TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CNSH - CNTP KIỂM ĐỊNH VÀ TRUY XUẤT NGUỒN GỐC THỰC PHẨM Đề tài : Vấn đề sữa nhiễm melamine số phương pháp xác định Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm MỞ ĐẦU Vấn đề thực phẩm bẩn vấn đề nóng bỏng gây nhức nhối xã hội, nay, không sản phẩm không nhãn mác, không nguồn gốc, không rõ hạn sư dụng tràn lan thị trường, mà sản phẩm thực phẩm thương hiệu tiếng , có nhãn mác đầy đủ bị gian lận môt cách “tinh tế “ Đáng ý vụ sữa bị nhiễm Melamine xảy vào tháng 8/2008 Trung Quốc Vụ việc không gây hậu nghiêm trọng tới sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt trẻ em mà tác động nặng nề đến kinh tế Trung Quốc có 11 quốc gia ngừng nhập sữa từ đất nước này, nhiều nhà máy, xí nghiệp phải đống cửa, công nhân bị thất nghiệp Hơn nữa, vụ bê bối đưa vấn đề thiếu sót việc kiểm tra, giám sát chất lượng thực phẩm không lường hết gian lận doanh nghiệp hậu Bài tiểu luận nhóm em xin trình bày Melamine số phương pháp xác định melamine Do hạn chế kiến thức nên nhiều sai sót, hi vọng cô bạn sửa chữa Em xin chân thành cảm ơn pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm I Vấn đề sữa nhiễm melamine Melamine ? Melamine bazo hữu có công thức phân tử C3H6N6, tên khoa học 1,3,5 triazine-2,4,6 –triamine, có gọi cyanuramide hay cyanurotriamine Melamine có dạng tinh thể màu trắng, tan nước, tan tạo thành dung dịch sánh, màu trắng đục sữa Trọng lượng phân tử 126, Nito chiếm 66% khối lượng Công thức phân tử công thức cấu tạo : Ứng dụng điều chế melamine Melamine sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất nhựa chịu nhiệt chất tạo bọt làm Melamine thành phần chất màu có tên Pigment Yellow 150 mực in nhựa Nó sử dụng sản xuất be-tong nhằm giảm hàm lượng nước, tăng khả chịu lực, hạn chế tạo xốp tăng độ bền be-tong Ngoài ra, melamine sử dụng ngành công nghiệp sản xuất hồ, nhựa ép, giấy dán, chất chống cháy… Do sở hữu hàm lượng nito cao nên từ năm 50, melamine sử dụng làm phân bón Tuy nhiên, phản ứng thủy phân meamine nên tác dụng với đất tròng hạn chế Melamine có mặt thuốc có gốc asen dùng điều trị xoắn trùng Châu Phi Đã từ lâu người ta dùng melamine nguồn cung cấp nito protein cho động vật nhai lại ( nhiên quan điểm ứng dụng chưa quán ) Một ý nhựa melamine thường sử dụng bao gói thực phẩm làm nguyên liệu chế tạo sản phẩm thìa, dĩa….nên melamine xâm nhập từ dụng cụ vào thể với hàm lượng nhỏ ( tính phần triệu ) Melamine hình thành ( dẫn chất ) từ thuốc trừ sâu cyromazine chất có mô động vật, thực vật Hai trường hợp ( với hàm lượng nhỏ) gọi “ diện không chủ định” để phân biệt với trường hợp cố tình thêm Melamine nói Điều chế : Nhà hóa học người Đức tên Justus von Liebig người tổng hợp melamine vào năm 1834 Trong phương pháp tổng hợp Justus von Liebig, pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm calcium cyanamide (CaCN2) chuyển thành dicyandiamide sau nung nóng để tạo melamine Ngày urê sử dụng công nghiệp để sản xuất melamine Phương trình hóa học sau: 6(NH2)2CO → C3H6N6 + 6NH3 + 3CO2 Trước hết, urê phân tách tạo axit cyanic (HNCO) (phản ứng cần nhiệt độ cao): (NH2)2CO → HCNO + NH3 Tiếp theo phản ứng polyme hóa axit cyanic tạo dioxit cácbon melamine (phản ứng tỏa nhiệt): 6HCNO → C3H6N6 + 3CO2 Xét toàn trình, phản ứng tạo melamine phản ứng cần nhiệt độ cao Chính vậy, melamine tạp chất sản xuất urê Quy trình kết tinh rửa melamine làm sản sinh lượng lớn nước thải có hại chúng xả trực tiếp vào môi trường Thông thường nước thải cô thành dạng rắn (có thể chứa đến 75% melamine) thuận tiện an toàn cho quản lý xử lý Độc tính Melamine Các nghiên cứu trước cho thấy melamine chất có độc tính thấp Melamine biết đến chất gây hại nuốt, hít hấp thụ qua da Liều độc melamine cao với LD 50 3gr/kg trọng lượng thể ( thực chất không gọi độc muốn ăn thường ngày có liều LD50 tương tự ) Tuy nhiên, đến 7/2007, số vật nuôi chó, mèo bị chết với biểu liên quan đến thận ăn thức ăn chứa melamine, sau đơn kiện công ty sữa Trung Quốc trẻ uống sữa công ty bị sỏi thận, nhà khoa học tiến hành đánh giá lại, phát độc tính thực melamine thể pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Axit cyanuric chất có cấu trúc tương tự melamine Công thức phân tử C3H3N3O3 Đây chất có độc tính cấp thấp , liều LD50 chuột 7.7 mg/kg trọng lượng thể Trong melamine axit cyanuric chất có độc tính cấp thấp, nhiên kết hợp lại với tạo muối melamine cyanurate nguyên nhân vụ bê bối Trong thể, melamine bị thủy phân chuyển hóa thành axit cyanuric Môi trường pH thận (4.5-8), melamine (xanh) axit cyanuric (đỏ) kết hợp dễ dàng tạo muối melamine cyanurate lắng đọng, kết tinh gây tắc nghẽn phá hủy cấu trúc thận Chất gây tổn thương hạn chế chức tiết thận, việc chữa trị khó khăn chí dẫn đến tử vong Vụ việc sữa bị nhiễm melamine hậu Sữa sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao,chứa hầu hết chất dưỡng cần thiết với người với tỉ lệ cân đối hài hòa Chính mà nhu cầu sữa thực phẩm sữa chưa có dấu hiệu giảm Nhưng để tăng lợi nhuận, doanh nghiệp bổ sung melamine vào để làm tăng hàm lượng protein sữa Đưa 1% malemine vào thực phẩm làm tăng 4.13% protein thô Vụ việc lên đến đỉnh điểm vào năm 2008, có tới 53 000 trẻ bị ảnh hưởng, 12 800 trẻ phải nằm viện trẻ bị tử vong với nguyên nhân sỏi thận Và xem vụ bê bối thực phẩm lớn lịch sử Hiện tượng sữa nhiễm melamine phát 22 công ty Trung Quốc, có doanh nghiệp lớn Sanlu, Yashili, Jili, Mengniu, Shengyuan Hàng trăm sở sản xuất sữa bị phá sản, đóng cửa Có 11 quốc gia tuyên bố ngừng nhập sữa từ Trung Quốc Quá trình thu hồi diễn kéo dài năm 2010 Như vậy, dù melamine thân độc tính không cao vào thể, với hàm lượng lớn lâu dài, gây hậu nặng nề ,không ảnh hưởng đến tính mạng, mà tổn thất kinh tế Trung Quốc Ngoài ra, qua vụ việc thấy hạn chế, thiếu sót việc kiểm tra, giám sát chất lượng thực phẩm, dẫn đến nhiều thiệt hại nghiêm trọng pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm II Một số phương pháp xác định melamine sữa Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ( high performance liquid chromatography – HPLC) HPLC phương pháp phát triển dựa phương pháp ghi sắc kí cột ( column chromatography) 1.1 Đại cương sắc kí cột Sắc kí phương phá tách dựa tính chất vật lí hay hóa lí cấu tử hỗn hợp thể khí hay lỏng Tiến trình sắc kí cột mô tả đơn giản : - Một pha đứng yên cấu tạo cột rỗng, làm đầy hợp chất rắn hay lỏng cho phù hợp - Trên đầu pha tĩnh có chứa lượng mẫu nhỏ có thành phần khỏi ( chứa hợp chất cần phân tích) - Pha động gọi dung môi, chuyển động liên tục tác dụng trọng lực kéo theo cấu tử mẫu di chuyển Như vậy, mẫu di chuyển, cấu tử mẫu mặt tương tác với pha tĩnh bị pha tĩnh hấp phụ, mặt khác lại bị pha động kéo (quá trình rửa giải) dẫn đến vận tốc khác nhau, tách khỏi thu hồi với pha động 1.2 Sắc kí lỏng hiệu cao - HPLC Phương pháp có nguyên lý sắc kí cột, thay để dung môi nhỏ giọt qua cột sắc kí tác dụng trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400at để dịch chuyển xảy nhanh Phương pháp cho phép sử dụng hạt có kích thước nhỏ cột hấp phụ, làm tăng bề mặt tiếp xúc phan tĩnh phân tử qua Điều giúp tăng cường khả phân tích chất có hỗn hợp pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Mô hình đơn giản hệ thống HPLC : Quá trình tiến hành : Bơm lấy dung dịch từ bình chứa, pha động qua thiết bị lấy mẫu tự động, kéo theo phần mẫu lên cột sắc kí Tại cột sắc kí xảy trình hấp phụ rửa giải sắc kí lỏng, cấu tử có lực mạnh với pha động theo pha động trước, ngược lại Đầu dò (Detector) phát cấu tử khỏi cột chuyển phần mẫu tới bình thu hồi , đưa kết tới thiết bị ghi nhận xử lí kết Kết thức trình, hình xuất dãy peak, peak đại diện cho hợp chất hỗn hợp qua cột hấp phụ Ngoài ra, dựa vào chiều cao độ rộng peak định lượng hợp chất Chú ý : Thời gian lưu mẫu : Là khoảng thời gian tính từ lúc đưa mẫu vào đến đỉnh (peak) hiển thị rõ nét, giúp định tính Khoảng thời gian bị ảnh hưởng : - Áp suất đầu vào - Tính chất pha tĩnh - Thành phần dung môi - Nhiệt độ cột 1.3 HPLC áp dụng xác định Melamine Hiện nay, HPLC phwuong pháp pphoor biến dùng để xác định lượng melamine sữa số loại thực phẩm khác, với ưu điểm độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt Nồng độ phát : vài chục ppb Các tham số tham khảo dùng HPLC xét nghiệm Melamine : Theo tiêu chuẩn FDA : - Cột hấp phụ : Venusil ASBC8 ( loại cột hấp phụ công ty Agela Technology, cột chứa silica) kích thước 4.6*250mm ; pha động : buffer :acetonitrile 85:15, Buffer : 10mM axit citric, 10mM sodium octane, pH=3.0; tốc độ chảy : 1.0mL/min - Bước sóng tia UV : 240 nm - Nhiệt độ : 40 độ C pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm - Máy dò : DA Chú ý : Về máy dò ( Detector ): có nhiều phương pháp để nhận biết thành phần hỗn hợp sau qua cột Đối với việc xác định melamine sữa, người ta thường sủ dụng phương pháp hấp thụ tia cực tím Dựa sở hợp chất hữu thường hấp thụ tia UV, chất hấp thụ mạnh với bước sóng định Chiếu tia Uv xuyên qua dòng hỗn hợp đầu ra, qua đo mực độ hấp thụ tia UV tính nồng độ chất Phương pháp elisa Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), gọi enzyme immunoassay (EIA), kỹ thuật sinh hóa sử dụng chủ yếu miễn dịch học để phát diện kháng thể kháng nguyên mẫu ELISA sử dụng công cụ chẩn đoán y học bệnh lý học thực vật, kiểm tra kiểm soát chất lượng ngành công nghiệp khác nhau, chẳng hạn ứng dụng ELISA ngành công nghiệp thực phẩm Trong kỹ thuật ELISA, lượng kháng nguyên gắn liền với bề mặt, sau kháng thể đặc hiệu cho vào bề mặt để liên kết với kháng nguyên Kháng thể liên kết với loại enzyme, cuối thêm chất để enzyme phân giải chất phát tín hiệu, phổ biến đổi màu chất hóa học Cơ chế phương pháp elisa: Các mẫu có số lượng kháng nguyên chưa biết cố định bề mặt vững chắc- giá thể rắn (thường polystyrene vi chuẩn) không đặc hiệu (thông qua hấp phụ lên bề mặt) đặc hiệu (thông qua chụp kháng thể khác đặc hiệu với kháng nguyên Sau kháng nguyên cố định, kháng thể phát thêm vào, tạo thành phức hợp với kháng nguyên Các kháng thể phát liên kết với loại enzyme, hay phát kháng thể thứ cấp liên kết với loại enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị phân tử sinh học Giữa bước, đĩa thường rửa dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ protein kháng thể không gắn Sau bước rửa cuối cùng, chất enzyme thêm vào để tạo tín hiệu nhìn thấy, giúp số lượng kháng nguyên mẫu Phân loại elisa: pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Phương pháp elisa gồm nhiều kĩ thuật khác dựa nguyên tắc canh tranh đặc hiệu kháng thể kháng nguyên.Gồm:  Elisa dị pha: • Elisa trực tiếp • Elisa gián tiếp • Elisa sandwich • Elisa cạnh tranh  Elisa đồng pha: • Elisa đồng pha cạnh tranh • Elisa đồng pha không cạnh tranh Kít thử elisa Kít thử elisa dụng cụ, hóa chất sử dụng dựa kĩ thuật phân tích elisa Nồng độ phát 0,00001µg/ml Dụng cụ:  Đĩa elisa pha rắn pg 10 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Đĩa ELISA 96 giếng sử dụng nhiều ELISA thường polystyrene dẫn xuất polystyrene thu cách biến đổi hóa học chiếu xạ bề mặt Phổ biến đĩa 96 giếng tổ chức thành hàng 12 cột Mỗi giếng giữ khoảng 350 µl thể tích với khu vực bên khoảng 2,5 cm2 Gần hơn, đĩa 384 giếng 1536 giếng phát triển với kích thước tổng thể giống truyền thống 96 giếng Chúng sử dụng việc kiểm tra lượng mẫu lớn Ngoài ra, có đĩa 96 giếng với giếng nửa thể tích giếng truyền thống Phân tích thực giếng với thể tích nửa giống hệt hiệu suất với đĩa kích thước truyền thống, tiết kiệm đáng kể thành phần phản ứng Một đổi gần đề nghị làm tròn phần đáy giếng thay góc 90 độ Điều giúp cho việc rửa dễ dàng tăng hiệu rửa  Elisa pipet: Có loại pipet thường sử dụng pipet đa kênh pipet đơn kênh Pipet đơn kênh chia làm dạng: cố định thể tích điều chỉnh thể tích (1- 20 ml, 10- 100 ml, 20- 200 ml ), pipet đa kênh thường dùng loại đầu tip 12 đầu tip để phù hợp với số lượng hàng cột đĩa ELISA Về thao tác chia thành pipet phân phối bán tự động pipet phân phối hoàn toàn tự động  Hệ thống máy rửa: pg 11 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Hệ thống máy rửa ELISA chia thành loại sau: rửa hàng cột thời điểm, rửa lúc đĩa rửa lần nhiều đĩa Tùy thuộc vào mục đích công việc mà ta lựa chọn loại máy phù hợp  Máy đọc kết Elisa: Máy đọc ELISA chia thành nhóm: đọc hàng cột lần, đọc kết đĩa lần đọc kết nhiều đĩa lúc Các bước thực hiện: Dưới bước sử dụng kít thử elisa dựa phương pháp elisa sandwich elisa cạnh tranh: pg 12 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm  Elisa sandwich: Chuẩn bị bề mặt biết trước lượng kháng thể bắt gắn • Khóa vị trí bám không đặc hiệu bề mặt • Cho mẫu có chứa kháng nguyên lên đĩa • Rửa đĩa, để loại bỏ kháng nguyên không gắn • Thêm kháng thể đặc hiệu vào, gắn với kháng nguyên (do gọi "sandwich": kháng nguyên bị kẹp hai kháng thể); • Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme - kháng thể phát hiện, kháng thể liên kết đặc hiệu với vùng Fc kháng thể (không đặc hiệu) • Rửa đĩa, để liên kết enzyme- kháng thể không gắn bị loại bỏ • Thêm chất enzyme để tạo màu tín hiệu huỳnh quang điện hóa • Đo độ hấp thụ huỳnh quang tín hiệu điện, cường độ màu giếng để xác định có mặt số lượng kháng nguyên Bằng cách sử dụng kháng thể liên kết enzyme liên kết với khu vực Fc kháng thể khác, kháng thể liên kết enzyme giống sử dụng cho loạt thí nghiệm Nếu kháng thể bắt giữ lớp đầu tiên, protein mẫu hấp phụ lên bề mặt đĩa, làm giảm số lượng kháng nguyên cố định Sử dụng kháng thể đặc hiệu tinh để gắn với kháng nguyên đĩa giúp giảm bớt việc làm kháng nguyên từ hỗn hợp phức tạp trước định lượng, • pg 13 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm đơn giản hóa phân tích tăng độ đặc hiệu độ nhạy thí nghiệm ELISA sandwich Ưu điểm phương pháp Sandwich ELISA: + Mẫu không cần phải tinh trước phân tích + Độ đặc hiệu cao, sử dụng hai kháng thể nên kháng nguyên/ chất phân tích bắt phát đặc hiệu + Thích hợp cho mẫu phức tạp, bới kháng nguyên không yêu cầu đòi hỏi phải tinh trước tiến hành định lượng + Linh hoạt độ nhạy cao, hai phương pháp phát trực tiếp gián tiếp sử dụng Độ nhạy cao 2-5 lần so với phương pháp ELISA trực tiếp gián tiếp, thấp ELISpot  Elisa cạnh tranh: • Kháng thể chính- sơ cấp (chưa đánh dấu) ủ với kháng nguyên mẫu • Phức hợp kháng thể- kháng nguyên sau thêm vào đĩa 96 giếng phủ trước kháng nguyên tương tự Kháng thể không bám bị loại bỏ thông qua bước rửa đĩa (Càng nhiều kháng nguyên mẫu, kháng thể liên kết với kháng nguyên giếng, gọi "cạnh tranh".) • Các kháng thể thứ cấp gắn enzym mà đặc hiệu với kháng thể sơ cấp thêm vào • Thêm chất, enzyme phân giải chất tạo tín hiệu màu huỳnh quang Ưu điểm phương pháp ELISA cạnh tranh: + Độ đặc hiệu cao, sử dụng hai kháng thể nên kháng nguyên/ chất phân tích giữ phát + Thích hợp cho mẫu phức tạp, kháng nguyên không đòi hỏi tinh trước tiến hành phản ứng pg 14 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm + Tính linh hoạt độ nhạy cao + Phát lượng kháng nguyên - kháng nguyên tín hiệu mạnh pg 15 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm III KẾT LUẬN Sữa thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, vậy, nhu cầu sử dụng sữa lớn, đặc biệt lứa tuổi trẻ nhỏ Để tăng thêm lợi nhuận, nhiều doanh nghiệp bổ sung thêm melamine vào sữa nhằm tăng hàm lượng protein ảo Vụ bê bối xảy năm 2008 Trung Quốc để lại hậu lớn nhiều mặt sức khỏe người, kinh tế xã hội Có nhiều phương pháp để xác định lượng melamine sữa, phổ biến phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC Phương pháp có ưu điểm độ nhạy cao, khả định lượng tốt, không cần làm bay mẫu, nhanh chóng… Ngoài ra, dùng kit thử Elisa để xác định lượng melamine sữa nói chung thực hẩm khác Tuy nhiên phương pháp thường phức tạp tốn pg 16 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Tài liệu tham khảo : Giáo trình Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm, NXB Đại học Bách Khoa Hà Nội, Nguyễn Thị Minh Tú (Chủ biên), Hoàng Quốc Tuấn, Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Hoàng Dung, Vũ Hồng Sơn, Đỗ Biên Cương Trương Quốc Phòng Giáo trình Công nghệ sản phẩm sữa, NXB Khoa học Kĩ thuật, TS Lâm Xuân Thanh http://www.elisa-antibody.com/ http://tai-lieu.com/tai-lieu/tong-quan-ve-melamine-844/ https://www.slideshare.net/phangtimi/sc-k-lng-trong-ha-phn-tch-mi-trng http://doc.edu.vn/tai-lieu/tieu-luan-melamine-49443/ https://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Melamine:_%E1%BB%A8ng_d %E1%BB%A5ng_v%C3%A0_t%C3%A1c_h%E1%BA%A1i http://xemtailieu.com/tai-lieu/hanh-vi-vi-pham-dao-duc-kinh-doanh-trongvu-be-boi-melamine-trong-sua-854913.html pg 17 ... bày Melamine số phương pháp xác định melamine Do hạn chế kiến thức nên nhiều sai sót, hi vọng cô bạn sửa chữa Em xin chân thành cảm ơn pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm I Vấn đề sữa nhiễm. .. thiệt hại nghiêm trọng pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm II Một số phương pháp xác định melamine sữa Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ( high... người, kinh tế xã hội Có nhiều phương pháp để xác định lượng melamine sữa, phổ biến phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC Phương pháp có ưu điểm độ nhạy cao, khả định lượng tốt, không cần làm