BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐỖ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐỖ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TRƢƠNG QUỐC PHONG GS TS NGUYỄN ĐĂNG HIỀN HÀ NỘI – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa tác giả công bố công trình nghiên cứu khác GVHD GVHD Nghiên cứu sinh PGS TS Trương Quốc Phong GS TS Nguyễn Đăng Hiền Đỗ Thị Thu Hà LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Trương Quốc Phong – giám đốc Trung tâm nghiên cứu phát triển CNSH, trường Đại học Bách khoa Hà Nội GS TS Nguyễn Đăng Hiền – giám đốc Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (Bộ Y tế) tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện cho hoàn thành luận án này; Để hoàn thành luận án, nhận nhiều giúp đỡ động viên từ PSG TS Tô Kim Anh, PGS TS Khuất Hữu Thanh – Nguyên ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu - phát triển CNSH toàn thể bạn bè đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm giúp đỡ quý báu đó; Tôi chân thành cảm ơn tập thể cán số phòng nghiên cứu thuộc Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế tạo điều kiện giúp đỡ để hoàn thành nghiên cứu mình; Với tất lòng kính yêu biết ơn chân thành nhất, xin dành cho gia đình bố, mẹ, chồng con, người thân yêu thông cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn suốt thời gian qua! Đỗ Thị Thu Hà MỤC LỤC I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH IX DANH MỤC CÁC BẢNG X ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình nhiễm virus rota giới 1.1.2 Tình hình nhiễm virus rota Việt Nam 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS ROTA 1.2.1 Phân loại virus rota 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc virus rota 1.2.3 Cơ chế xâm nhiễm nhân lên virus rota 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS ROTA 1.3.1 Quan sát kính hiển vi điện tử 10 1.3.2 Phƣơng pháp điện di 10 1.3.3 Phƣơng pháp Real time -PCR 11 1.3.4 Phƣơng pháp giải trình tự gen 11 1.3.5 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 11 1.3.6 Phƣơng pháp ngƣng kết hạt nhựa (latex agglutination) 12 1.3.7 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch ( immunochromatographic) 12 1.4 ĐẶC ĐIỂM PROTEIN VP6 VIRUS ROTA 12 1.4.1 Gen tổng hợp VP6 12 1.4.2 Đặc điểm protein VP6 13 1.4.2.1 Cấu trúc protein 13 1.4.2.2 Đặc tính VP6 16 1.5 PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG 18 1.5.1 Protein VP6 tái tổ hợp 18 1.5.2 Sản xuất protein tái tổ hợp hệ biểu E coli 21 1.5.2.1 Đặc điểm E coli 21 1.5.2.2 Hệ thống pET biểu protein dung hợp với 6xHis 21 1.5.2.3 Các mã biểu protein E.coli 22 1.5.3 Ứng dụng kháng thể kháng VP6 tạo kit thử chẩn đoán 25 1.6 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP PROTEIN TÁI TỔ HỢP26 I 1.6.1 Ảnh hƣởng chất cảm ứng 26 1.6.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ 27 1.6.3 Ảnh hƣởng thời gian cảm ứng 27 1.6.4 Ảnh hƣởng tối ƣu hóa codons 28 1.7 TINH SẠCH PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP 29 1.7.1 Thu nhận làm tan thể vùi 29 1.7.2 Tinh VP6 cột sắc ký lực AF-Chelate-650 resin gắn Ni2+ 30 1.7.3 Tái cuộn gấp VP6 tái tổ hợp 31 1.8 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Ở ĐỘNG VẬT 31 1.8.1 Chọn lọc động vật 32 1.8.2 Quy trình gây miễn dịch giám sát động vật 32 1.8.2.1 Chuẩn bị kháng nguyên 32 1.8.2.2 Lựa chọn tá dược 33 1.8.2.3 Đường tiêm 33 1.8.2.4 Liều lượng kháng nguyên, thể tích số mũi tiêm 33 1.8.2.5 Giám sát động vật 33 1.8.2.6 Lấy máu 34 1.8.2.7 Tinh kháng thể 34 1.9 KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH 34 1.9.1 Nguyên lý que thử 34 1.9.2 Ðặc tính thành phần que thử 35 1.9.2.1 Hạt nano vàng (AuNPs) 35 1.9.2.2 Cộng hợp kháng thể VP6 - hạt nano vàng 36 1.9.2.3 Miếng cộng hợp 37 1.9.2.4 Miếng thấm mẫu 37 1.9.2.5 Màng nitrocellulose 38 1.9.2.6 Miếng thấm hút (absorbent pad) 38 1.10 CÁC KIT THƢƠNG MẠI CHO CHẨN ĐOÁN VIRUS ROTA 39 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU 41 2.1 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THẾT BỊ 41 2.1.1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu 41 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 41 2.1.3 Vật liệu 41 2.1.4 Các cặp mồi sử dụng 42 2.1.5 Các kháng thể sử dụng 43 II 2.1.5.1 Kháng thể cho tạo que thử 43 2.1.5.2 Kháng thể cho Western Blot ELISA 43 2.1.6 Hóa chất thiết bị máy móc 44 2.1.6.1 Vật liệu, hóa chất 44 2.1.6.2 Thiết bị máy móc 45 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.2.1 Các phƣơng pháp vi sinh 45 2.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 45 2.2.1.2 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 46 2.2.1.3 Phương pháp tạo tế bào khả biến 46 2.2.2 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 46 2.2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số (QIAgen RNA extract Kit) 46 2.2.2.2 Phương pháp RT – PCR 47 2.2.2.3 Phương pháp tách chiết plasmid 48 2.2.2.4 Phương pháp ghép nối gen vào vector tách dòng 48 2.2.2.5 Biến nạp vào tế bào E.coli 49 2.2.2.6 Phương pháp cắt DNA plasmid enzyme giới hạn 49 2.2.2.7 Thiết kế vecter biểu pET 22b(+) mang gen vp6 50 2.2.2.8 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose QIAquick Gel Extraction kit 51 2.2.2.9 Điện di DNA gel agarose 51 2.2.2.10 Phương pháp biểu gen 52 2.2.2.11 Phương pháp điện di biến tính gel polyacrylamide – SDS 52 2.2.3 Phƣơng pháp hóa sinh 53 2.2.3.1 Phương pháp tách chiết protein tổng số 53 2.2.3.2 Phương pháp tách chiết protein thể tan 53 2.2.3.3 Thu nhận làm tan thể vùi 54 2.2.3.4 Phương pháp tinh protein cột His-tag kết hợp tái cuộn gấp 54 2.2.3.5 Phương pháp lọc tách hạt virus rotavà tiểu thể thành phần 55 2.2.3.6 Định lượng protein phương pháp Bradford 55 2.2.3.7 Phương pháp Western Blot 56 2.2.3.8 Phương pháp ELISA 56 2.2.4 Phƣơng pháp miễn dịch học 57 2.2.4.1 Phương pháp sản xuất kháng thể 57 2.2.4.2 Phương pháp tinh IgG cột sắc ký lực gắn protein A-Sepharose 58 2.2.4.3 Phương pháp soi hiển vi miễn dịch 59 III 2.2.5 Phƣơng pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch 59 2.2.5.1 Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể nano vàng 59 2.2.5.2 Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 60 2.2.5.3 Phương pháp cố định kháng thể lên màng 60 2.2.5.4 Phương thức hoạt động que thử nhanh 60 2.2.5.5 Phương pháp phân tích mẫu que thử 61 2.2.5.6 Phương pháp tính độ nhạy độ đặc hiệu que thử 61 2.2.6 Các phƣơng pháp tin sinh 61 2.2.6.1 Kiểm tra mồi phần mềm FastPCR 61 2.2.6.2 Kiểm tra vị trí enzyme hạn chế gen đích phần mềm Nebcutter 62 2.2.6.3 Phân tích trình tự gen phần mềm NCBI (Blast,…) 62 2.2.6.4 Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin ExPASy 62 2.2.6.5 Dự đoán cấu trúc VP6 phần mềm RaptorX [121] 62 2.2.6.6 Dự đoán trình tự epitope chuỗi axit amin phần mềm SNMTriP 63 2.2.6.7 Xác định độ protein VP6 sau tinh phần mềm Quanty-One 4.6.9 (Bio- rad) 63 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 3.1 TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VP6 TRONG E COLI 64 3.1.1 Tách dòng gen vp6 kiểu dại 64 3.1.1.1 Khuếch đại gen vp6 64 3.1.1.2 Tách dòng gen vp6 vector pJET1.2 65 3.1.2 Biểu gen vp6 kiểu dại mã hóa protein VP6 69 3.1.2.1 Tạo cấu trúc biểu tái tổ hợp mang gen kiểu dại mã hóa protein VP6 (VP6nat) 69 3.1.2.2 Nghiên cứu biểu gen vp6nat E coli BL21(DE3) 71 3.1.2.3 Tạo cấu trúc biểu tái tổ hợp mang gen tối ưu mã hóa protein VP6 (VP6opt) 76 3.1.2.4 Nghiên cứu biểu gen vp6 tối ưu E coli BL21(DE3) 82 3.1.3 Đánh giá so sánh biểu gen vp6nat vp6opt 87 3.2 THU NHẬN PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH 88 3.2.1 Tách chiết protein VP6 88 3.2.2 Tinh protein VP6 tái tổ hợp tái cuộn gấp 89 3.2.2.1 Tinh protein VP6 tái tổ hợp sắc ký lực gắn Ni2+ 89 3.2.2.2 Đánh giá khả tái cuộn gấp protein VP6 tái tổ hợp sau tinh 91 3.2.3 Đánh giá đặc tính protein VP6 tái tổ hợp sau tinh 92 3.3 TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG PROTEIN VP6 VIRUS ROTA TÁI TỔ HỢP 94 3.3.1 Quy trình gây miễn dịch thỏ 94 IV 3.3.2 Xác định hiệu giá kháng thể phƣơng pháp ELISA 94 3.3.3 Thu nhận tinh kháng thể kháng protein VP6 sắc ký lực cột protein A-Sepharose 95 3.3.4 Xác định đặc tính kháng thể 97 3.4 TẠO QUE THỬ CHẨN ĐOÁN VIRUS ROTA 100 3.4.1 Nghiên cứu điều kiện cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuPNs 101 3.4.2 Nghiên cứu cố định kháng thể màng nitrocellulose 105 3.4.3 Tối ƣu dịch ly giải mẫu 106 3.4.4 Khảo sát đánh giá que thử 107 3.4.4.1 Khảo sát phản ứng chéo 109 3.4.4.2 Khảo sát ngưỡng phát 110 3.4.4.3 Khảo sát khả que thử với nhóm virus rota khác type 111 3.4.4.4 Khảo sát độ nhạy độ đặc hiệu mẫu bệnh phẩm 113 3.4.4.5 Khảo sát thời gian bảo quản que thử 113 CHƢƠNG KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 115 4.1 KẾT LUẬN 115 4.2 KIẾN NGHỊ 116 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO 118 PHỤ LỤC 127 Phụ lục 1: Môi trƣờng hóa chất 127 Phụ lục 2: Trình tự gen vp6 ngân hàng liệu NCBI 129 Phụ lục 3: Trình tự gen vp6 vector tách dòng pJET1.2 so sánh với trình tự gen (GenBank: HQ392338.1) 130 Phụ lục 4: Cây phân loại theo trình tự gen vp6 virus rota 132 Phụ lục 5: Cây phân loại theo trình tự axit amin VP6 virus rota 133 Phụ lục 6: Kết giải trình tự gen vp6nat vector pET22b+ 134 Phụ lục 7: Kết giải trình tự gen vp6opt vector pET22b+ 137 Phụ lục 8: Trình tự gen VP6opt pET22b(+) so sánh với trình từ gen VP6 tổng hợp (Genscript) 141 Phụ lục 9: Kết tín hiệu ELISA OD450nm 143 Phụ lục 10: Tóm tắt quy trình xét nghiệm 144 Phụ lục 11: Kết khảo sát thử nghiệm kit mẫu bệnh phẩm 146 V DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Amp Ampicillin Kháng sinh Ampicilline AP Alkaline phosphatase Enzyme Alkaline phosphatase Anti-VP6IgG Anti VP6 protein-IgG Kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợp AuNPs Gold nanoparticle Hạt nano vàng 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl Muối 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt phosphate disodium bp Base pair Cặp base BSA Bovine Albumine Serum Albumine huyết bò CBB Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue CBD Chitin-binding domain Vùng gắn với chitin Complementary Chuỗi Axit Deoxyribonucleic acid bổ Deoxyribonucleic acid sung CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành huẩn lạc dATP Deoxyadenosine triphosphate Nucleotid Adenosine -A dCTP Deoxycytidine triphosphate Nucleotid Cytidine - C dGTP Deoxyguanosine triphosphate Nucleotid Guanosine -G dTTP Deoxythymidine triphosphate Nucleotid Thymidine - T DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic dNTPs Deoxyribonucleoic Triphosphates Chứa nucleotid A,T,C G BCIP cDNA dsRNA DTT Double stranded Ribonucleic Acid 1,4-Dithiothreitol 1-Ethyl-3-(3- EDC dimethylaminopropyl) carbodiimide EDTA RNA sợi đôi 1,4-Dithiothreitol 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Ethylene diamine tetraacetic acid Ethylene diamine tetraacetic acid Enzyme-Linked ImmunoSorbent Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết Assay enzyme EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide FCA Freund‟s Complete Adjuvant Tá dược toàn phần FIA Freund‟s Incomplete Adjuvant Tá dược không toàn phần ELISA VI 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv 2161971_Pv GCTAGATTTG GTACTATTGT CGCAAGAAAT TTTGATACAA TTCGTCTATC | | | | | | | | | | 1010 1020 1030 1040 1050 ATTCCAATTA ATGCGTCCAC CAAACATGAC GCCAGCCGTA AATGCATTAT | | | | | | | | | | 1060 1070 1080 1090 1100 TTCCGCAAGC ACAACCTTTT CAACATCATG CAACAGTTGG ACTTACGTTA | | | | | | | | | | 1110 1120 1130 1140 1150 CGTATTGAAT CTGCAGTTTG TGAATCAGTG CTTGCGGATG CAAATGAAAC | | | | | | | | | | 1160 1170 1180 1190 1200 TTTATTGGCG AATGTTACCG CAGTACGTCA AGAGTATGCT ATACCAGTTG | | | | | | | | | | 1210 1220 1230 1240 1250 GACCAGTATT TCCACCAGGC ATGATTGGGC TGAGCTAATT CCTACTATTC | | | | | | | | | | 1260 1270 1280 1290 1300 CCCATTAGGG AAAAAAATTT GCAGGGTGCC TTTAAGTAAC CCTTTATAAG | | | | | | | | | | 1310 1320 1330 1340 1350 ATCAAAAAGT TGGGGGCGCC TTCGGAACCC CCCCCCCCCC CCTGGAAATC | | | | | | | | | | 1360 1370 1380 1390 1400 CGGTGCTAAA AAACCCGCAG AGAGCTTATT TGTCTTGCCC CCCTAGAAAA | | | | | | | | | | 1410 1420 1430 1440 1450 AATAAAATAA ACCCCTGGGC CCTCAAACGG CCTGGAGGGT TTTTTCTAAA | | | | | | | | | | 1460 1470 1480 1490 1500 GAGAACATTT CCCGGTGGGA GGGGAGGCCC CCTTCCGCCC TAAACCGGGG | | | | | | | | | | 1510 1520 1530 1540 1550 CGTTGGGTGA CCACCCGGGC CACTGGACGG CCACACGCCG CTCTTTTCTC | | | | | | | | | | 1560 1570 1580 1590 1600 CTTTTTCCCC ACGGGGGCCC CCAAAAAAGG CGGCGTGCCG ATATTTTGGT | | | | | | | | | | 1610 1620 1630 1640 1650 ACCACCATAG ATAGGGGTAT GGGGACCCGT AGGGTTCCTT TTAGACACTC | | | | | | | | 1660 1670 1680 1690 TTGCATAATT GTTTACGAAG GGGGAGGACA CGCTTCTTTA TACG Alignment: 1st_BASE_2161972_Pvp6n_T7_terminator 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 AGGGGCCCCT AGCTCTTTCG GGCTTTGTTA GCAGCCGGAT CTCAGTGGTG | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 GTGGTGGTGG TGCTCGAGTG CGGCCGCAAG CTTGTCGACT CTGATAGAGG | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 CTACTGTAAA GACACGCTGC AAATTATCTT CCCTAGATGG TGAATAGTTA | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 GTAATTAGCT CAGTCCAATT CATGCCTGGT GGAAATACTG GTCCAACTGG | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 TATAGCATAC TCTTGACGTA CTGCGGTAAC ATTCGCCAAT AAAGTTTCAT | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 135 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv TTGCATCCGC AAGCACTGAT TCACAAACTG CAGATTCAAT ACGTAACGTA | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 AGTCCAACTG TTGCATGATG TTGAAAAGGT TGTGCTTGCG GAAATAATGC | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 ATTTACGGCT GGCGTCATGT TTGGTGGACG CATTAATTGG AATGATAGAC | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 GAATTGTATC AAAATTTCTT GCGACAATAG TACCAAATCT AGCTTGATAT | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 GTATTAATAA TTTGTCCATT CAGTAAAAAT TCTACTTCTA CATTGTTTGG | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 TCTTAGGATG ATTGGATTAA AGAACCATGT AGTTGCGCCA TCTGCTGAAT | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 TAATAACTCT TGGAAAACTA AATCTCTCTG CATCAGGTAA CAAAGTTATA | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 GTAGCTGTAG TTAGCGCACG CCTTAGCTGG ACAATATGTT CAAATTGCTG | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 AATATTTGCT GGAGCATTTA GAGCACACGA ATAGTCAAAT CCAGCCACTT | | | | | | | | | | 710 720 730 740 750 GAATTTCTGA TCCAGCATTA AGCCACATGG TTCCCATTAA ATTGTCATGC | | | | | | | | | | 760 770 780 790 800 ATTGGTTGGG ACCTATTTAA AGTAAATGAT GCTGAGTATG GAAATATATT | | | | | | | | | | 810 820 830 840 850 AGGTTTATGA AAAACAAATC CAGTACGTTG TCTTCTATTT TGTAAATTCC | | | | | | | | | | 860 870 880 890 900 AATTTTCTAT ATATTCTGAT GAATTATTAA AGTTTATTCT TTTAAATTTA | | | | | | | | | | 910 920 930 940 950 ATACCGGCTA GCTTTCTCAA TGCTTCAGAT TGTGGAGCTA CTCCGTTTCT | | | | | | | | | | 960 970 980 990 1000 TTGAGACTCT CTTGCCATTT CATCCATACA TACATTATCA ATGAAATCAA | | | | | | | | | | 1010 1020 1030 1040 1050 TAAAATAATC AATCGTAGTT CTGGCAGTCT CAACATAATT AGCATCAAGA | | | | | | | | | | 1060 1070 1080 1090 1100 TTTAAAAGCG TAGTACCTAG TAGACCAAAG TCAAATGTCC AATTTCTAAT | | | | | | | | | | 1110 1120 1130 1140 1150 GGGTAAATTA CCAATTCCTC CAGTTTGAAA GTCATTTCCG TTCAGGGTAC | | | | | | | | | | 1160 1170 1180 1190 1200 CATCATTTGA TAAATTGCTG AAAAGATCGC TAACTTTAAA AATAATGGAC | | | | | | | | | | 1210 1220 1230 1240 1250 CTTCAAAATC TTATCCTAGC ATCTTTAAAG TGGATCCAAT TAATTCCAAT | | | | | | | | | | 1260 1270 1280 1290 1300 TCCTGGCCAT CCCCGGTTGG AAGGAGGAAC ACAAACCCCC CCCCGGTCGG | | | | | | | | | | 1310 1320 1330 1340 1350 CACCGGATTC CATTGTATTC CCTTCTAAGT TAACAAATTT TTTCAAGGGG 136 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv 2161972_Pv | | | | | | | | | | 1360 1370 1380 1390 1400 AATGTTATCC GCTCAATTCC TCTATGGAGC GCATTAATTC CGGGGATAGA | | | | | | | | | | 1410 1420 1430 1440 1450 ATTCTATCCT TTACCGAGAA CTTGGTGCGA TAACCGGCCC AATGTGGGGT | | | | | | | | | | 1460 1470 1480 1490 1500 TGTGCCCTAA TCCCAAACCC GCTGAGAATA GGCCCCTCTT CTTAAAAACT | | | | | | | | | | 1510 1520 1530 1540 1550 TTTTGCGGGG TTGAGAAGCC CCCCGGGTGA AGTGGTCCCT CTTTTCCCAT | | | | | | | | | | 1560 1570 1580 1590 1600 TCTTGGGGGG ACACCACCCA ATCGTGGTCT GGTATCATGA AGGTAACCCA | GCTCATAG Phụ lục 7: Kết giải trình tự gen vp6opt vector pET22b+ Alignment: 1st_BASE_2163902_pVP6O_T7_promoter 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 GGGGGGGGGA AAATTCCCTC TAGAATAATT TTGTTTAACT TTAAGAAGGA | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 GATATACATA TGAAATACCT GCTGCCGACC GCTGCTGCTG GTCTGCTGCT | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 CCTCGCTGCC CAGCCGGCGA TGGCCATGGA TATCGGAATT AATTCGGATC | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 CAACCCTGAA AGATGCGCGC GATAAAATTG TGGAAGGCAC CCTGTATAGC | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 AACGTGAGCG ATCTGATTCA GCAGTTTAAC CAGATGATTG TGACCATGAA | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 CGGCAACGAT TTTCAGACCG GCGGCATTGG CAACCTGCCG ATTCGCAACT | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 GGACCTTTGA TTTTGGCCTG CTGGGCACCA CCCTGCTGAA CCTGGATGCG | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 AACTATGTGG AAACCGCGCG CACCACCATT GAATATTTTA TTGATTTTAT | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 TGATAACGTG TGCATGGATG AAATGGCGCG CGAAAGCCAG CGCAACGGCG | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 TGGCGCCGCA GAGCGAAGCG CTGCGCAAAC TGGCGGGCAT TAAATTTAAA | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 CGCATTAACT TTAACAACAG CAGCGAATAT ATTGAAAACT GGAACCTGCA | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 GAACCGCCGC CAGCGCACCG GCTTTGTGTT TCATAAACCG AACATTTTTC 137 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV 2163902_pV | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 CGTATAGCGC GAGCTTTACC CTGAACCGCA GCCAGCCGAT GCATGATAAC | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 CTGATGGGCA CCATGTGGCT GAACGCGGGC AGCGAAATTC AGGTGGCGGG | | | | | | | | | | 710 720 730 740 750 CTTTGATTAT AGCTGCGCGC TGAACGCGCC GGCGAACATT CAGCAGTTTG | | | | | | | | | | 760 770 780 790 800 AACATATTGT GCAGCTGCGC CGCGCGCTGA CCACCGCGAC CATTACCCTG | | | | | | | | | | 810 820 830 840 850 CTGCCGGATG CGGAACGCTT TAGCTTTCCG CGCGTGATTA ACAGCGCGGA | | | | | | | | | | 860 870 880 890 900 TGGCGCGACC ACCTGGTTTT TCAACCCGAT TATTCTGCGC CCGAACAACG | | | | | | | | | | 910 920 930 940 950 TGGAAGTGGA ATTTCTGCTG AACGGCCAGA TTATTAACAC CTATCAGGCG | | | | | | | | | | 960 970 980 990 1000 CGCTTTGGCA CCATTGTGGC GCGCAACTTT GATACCATTC GCCTGAGCTT | | | | | | | | | | 1010 1020 1030 1040 1050 TCAGCTGATG CGCCCGCCGA ACATGACCCC GGCGGTGAAC GCGCTGTTTC | | | | | | | | | | 1060 1070 1080 1090 1100 CGCAGGCGCA GCCGTTTCAG CGCCATGCGA CCGTGGGCCT GACCCTGCGC | | | | | | | | | | 1110 1120 1130 1140 1150 ATTGAAAGCC CGGTGTGCAA AAGCTTGCTG GCGGATGCGA ACGAAACCCT | | | | | | | | | | 1160 1170 1180 1190 1200 GCTGGCGAAC GTGACCGCGG TGCGCCAGGA ATATGCGATT CCGGTGGGCC | | | | | | | | | | 1210 1220 1230 1240 1250 CGGGGTTTCC GCCGGGCATG AACTGGACCG AACTGATTAC CAACTTAAGC | | | | | | | | | | 1260 1270 1280 1290 1300 CCGAGCCCGG AAATAACCTG CAGGCCGTGT TTACCGGGGG GAGCATTCCG | | | | | | | | | | 1310 1320 1330 1340 1350 TCCACAAATT TGGGGGCGCC CTTGGAACCA CCCCCCACAC CCTGGAAATC | | | | | | | | | | 1360 1370 1380 1390 1400 CGGTGGTAAA AAATCCCAAA GAGAACTGAA TTGGTTGTGC CCCCGTGAAA | | | | | | | | | | 1410 1420 1430 1440 1450 AAAAAAAAAA AACCCTTGTG GCTCAAAAGG GCTTGGAGGT TTTTTGGAAA | | | | | | | | | | 1460 1470 1480 1490 1500 GAGATATAAT CCCGGTTGGA AAGGGGACCC CCTCTAGGGC CTATCACCCC | | | | | | | | | | 1510 1520 1530 1540 1550 GTGGGTGGGG GTTACCCCCA AGGCCCCAAA TCATCGCCCC CCAACCCTCG | | | | | | | | | | 1560 1570 1580 1590 1600 CTTTTTCTTT CTTTTTTTTG GAAGGGGGCG TCGGGTTAAA AAGGGGAGTG | | | | | | | | | | 1610 1620 1630 1640 1650 ACCGGAGTAA ATTGCGCCTA GACACCCTCA TAAAAAGGTT GAAGAGGCCT | | | | | | | | | 138 2163902_pV 1660 1670 1680 1690 TGTGTGCGCT TTCGGTTTTG CACTTTTCAA TTCTTCTGCT TACATCGG Alignment: 1st_BASE_2165728_pVP6O_T7_terminator 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 TGGGCCCTAG CTTCTTTCGG GCTTTGTTAG CAGCCGGATC TCAGTGGTGG | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 TGGTGGTGGT GCTCGAGTGC GGCCGCAAGC TTGTCGACGC GAATGCTCGC | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 CACGGTAAAC ACGCGCTGCA GGTTATCTTC GCGGCTCGGG CTATAGTTGG | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 TAATCAGTTC GGTCCAGTTC ATGCCCGGCG GAAACACCGG GCCCACCGGA | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 ATCGCATATT CCTGGCGCAC CGCGGTCACG TTCGCCAGCA GGGTTTCGTT | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 CGCATCCGCC AGCACGCTTT CGCACACCGC GCTTTCAATG CGCAGGGTCA | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 GGCCCACGGT CGCATGGCGC TGAAACGGCT GCGCCTGCGG AAACAGCGCG | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 TTCACCGCCG GGGTCATGTT CGGCGGGCGC ATCAGCTGAA AGCTCAGGCG | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 AATGGTATCA AAGTTGCGCG CCACAATGGT GCCAAAGCGC GCCTGATAGG | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 TGTTAATAAT CTGGCCGTTC AGCAGAAATT CCACTTCCAC GTTGTTCGGG | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 CGCAGAATAA TCGGGTTGAA AAACCAGGTG GTCGCGCCAT CCGCGCTGTT | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 AATCACGCGC GGAAAGCTAA AGCGTTCCGC ATCCGGCAGC AGGGTAATGG | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 TCGCGGTGGT CAGCGCGCGG CGCAGCTGCA CAATATGTTC AAACTGCTGA | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 ATGTTCGCCG GCGCGTTCAG CGCGCAGCTA TAATCAAAGC CCGCCACCTG | | | | | | | | | | 710 720 730 740 750 AATTTCGCTG CCCGCGTTCA GCCACATGGT GCCCATCAGG TTATCATGCA | | | | | | | | | | 760 770 780 790 800 TCGGCTGGCT GCGGTTCAGG GTAAAGCTCG CGCTATACGG AAAAATGTTC | | | | | | | | | | 810 820 830 840 850 GGTTTATGAA ACACAAAGCC GGTGCGCTGG CGGCGGTTCT GCAGGTTCCA | | | | | | | | | | 860 870 880 890 900 GTTTTCAATA TATTCGCTGC TGTTGTTAAA GTTAATGCGT TTAAATTTAA | | | | | | | | | | 910 920 930 940 950 TGCCCGCCAG TTTGCGCAGC GCTTCGCTCT GCGGCGCCAC GCCGTTGCGC 139 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV | | | | | | | | | | 960 970 980 990 1000 TGGCTTTCGC GCGCCATTTC ATCCATGCAC ACGTTATCAA TAAAATCAAT | | | | | | | | | | 1010 1020 1030 1040 1050 AAAATATTCA ATGGTGGTGC GCGCGGTTTC CACATAGTTC GCATCCAGGT | | | | | | | | | | 1060 1070 1080 1090 1100 TCAGCAGGGT GGTGCCCAGC AGGCCAAAAT CAAAGGTCCA GTTGCGAATC | | | | | | | | | | 1110 1120 1130 1140 1150 GGCAGGTTGC CAATGCCCGC CGGTCTGAAA ATCGTTGCCG TTCATGGTCA | | | | | | | | | | 1160 1170 1180 1190 1200 CAATCATCTG GTTAAACTGC TGAATCAAAT CGCTCACGTT GCTATACAGG | | | | | | | | | | 1210 1220 1230 1240 1250 GGTGCCTTCC CCAATTTTTA TCGCCGGACT TCTTTCAGGG GTTGGATCCC | | | | | | | | | | 1260 1270 1280 1290 1300 AATTAATTCC GAAATCCCAG GGCCATTGCC CGGTTTGGGG CACGAGGAAA | | | | | | | | | | 1310 1320 1330 1340 1350 ACCCAAAAAC AACCCAACCC GGTTGGCGAC ACGGGATTTT CATTGGTTAA | | | | | | | | | | 1360 1370 1380 1390 1400 TTCTTCCTAT AAAGTTACAC AATTTATTTT TCAAAGGGGA AATTGTTTCT | | | | | | | | | | 1410 1420 1430 1440 1450 CCGCCCAACT TCCCCTTAAG GGGGGCCGAT TATTTTTCCG GCGCAAAAAT | | | | | | | | | | 1460 1470 1480 1490 1500 TTCCGATCCC TTGCCGGAAT AACTTGGCGG CAGTAAACCG CGCCCACACT | GGCGTCCGG 140 Phụ lục 8: Trình tự gen VP6opt pET22b(+) so sánh với trình từ gen VP6 tổng hợp (Genscript) RBS Start pelB T7primer.pETVP6opt pt TAAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTC VP6opt pt.Seque T7primer.pETVP6opt pt CTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCAACCCTGAAA VP6opt pt.Seque GGATCCAACCCTGAAA BamHI **************** T7primer.pETVP6opt pt GATGCGCGCGATAAAATTGTGGAAGGCACCCTGTATAGCAACGTGAGCGATCTGATTCAG VP6opt pt.Seque GATGCGCGCGATAAAATTGTGGAAGGCACCCTGTATAGCAACGTGAGCGATCTGATTCAG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CAGTTTAACCAGATGATTGTGACCATGAACGGCAACGATTTTCAGACCGGCGGCATTGGC VP6opt pt.Seque CAGTTTAACCAGATGATTGTGACCATGAACGGCAACGATTTTCAGACCGGCGGCATTGGC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt AACCTGCCGATTCGCAACTGGACCTTTGATTTTGGCCTGCTGGGCACCACCCTGCTGAAC VP6opt pt.Seque AACCTGCCGATTCGCAACTGGACCTTTGATTTTGGCCTGCTGGGCACCACCCTGCTGAAC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CTGGATGCGAACTATGTGGAAACCGCGCGCACCACCATTGAATATTTTATTGATTTTATT VP6opt pt.Seque CTGGATGCGAACTATGTGGAAACCGCGCGCACCACCATTGAATATTTTATTGATTTTATT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt GATAACGTGTGCATGGATGAAATGGCGCGCGAAAGCCAGCGCAACGGCGTGGCGCCGCAG VP6opt pt.Seque GATAACGTGTGCATGGATGAAATGGCGCGCGAAAGCCAGCGCAACGGCGTGGCGCCGCAG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt AGCGAAGCGCTGCGCAAACTGGCGGGCATTAAATTTAAACGCATTAACTTTAACAACAGC VP6opt pt.Seque AGCGAAGCGCTGCGCAAACTGGCGGGCATTAAATTTAAACGCATTAACTTTAACAACAGC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt AGCGAATATATTGAAAACTGGAACCTGCAGAACCGCCGCCAGCGCACCGGCTTTGTGTTT VP6opt pt.Seque AGCGAATATATTGAAAACTGGAACCTGCAGAACCGCCGCCAGCGCACCGGCTTTGTGTTT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CATAAACCGAACATTTTTCCGTATAGCGCGAGCTTTACCCTGAACCGCAGCCAGCCGATG VP6opt pt.Seque CATAAACCGAACATTTTTCCGTATAGCGCGAGCTTTACCCTGAACCGCAGCCAGCCGATG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CATGATAACCTGATGGGCACCATGTGGCTGAACGCGGGCAGCGAAATTCAGGTGGCGGGC VP6opt pt.Seque CATGATAACCTGATGGGCACCATGTGGCTGAACGCGGGCAGCGAAATTCAGGTGGCGGGC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt TTTGATTATAGCTGCGCGCTGAACGCGCCGGCGAACATTCAGCAGTTTGAACATATTGTG VP6opt pt.Seque TTTGATTATAGCTGCGCGCTGAACGCGCCGGCGAACATTCAGCAGTTTGAACATATTGTG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CAGCTGCGCCGCGCGCTGACCACCGCGACCATTACCCTGCTGCCGGATGCGGAACGCTTT VP6opt pt.Seque CAGCTGCGCCGCGCGCTGACCACCGCGACCATTACCCTGCTGCCGGATGCGGAACGCTTT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt AGCTTTCCGCGCGTGATTAACAGCGCGGATGGCGCGACCACCTGGTTTTTCAACCCGATT 141 VP6opt pt.Seque AGCTTTCCGCGCGTGATTAACAGCGCGGATGGCGCGACCACCTGGTTTTTCAACCCGATT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt ATTCTGCGCCCGAACAACGTGGAAGTGGAATTTCTGCTGAACGGCCAGATTATTAACACC VP6opt pt.Seque ATTCTGCGCCCGAACAACGTGGAAGTGGAATTTCTGCTGAACGGCCAGATTATTAACACC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt TATCAGGCGCGCTTTGGCACCATTGTGGCGCGCAACTTTGATACCATTCGCCTGAGCTTT VP6opt pt.Seque TATCAGGCGCGCTTTGGCACCATTGTGGCGCGCAACTTTGATACCATTCGCCTGAGCTTT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CAGCTGATGCGCCCGCCGAACATGACCCCGGCGGTGAACGCGCTGTTTCCGCAGGCGCAG VP6opt pt.Seque CAGCTGATGCGCCCGCCGAACATGACCCCGGCGGTGAACGCGCTGTTTCCGCAGGCGCAG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CCGTTTCAGCGCCATGCGACCGTGGGCCTGACCCTGCGCATTGAAAGCgcggtgtgcgaa VP6opt pt.Seque CCGTTTCAGCGCCATGCGACCGTGGGCCTGACCCTGCGCATTGAAAGCGCGGTGTGCGAA ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt agcgtgctggcggatgcgaacgaaaccctgctggcgaacgtgaccgcggtgcgccaggaa VP6opt pt.Seque AGCGTGCTGGCGGATGCGAACGAAACCCTGCTGGCGAACGTGACCGCGGTGCGCCAGGAA ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt tatgcgattccggtgggcccggtgtttccgccgggcatgaactggaccgaactgattacc VP6opt pt.Seque TATGCGATTCCGGTGGGCCCGGTGTTTCCGCCGGGCATGAACTGGACCGAACTGATTACC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt aactatagcccgagccgcgaagataacctgcagcgcgtgtttaccgtggcgagcattcgc VP6opt pt.Seque AACTATAGCCCGAGCCGCGAAGATAACCTGCAGCGCGTGTTTACCGTGGCGAGCATTCGC ************************************************************ SalI 6xHis Stop T7primer.pETVP6opt pt gtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgct VP6opt pt.Seque GTCGAC -****** 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 PBS VB -0.1 142 MC Phụ lục 9: Kết tín hiệu ELISA OD450nm Kết ELISA đánh giá khả tái cuộn gấp protein VP6 TTH tinh Giếng Mẫu L1 L2 Trung SD bình PBS 0,214 0,236 0,225 0,011 VB 0,530 0,571 0,550 0,021 MC 0,685 0,702 0,693 0,009 Ure 0,570 0,600 0,585 0,015 Kết tín hiệu ELISA đánh giá trạng thái cấu trúc VP6 TTH so với VP6 tự nhiên Giếng Mẫu PBS L2 Trung bình SD 0,223 0,207 0,215 0,002 VP6 TTH 0,678 0,708 0,693 0,033 0,578 0,007 VP6 tự L1 nhiên 0,577 0,58 Kết ELISA đánh giá khả nhận biết anti-VP6IgG với kháng nguyên VP6 TTH VP6 tự nhiên Trung Giếng Mẫu L1 L2 VP6 tự nhiên 1,429 1,416 1,423 0,007 VP6 TTH 1,673 1,647 1,660 0,013 PBS 0,197 0,204 0,201 0,004 bình SD 143 Phụ lục 10: Tóm tắt quy trình xét nghiệm I Thành phần xét nghiệm - Kit thử - Tăm lấy mẫu - Ống đựng dịch đệm hòa mẫu - Hướng dẫn sử dụng - Ống bóp hút mẫu II Bảo quản - Bảo quản kit thử nhiệt độ phòng (1-300C) - Không bảo quản nhiệt độ âm - Không sử dụng kit thử túi nhôm bị rách hỏng - Không sử dụng kit hết hạn sử dụng III Thu mẫu bệnh phẩm, bảo quản thận trọng Lấy mẫu Chuẩn bị - Dùng tăm lấy khoảng 50 mg mẫu phân - Đặt tăm vào ống nghiệm c dung môi - Xoay tăm 10 lần mẫu hòa tan dung môi Loại bỏ tăm Hút µl vào que thử Vận chuyển mẫu bảo quản - Mẫu nên sử dụng sau lấy - Mẫu bảo quản nhiệt độ 2-8oC 72 Trong trường hợp lưu mẫu lâu phải bảo quản nhiệt độ âm sâu: -200C Thận trọng - Nên lấy mẫu triệu chứng bệnh xuất - Mẫu phân trực tiếp xét nghiệm nên đựng ống nghiệm không chứa môi trường, chất bảo quản hay phụ gia gây phản ứng với kit thử IV Quy trình xét nghiệm Chuẩn bị mẫu chiết - Que thử mẫu đưa nhiệt độ phòng để tiến hành xét nghiệm - Cho dung dịch hòa vào ống nghiệm - Lấy khoảng 50 mg phân tăm vô trùng c sẵn - Nhúng tăm vào ống nghiệm chứa dung môi - Lắc 10 lần mẫu hòa tan dung môi - Bỏ tăm khỏi ống nghiệm Quy trình thực 144 - Lấy thử khỏi túi đặt bề mặt phẳng, khô - Hút 100 µl vào giếng mẫu thử Khi test thử bắt đầu hoạt động, màu đỏ tía chạy dọc cửa sổ đọc kết - Đọc kết vòng 15-20 phút Nhận định kết V  Test thử hoạt động tốt xuất vạch đỏ tía phía trái cửa sổ đọc kết - vạch chứng C  Vị trí bên phải vùng đọc kết thử vị trí thử T Nếu thử xuất vạch màu đỏ tía đ vạch thử T - Âm tính: xuất vạch màu đỏ tía vị trí C - Dương tính: xuất vạch màu đỏ tía vạch chứng C vạch thử T - Không có giá trị: vạch màu thử sau nhỏ mẫu bệnh phẩm xuất vạch T Nguyên nhân không làm theo hướng dẫn sử dụng kit thử hỏng 145 Phụ lục 11: Kết khảo sát thử nghiệm kit mẫu bệnh phẩm Que thử PCR ELISA OD450nm Chứng KC+ KC- 10 0.682 0,492 0,392 0,396 0,289 0,537 0,513 0,351 0,338 0,421 1,6.106 PBS2 Que thử PCR 146 ELISA OD450nm Chứng 11 KC+ KC- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0,231 0,689 0,401 0,489 0,378 0,513 0,536 0,413 0,322 0,253 1,6.106 PBS2 Que thử PCR ELISA OD450nm Chứng 21 KC+ KC- 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0,887 0,497 0,429 0,534 0,501 0,488 0,489 0,327 0,398 0,467 1,6.106 PBS2 Hình 53: Thử nghiệm que thử mẫu bệnh phẩm dương tính với virus rota Que thử 147 PCR ELISA OD450nm Chứng KC+ KC- 10 0,043 0,067 0,065 0,059 0,078 0,038 0,069 0,068 0,061 0,063 1,6.106 PBS2 Que thử PCR ELISA OD450nm Chứng KC+ 11 KC- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0,047 0,068 0,066 0,053 0,069 0,048 0,055 0,055 0,058 0,050 1,6.106 PBS2 Que thử 148 PCR ELISA OD450nm Chứng KC+ 21 KC- 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0,046 0,054 0,066 0,053 0,067 0,065 0,045 0,066 0,068 0,052 1,6.106 PBS2 Hình 54: Thử nghiệm que thử mẫu bệnh phẩm âm tính với virus rota 149 ... mục tiêu: - Tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp virus rota - Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 virus rota - Thử nghiệm ứng dụng cho phát triển que thử phát nhanh virus rota dựa vào nguyên lý... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐỖ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA. .. 170] Xuất phát từ sở lý luận thực tiễn nêu tiến hành nghiên cứu đề tài: " Nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát nhanh virus rota" Với