có nắp đậy kín Bão hòa dung môi bình cách lót giấy lọc xung quanh thành bình, rót lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc để giấy lọc thấm dung môi Lượng dung môi sử dụng cho sau thấm giấy lọc lại lớp dày khoảng mm đến 10 mm đáy bình Ðậy kín nắp bình để yên 10 phút nhiệt độ phòng Sử dụng mỏng TLC silicagel 60F 254 hãng Merck cắt kéo thành hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 12 cm tự chế tạo từ tinh bột sắn dây kích thước cm x 12 cm Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản micropipet để đưa mẫu lên mỏng Thể tích dung dịch từ 0,001ml đến 0,005ml trường hợp đưa mẫu lên mỏng dạng điểm từ 0,l - 0,2ml đưa mẫu lên mỏng dạng vạch Ðường xuất phát phải cách mép mỏng 1,5cm - 2cm cách bề mặt dung môi từ 0,8 - cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính -6mm cách 15mm Các vết bìa phải cách bờ bên mỏng 1cm Ðặt mỏng gần thẳng đứng với bình triển khai, vết chấm phải bề mặt lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình để yên nhiệt độ không đổi Khi dung môi triển khai mỏng đoạn, lấy mỏng khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay dung môi đọng lại mỏng chụp ảnh, đo khoảng di chuyển dung môi chất cần tách.Tính Rf GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 15 SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích Hình 12 Các tượng thường gặp TLC Hiện tượng Nguyên nhân Cách khắc phục Vết di chuyển không Mẩu nhiều tạp chất Loại bỏ tạp chất trước hoàn toàn Vết trái phân cực dài ngăn cách tiến hành sắc ký không Chọn hệ dung môi chưa Thay đổi tỉ lệ dung môi tốt cho phù hợp Các vết lân cận trùng Chấm vết gần Chấm khoảng cách theo quy định GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 16 SVTH Nhóm Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Vết hình móng ngựa Báo cáo thực hành hóa phân tích Vết chấm hình tròn Chấm mẫu nhỏ lại lớn Vết loang Vết Khuếch tán bay Vẽ ,chụp hình sau để lâu nhúng màu xong thử thuốc lâu Bảng Ưu điểm nhược điểm a.Ưu điểm Chỉ cần lượng mẫu để phân tích Có thể phân tích đồng thời mẫu chất chuẩn đối chứng điều kiện phân tích Tất hợp chất mẫu phân tích định vị sắc ký lớp mỏng Đơn giản Nhanh chóng, Không tốn b.Nhược điểm: Không xác để định lượng Bảo vệ độ cứng sắc ký đồ khả lặp lại hệ số Rf khó Tài liệu tham khảo http://vi.wikipedia.org/wiki/S%E1%BA%AFc_k%C3%AD_l%E1%BB%9Bp_ m%E1%BB%8Fng http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/HPTLC.htm http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/sac-ki-lop-mong.442928.html HẾT GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 17 SVTH Nhóm ... VỀ SẮC KÝ 1.Lịch sử hình thành sắc ký 2.Định nghĩa Sắc ký 3.Phân loại sắc ký : 4.Những kĩ thuật sắc ký phổ biến SẮC KÝ LỚP MỎNG 1.Sơ lược sắc ký 2.Định Nghĩa 3.Thành phần hệ thống sắc ký mỏng. .. phân tích + Sắc ký rây phân tử Những kĩ thuật sắc ký phổ biến Sắc lý lỏng (Liquid Chromatography-LC) Sắc ký khí (Gas Chromatography- GC) Sắc ký mỏng (Thin Layer Chromatography -TLC Sắc ký giấy (... ký giấy ( Paper Chromatography Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) SẮC KÝ LỚP MỎNG (Thin layer chromatography) Sơ lược sắc ký Phương pháp sắc ký lớp mỏng nhà bác học Nga Izmailov