TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC AN TOÀN SINH HỌC Chuyên đề: Phân tích trình phát triển tính kháng côn trùng mục tiêu phát triển trồng chuyển gen kháng sâu sử dụng gen có nguồn gốc từ vi khuẩn BT (Bacillus thuringiensis) Giảng viên hướng dẫn: Danh sách thành viên nhóm 5: PHẦN I BẢN WORD A, PHẦN MỞ ĐẦU  Từ năm 1996, loại trồng biến đổi gen để có khả tạo loại protein từ vi khuẩn mà gây độc cho loại côn trùng đó, an toàn cho người Chúng trồng 200 triệu toàn giới Phổ biến loại “cây trồng Bt”, “Bt” xuất phát từ tên loài vi khuẩn Bacillus thuringiensis, với khả tạo loại protein tiêu diệt hầu hết loại côn trùng, cho phép nông dân tiết kiệm tiền giảm ảnh hưởng đến môi trường từ việc giảm việc phun thuốc diệt côn trùng  Tuy nhiên, côn trùng phát triển khả kháng chất độc, cần nhiều chiến lược để đảm bảo trồng Bt hiệu Một nghiên cứu đăng tạp chí Economic Entomology tháng 12, nghiên cứu thực phân tích liệu kháng bệnh loại côn trùng châu lục rút vấn đề yếu tồn chiến lược nhằm dự đoán, kiểm soát loại côn trùng kháng loại trồng Bt B, NỘI DUNG I, Tính kháng công nghệ Bt Tính kháng a, khái niệm Là khả loại bỏ khắc phục hoàn toàn, mức độ ảnh hưởng tác nhân gây bệnh yếu tố gây hại b, Thuyết đối gen quy luật tiến hóa  Đối với gen qui định tính kháng kí chủ có gen tương ứng qui định tính gây bệnh ký sinh  Đối với gen qui định tính kháng ký chủ có gen tương ứng qui định tính không độc ký sing gen tương tác đặc hiệu với  Cả gen kháng ký chủ gen không độc ký sinh phải biểu để tạo tính kháng Công nghệ Bt a, Khái niệm Bt Bacillus thuringiensis (viết tắt: Bt) vi khuẩn Gram dương, loài vi khuẩn đất điển hình phân lập vùng Thuringia, Đức Bt có khả tổng hợp protein gây tệ liệt ấu trùng số loài côn trùng gây hại, có sâu đục bông, loài sâu đục thân ngô châu Á Châu Âu Chúng sâu hại thực vật phổ biến, có khả gây tàn phá nghiêm trọng (theo Wikipedia)  Protein Cry từ vi khuẩn BT nhóm đa dạng protein có hoạt tính chống lại côn trùng đặc hiệu khác – Lepidoptera( cánh phấn), Coleoptera( cánh cứng) , Diptera ( ruồi) chống lại loài không xương sống khác giun tròn Khi hình thành bào tử, vi khuẩn BT có khả tổng hợp kết tinh protein độc tố phía bên (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Hình dạng tinh thể phụ thuộc vào gen mã hóa protein Có thể hình chóp( protein dietj côn trùng cánh vảy), dạng vô định hình ( protein diệt côn trùng cánh), hình chữ nhật lập phương… Ngày BT chia 50 nhóm 200 thành viên khác ( theo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) - Các loại độc tố BT sinh ra: Ngoại độc tố α (α - extoxin) - Ngoại độc tố β (β–exotoxin) - Ngoại độc tố γ (γ - extoxin) - Nội độc tố δ (δ- extoxin) - Người ta quan tâm đến nội độc tố định đến hoạt tính diệt côn trùng vi khuẩn Bào tử Bt tinh thể độc tố Bào tử ( spore ) Bacillus Bacillus sphaericus  Gen mã hóa cho loại Cry  tinh thể độc ( Crystal) thuringiensis ( trái ) ( phải) protein gọi gen b, Công nghệ Bt gì?  Công nghệ Bt truyền thống Bt nuôi cấu dễ dàng nhờ trình lên men Vì vậy, Bt sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt côn trùng từ 40 năm nhiêu nơi trênthế giới Đặc biệt, Bt đem lại lợi ích to lớn cho nông trại hữu chúng coi thuốc trừ sâu đạt tiêu chuẩn hữu Tùy thuộc vào cấu trúc (dạng hạt hay dạng dịch) mà thuốc diệt côn trùng Bt phun hay rắc Tuy nhiên, tồn số hạn chế định hai trường hợp ứng dụng thuốc diệt côn trùng Bt khó tiếp xúc với côn trùng đích ẩn sâu lá, đất Những bất lợi hoàn toàn loại trừ nhờ công nghệ sinh học đại  Công nghệ Bt đại Các nhà khoa học tiến hành chuyển gen Bt mã hóa cho protein tinh thể độc tố từ vi khuẩn Bt vào thực vật Cây trồng chuyển gen Bt có khả tự kháng lại sâu hại đích Các protein sản sinh thực vật không bị rửa trôi hay bị phân huỷ ánh nắng mặt trời.Vì vậy, điều kiện sinh thái, khí hậu trồng bảo vệ khỏi công sâu đục thân, hay đục c, Cơ chế tác động protein Bt Cơ chế : trước hết côn trùng hay sâu hại ăn tinh thể vào ruột, tác dụng môi trường PH cao, tinh thể hòa tan thủy phân tiền độc tố diệt côn trùng có trọng lượng phân tử khoảng 130kDa 70 kDa thành δ- extoxin Các độc tố bám dinh thượng bì ruột nhờ thụ thể có màng tế bào để phá hủy tế bào Vật chủ ăn tiêu hóa, chết khoảng thời gian ngắn sau Bt Cry gọi “chất độc hình thành lỗ rỗng tế bào” Các độc tố α-xoắn ốc, khu vực α-xoắn hình thành lỗ chân lông xuyên màng, độc tố β-barrel chèn vào màng cách hình thành β- barrel từ monomer  Tùy thuộc loại sâu, côn trùng, loại protein Cry khác dẫn đến thụ thể đường dẫn đến chết tế bào khác Nhưng nghiên cứu nhiều Cry Cry  Ví dụ: thụ thể gắn kết ấu trùng bướm: Cry1A, bốn liên kết protein khác nghiên cứu khác nhau, protein cadherin-như (CADR), glycosylphosphatidyl-inositol (GPI)-neo aminopeptidase-N (APN),một phosphatase kiềm GPI-neo (ALP) 270 kDa glycoconjugate Cơ chế kháng côn trùng • Ngày có nhiều trường hợp kháng BT phát hiên  Protein độc tố Cry bắt buộc phải có “thụ thể đặc hiệu” bám dinh bề mặt màng tế bào gây chết tế bào  Dựa vào đặc điểm này, côn trùng đích phát triển tính kháng a, Kháng chuyển hóa Trong chế phân tử hóa chất diệt xâm nhập vào thể, tác dụng enzyme khác thể kháng thuốc bị phân giải theo nhiều đường khác như: oxy hóa, thủy phân, hydro hóa, khử clo, ankyl hóa… trở thành chất không độc Cơ chế kháng thuốc muỗi Cơ chế tạo mức độ kháng mạnh mẽ muỗi loại hóa chất Sự kháng kết thay đổi mặt cấu trúc enzym làm tang khả giải độc tăng số lượng enzym dẫn đến tăng đào thải độc tố hóa chất diệt côn trùng khỏi thể chúng Các ví dụ chế kháng hóa sinh cấp độ phân tử A Đột biến axit amin vùng trải màng IIS6 gen kênh vận chuyển Na+ B Nhân tố điều hòa ( phía trình tự mã hóa ) C Đơn vị siêu chép A2-B2 Esterase b, Kháng tính thẩm thấu Là chế mà hóa chất diệt không bị phân hủy trực tiếp, song tính kháng hình thành giảm khả thấm Nhiều loại hóa chất diệt côn trùng thâm nhập vào thể côn trùng qua lớp biểu bì.Những thay đổi lớp biểu bì côn trùng làm giảm tốc độ thẩm thấu hóa chất diệt côn trùng gây nên kháng số hóa chất diệt Đơn tính thấm giảm gây kháng mức độ thấp c, Kháng biến đổi vị trí đích Sự kháng gây biến đổi vị trí đích tác động hóa chất diệt côn trùng Sự biến đổi quan sát thấy enzym quan cảm nhận thần kinh, điểm đích số lớp hóa chất diệt côn trùng Có hình thức kháng hóa chất diệt côn trùng cách thay đổi vị trí nhạy cảm Cơ chế tác động gây chết muỗi nhóm hóa chất d, Kháng thay đổi thụ thể GABA Cơ chế thay đổi nucleotit ba mã hóa gen tổng hợp nên thụ thể, qua làm giảm độ nhạy thụ cảm thể hiệu lực độc hóa chất diệt côn trùng Cấu trúc GABA e, kháng tập tính Đó thay đỏi côn trùng tập tính né tránh liều chết hóa chất Những thay đổi bao gồm giảm xu hướng bay vào vùng sử dụng hóa chất hay tránh xa khỏi bề mặt có hóa chất Tuy nhiên, kháng đề cập đến giống hậu thay đổi gây trực tiếp có mặt hóa chất diệt côn trùng f, Kháng đa tính Là tượng kháng có hai nhiều chế kháng cá thể côn trùng Cơ chế phát triển nhanh, tạo trình áp dụng liên tiếp lớp hóa chất sau lớp hóa chất chương trình II, Quá trình phát triển tính kháng 1, Nguyên nhân hình thành tính kháng - - Đột biến, di chuyền chọn lọc tự nhiên Có thể Bt không mang đầy đủ nguồn Bt protein điều kiện xuất loại côn trùng có tính kháng Cây BT hệ mang loại protein BT nên lượng độc tố không cao không hiệu tiêu diệt côn trùng Tạo điều kiên đột biến Khoảng cách khu vực trồng BT với bình thường không đảm bảo, côn trùng hay sâu bệnh có nơi cư trú… Giống không đảm bảo chất lượng Phương pháp canh tác không quy trình 3, Tốc độ phát triển tính kháng phụ thuộc vào yếu tố a, Cường độ yếu tố tác động chọn lọc Hay nói khác tùy thuộc vào liều lượng, số lần sử dụng thuốc tỷ lệ sâu chết.Nếu liều lượng cao, chọn lọc phát huy hết tác dụng hệ xử lý thuốc xuất tính kháng thuốc xẩy nhanh, sau vài hệ b, Loài thuốc sử dụng Các kết nghiên cứu cho thấy tính kháng côn trùng loài thuốc khác khác Fritzsche (1967) ghi nhận loài nhện đỏ Panonychus citri thể tính kháng với thiophosphoric ester sau đến hệ tiếp xúc với thuốc, với hợp chất diphenyl tính kháng thể sau đến 12 hệ tiếp xúc với thuốc c, Đặc điểm sinh vật học côn trùng Yếu tố nầy quan trọng, loài côn trùng có chu kỳ sinh trưởng ngắn, nhiều hệ năm, khả sinh sản cao khả thể tính kháng sớm, mật số cá thể kháng tích luỹ nhiều hơn, nhanh III, Sự kiện côn trùng mục tiêu chống Bt 1, Tính kháng sâu bướm bắp cải looper Trong trường hợp bình thường, độc tố Bt Cry1Ac tác động tới sâu bướm, protein Cry1 liên kết với loại enzyme gọi APN dọc theo thành ruột côn trùng, nơi mà chất độc phá hủy niêm mạc ruột gây chết nhiên, thông qua chế di truyền làm thay đổi thụ độc tố đường ruột côn trùng.Các thụ thể thuộc nhóm enzym tiêu hóa gọi aminopeptidase N (APN) Để bù đắp cho mát enzyme APN 1, hoạt động APN đẩy lên cao, cho phép côn trùng thực trình tiêu hóa bình thường, nơi Bt không liên kết với ruột“ (Nghiên cứu tài trợ Bộ Quốc Viện Thực phẩm Nông nghiệp Nông nghiệp Mỹ.)http://www.news.cornell.edu 2, Tính kháng quần thể sâu đục thân ngô Châu Á 12/2013 -Một quần thể sâu đục thân ngô Á Châu (Asian corn borer) có tính kháng lại cao Cry1Ab (hơn 100 lần) so với quần thể nhiễm biểu mức độ cao tính kháng chéo Cry1Ah (gấp 131 lần), không kháng chéo với Cry1le Điều cho thấy tính kháng chéo thay đổi thụ cảm độc tố Cry có ruột non côn trùng sâu đục thân •  Một nghiên cứu khác thuộc Viện Hàn lâm khoa học Nông nghiệp Trung Quốc cộng nhằm xác định proteins có khoang màng diêm bàn chải ruột non hai loài sâu đục thân nhiễm độc tố kháng độc tố, tương tác với Bt proteins biotin hóa (Cry1Ab, Cry1Ah, Cry1Ie) Trắc nghiệm xảy ấu trùng kháng nhiễm độc tố cry Kết cho thấy: “biotinylated Bt proteins” có phản ứng tương tác mạnh với protein ấu trùng kháng so với ấu trùng nhiễm Điều khẳng định có gia tăng đáng kể “V-type proton ATPase catalytic subunit A” protein chống sốc nhiệt HSP70 ấu trùng kháng Sự tương tác Cry1Ie với “V-type proton ATPase catalytic subunit A” ấu trùng nhiễm chứa tìm thấy Cấu trúc V-type proton ATPase catalytic subunit A IV, Một số chiến lược quản lý biện pháp hạn chế tính kháng thuốc sâu 1, Chiến lược quản lý   Phát triển nhiều hệ BT mang nhiều loại protein BT hơn, tính hiệu cao Các công ty phát triển hệ BT mang nhiều gen độc tố kháng sâu bệnh ( đặc biệt bông) Nguyên cứu trình kiểm soạt biểu hiên gen kháng sâu bệnh hại Đào tạo cho nông dân nắm phương pháp canh tác thích hợp nhằm ngăn chặn làm chậm lại lan tràn côn trùng có tính kháng  Các phương pháp cày sâu, luân canh, vệ sinh đồng ruộng chăn thả gia súc cánh đồng thu hoạch  Quản lý canh tác BT hợp lý, tăng cường biện pháp khảo sát tính kháng sâu bệnh 2, Một số biện pháp hạn chế tính kháng thuốc sâu  - Dùng thuốc hợp lý kỹ thuật để đảm bảo hiệu diệt sâu cao giảm bớt số lần dùng thuốc Khi dùng thuốc cần đảm bảo nồng độ liều lượng để diệt nhiều sâu nhất, giảm đến tối thiểu số sâu không chết trở nên quen thuốc sau hình thành hệ sâu kháng thuốc.Kết hợp dùng thuốc với biện pháp phòng trừ khác để góp phần giảm số lần lượng thuốc dùng - Áp dụng chiến lược luân phiên thay loại thuốc sử dụng lần dùng thuốc, không nên liên tục sử dụng nhiều lần loại thuốc Chủ yếu thay đổi loại thuốc có gốc hóa học khác cách tác động khác nhau.Có trường hợp sâu quen với loại thuốc mới, sử dụng trở lại loại thuốc cũ lại có hiệu cao - Chú ý sử dụng loại thuốc có khả gây tính kháng thuốc Phần lớn loại thuốc hóa học tác động trực tiếp đến hệ thần kinh dễ gây tính kháng thuốc thuốc sinh học Nhóm thuốc vi sinh gây tính kháng thuốc - Dùng thuốc hỗn hợp với dầu khoáng dầu thực vật vừa làm tăng hiệu diệt sâu vừa làm chậm tốc độ phát sinh tính kháng thuốc Hỗn hợp với dầu giảm phần lượng thuốc hóa học sử dụng để hạn chế ô nhiễm Tính kháng thuốc trở ngại lớn việc phòng trừ sâu hại, cần ý áp dụng biện pháp hạn chế tính kháng thuốc sâu, áp dụng chiến lược luân phiên thay đổi loại thuốc biện pháp dễ áp dụng có hiệu rõ V, Kết luận  Cây trồng BT ngày phổ biến rộng rãi mang lại lợi ích không nhỏ  Bên cạnh đó, tính kháng sâu bệnh côn trùng hại yếu tố tự nhiên mà có ảnh hưởng lớn tới thành công hiệu trồng BT  Chính thế, biện pháp quản lý tính kháng BT sâu bệnh phải triển khai chặt chẽ nghiêm ngặt Nghiên cứu cải tiến công nghệ BT Cần có biện pháp thích hợp để kìm hãm tính kháng PHẦN PHẦN BẢN POWERPOINT TÀI LIỆU THAM KHẢO http://www.vietmyiat.vn/insect_detail.asp?new=33 http://www.vietmyiat.vn/services_detail.asp?cat=2&pro=152 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1857359/#!po=9.61538 http://www.agbiotech.com.vn/vietnam http://web.utk.edu/ http://vi.wikipedia.org/ http://www.news.cornell.edu/stories/2011/08/researchers-identify-insect-resistance-btpesticide http://vi.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis#C.C3.A2y_tr.E1.BB.93ng_Bt  ... thực phân tích liệu kháng bệnh loại côn trùng châu lục rút vấn đề yếu tồn chiến lược nhằm dự đoán, kiểm soát loại côn trùng kháng loại trồng Bt B, NỘI DUNG I, Tính kháng công nghệ Bt Tính kháng. .. pháp hạn chế tính kháng thuốc sâu 1, Chiến lược quản lý   Phát triển nhiều hệ BT mang nhiều loại protein BT hơn, tính hiệu cao Các công ty phát triển hệ BT mang nhiều gen độc tố kháng sâu bệnh... trình II, Quá trình phát triển tính kháng 1, Nguyên nhân hình thành tính kháng - - Đột biến, di chuyền chọn lọc tự nhiên Có thể Bt không mang đầy đủ nguồn Bt protein điều kiện xuất loại côn trùng