BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN VĂN LẸ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DIAZINON TRONG CÁC MÔ HÌNH CANH TÁC LUÂN CANH LÚA-MÀU VÀ CHUYÊN MÀU Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 Cần Thơ, 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: TS Dương Minh Viễn Người hướng dẫn phụ: PGS.TS Trần Nhân Dũng Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Trường Đại học Cần Thơ Vào……giờ…… , ngày……tháng…… năm……… Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Văn Lẹ, Dương Minh Viễn, Đỗ Thị Xuân, 2015 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon đất chuyên màu số tỉnh đồng sông Cửu Long Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Số 12: 56-61 Nguyễn Văn Lẹ, Huỳnh Ngọc Vàng, Dương Minh Viễn, 2015 Phân lập định danh số chủng vi khuẩn có khả phân hủy thuốc trừ sâu gốc lân hữu Diazinon từ đất canh tác lúa- màu số tỉnh đồng sông Cửu Long Tạp chí Khoc học trường Đại học Quốc gia Hà Nội Số 4S (31): 185-193 Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Diazinon hợp chất thuộc họ phosphorothioates nông dân sử dụng nhiều (Lê Thị Trinh, 2012) Nhiều nghiên cứu cho thấy hàm lượng Diazinon cao mẫu nước đạt 7,1 ppb (Carey and Kutz, 1985) mẫu trầm tích đạt 0,5-5,4 ppb (Sapozhnikova et al., 2004) Diazinon gây độc cho sinh vật qua chế làm giảm hoạt tính enzyme Acetylcholinesterase (AChE) (Aprea et al., 2002) Đối với người, Diazinon gây nhiễm độc cấp tính đau đầu, tim đập bất thường, động kinh, co giật, gây tử vong (Reigart and Roberts, 1999) gây ung thư não trẻ tiếp xúc thường xuyên với Diazinon (Lê Thị Trinh, 2012) Vấn đề ô nhiễm môi trường đất, nước sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) chứa hoạt chất Diazinon vấn đề cần quan tâm Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nhằm thúc đẩy trình phân hủy hoạt chất thuốc trừ sâu Diazinon gắn liền với điều kiện canh tác đồng sông Cửu Long (ĐBSCL), đặc biệt phân hủy sinh học hoạt động vi sinh vật đất Bên cạnh đó, phân hủy vi sinh vật đường chủ yếu phân hủy Diazinon đất (Aggarwal et al., 2013) Việc ứng dụng vi sinh vật để phân hủy thuốc BVTV biện pháp hiệu tốn (Abo-Amer and Aly, 2010) Từ vấn đề nêu trên, việc phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân hủy thuốc Diazinon mô hình canh tác luân canh lúa-màu chuyên màu tỉnh Đồng sông Cửu Long cần thiết thực nhằm góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường đất sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Diazinon 1.2 Mục tiêu đề tài: Đánh giá tình hình sử dụng dư lượng thuốc trừ sâu Diazinon mô hình canh tác chuyên lúa, luân canh lúa-màu chuyên màu Đánh giá ảnh hưởng mô hình canh tác đến vi khuẩn phân hủy Diazinon 1.3 Ý nghĩa luận án Kết nghiên cứu đề tài làm nguồn tư liệu quí báu cho nghiên cứu chuyên sâu tương lai Các dòng vi khuẩn có khả phân hủy hoạt chất thuốc trừ sâu Diazinon hiệu ứng dụng giảng dạy lĩnh vực xử lý ô nhiễm môi trường 1.4 Những điểm luận án Kết phân lập 196 dòng vi khuẩn có khả phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon có nguồn gốc từ đất canh tác luân canh lúa-màu chuyên màu tỉnh ĐBSCL Ứng dụng phương pháp theo dõi hàm lượng thuốc trừ sâu Diazinon lại môi trường khoáng tối thiểu sau chủng vi khuẩn 30 ngày, kết xác định dòng vi khuẩn phân hủy Diazinon hiệu cao Xác định số nhân tố môi trường (nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nồng độ Diazinon) thúc đẩy cho gia tăng mật số phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn môi trường khoáng tối thiểu Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian thí nghiệm Các nội dung luận án thực từ tháng 6/2012 đến tháng 1/2016 3.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Khảo sát tình hình sử dụng thuốc trừ sâu có chứa hoạt chất Diazinon mô hình canh tác trồng ĐBSCL Tiến hành khảo sát Bình Tân-Vĩnh Long, Chợ Mới-An Giang, Cai Lậy-Tiền Giang đất canh tác chuyên lúa, luân canh lúa-màu chuyên màu Việc khảo sát dựa thông tin loại thuốc sử dụng, liều lượng sử dụng/năm, liều lượng/1000 m2, diện tích phun thuốc… Số nông hộ chọn điều tra từ 45-50 nông hộ địa điểm 3.2.2 Khảo sát ô nhiễm thuốc trừ sâu Diazinon Khảo sát lưu tồn thuốc Diazinon ảnh hưởng mô hình canh tác lên lưu tồn thuốc Diazinon 3.2.2.1 Khảo sát ô nhiễm thuốc Diazinon đồng ruộng mô hình canh tác luân canh lúa-màu chuyên màu Thu mẫu vào thời điểm sau thu hoạch nông sản Bình Tân Vĩnh Long, Phụng Hiệp - Hậu Giang, Cai Lậy - Tiền Giang tương ứng với mô hình canh tác Mẫu đất thu độ sâu 0-20 cm, ruộng lấy ngẫu nhiên 12 điểm, trộn thành mẫu Các mẫu đất mang phòng thí nghiệm, ly trích Diazinon từ mẫu đất tươi lọc làm qua cột Alumina, sau phân tích hàm lượng Diazinon hệ thống sắc ký khí khối phổ (GC/MS) 3.2.2.2 Khảo sát lưu tồn thuốc Diazinon đồng ruộng mô hình canh tác luân canh lúa-màu chuyên màu Thí nghiệm tiến hành Hòa An - Hậu Giang đất phèn nhẹ với ruộng chuyên canh mía, Bình Tân - Vĩnh Long khảo sát lưu tồn Diazinon đất phù sa với ruộng ứng với mô hình canh tác chuyên xà lách xoong luân canh lúa- khoai lang Diện tích thí nghiệm với ruộng 40 m2 Thuốc trừ sâu sử dụng thí nghiệm DIAZAN 60EC chứa 60% Diazinon Lượng thuốc sử dụng theo liều lượng khuyến cáo ghi bao bì (60 g/1000m2) Thu mẫu đất vào thời điểm trước phun thuốc, sau phun thuốc ngày, 21 ngày 42 ngày Phương pháp thu mẫu đất, ly trích Diazinon xác định hàm lượng Diazinon thời điểm lấy mẫu giống phần đánh giá ô nhiễm Diazinon mục 3.2.2.1 3.2.2.3 Ảnh hưởng mô hình canh tác luân canh lúa-màu (2 lúa-1 màu, lúa- màu) đến lưu tồn thuốc Diazinon đồng ruộng Địa điểm thí nghiệm bố trí đất phù sa xã Long Khánhhuyện Cai Lậy-tỉnh Tiền Giang Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với nghiệm thức (Nghiệm thức 1: Lúa–Bắp–Lúa, nghiệm thức 2: Lúa–Đậu xanh–Bắp) lặp lại lần, diện tích nghiệm thức 100 m2 Sử dụng thuốc trừ sâu chứa hoạt chất Diazinon giống mục 3.2.2.2 Thời điểm thu mẫu đất vào Vụ Đông Xuân: trước phun thuốc, sau phun thuốc ngày, 14 ngày 46 ngày Vụ Hè Thu: sau phun thuốc ngày, 13 ngày 26 ngày Thu mẫu đất, ly trích Diazinon xác định hàm lượng Diazinon tương ứng với thời điểm lấy mẫu giống mục 3.2.2.1 3.2.2.4 Ảnh hưởng mô hình canh tác chuyên màu luân canh lúa-màu đến lưu tồn thuốc Diazinon điều kiện nhà lưới Thí nghiệm thực chậu nhà lưới thuộc Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Thí nghiệm bố trí với nghiệm thức (Nghiệm thức 1: Lúa– Đậu xanh–Lúa, nghiệm thức 2: Đậu xanh–Đậu xanh–Đậu xanh), lần lặp lại Bổ sung Diazinon vào đất: Diazinon trộn vào 300 g đất thu từ chậu để đạt nồng độ 1,5 ppm Sau đó, đất cho vào túi lưới Hình 3.1 Các túi lưới chứa đất cho vào chậu với độ sâu cm (mỗi chậu đất chứa túi lưới chứa đất) Hình 3.1 Các túi lưới chứa đất trộn Diazinon Mẫu đất thu vào thời điểm ngày, 10 ngày, 20 ngày 30 ngày sau vùi túi lưới vào chậu đất Phương pháp bảo quản mẫu đất, ly trích Diazinon xác định hàm lượng Diazinon thời điểm lấy mẫu giống phần đánh giá ô nhiễm Diazinon mục 3.2.2.1 3.2.3 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn hiếu khí có khả phân hủy hiếu khí Diazinon từ mô hình canh tác lúa màu chuyên màu 3.2.3.1 Phân lập vi khuẩn hiếu khí có khả phân hủy Diazinon từ mô hình canh tác luân canh lúa- màu chuyên màu Địa điểm thu mẫu đất gồm Bình Tân –Vĩnh Long, Bình Minh-Vĩnh Long, Hòa An-Hậu Giang, Chợ Mới-An Giang, Cai Lậy-Tiền Giang với tổng số lượng mẫu đất 41 mẫu Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc Diazinon gồm giai đoạn: làm giàu mật số tách ròng vi khuẩn (i) Làm giàu mật số vi khuẩn hiếu khí phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon Sử dụng môi trường khoáng tối thiểu (MSM), bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm để làm giàu cộng đồng vi khuẩn phân hủy Diazinon Số lần cấy chuyển trình làm giàu mật số vi khuẩn lặp lại lần cho cộng đồng vi khuẩn Sau đó, cộng đồng vi khuẩn bố trí thí nghiệm nhằm khảo sát khả phân hủy thuốc Diazinon với hai nghiệm thức bên dưới: - Nghiệm thức 1: Đối chứng (MSM, bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm) - Nghiệm thức 2: MSM, bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm chủng cộng đồng vi khuẩn Sau 14 ngày nuôi ủ cộng đồng vi khuẩn, hàm lượng thuốc Diazinon lại môi trường nuôi ly trích dung môi Toluen:Acetone (2:1) phân tích hàm lượng Diazinon hệ thống HPLC (Shimazu-LC20A) (ii) Tách ròng Tách ròng vi khuẩn môi trường TSA từ cộng đồng vi khuẩn có khả phân hủy Diazinon Sau chủng vi khuẩn thuần, sau chuyển nuôi MSM có bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm theo dõi phát triển dòng vi khuẩn 3.2.3.2 Đánh giá khả phân hủy Diazinon chủng vi khuẩn phân lập mô hình canh tác luân canh lúa-màu chuyên màu Các dòng vi khuẩn nhân mật số MSM có bổ sung TSB 0,5% ngày Sau thu sinh khối hiệu chỉnh độ đục OD600 nm = 0,7 Mật số vi khuẩn sau hiệu chỉnh độ đục xác định phương pháp điếm sống nhỏ giọt (Hoben and Somasegaran, 1982) với mật số dòng vi khuẩn dao động từ 0,12x106 CFU/mL đến 5,67x106 CFU/mL Mỗi dòng vi khuẩn phân lập thể khả phát triển môi trường khoáng tối thiểu bố trí thí nghiệm với nghiệm thức, lần lặp lại - Nghiệm thức 1: 5000 µL MSM, bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm - Nghiệm thức 2: 4900 µL MSM, bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm chủng 100 µL dịch vi khuẩn Sau 30 ngày nuôi ủ máy lắc, ly trích hàm lượng thuốc Diazinon lại môi trường nuôi phân tích hàm lượng Diazinon giống mục 3.2.3.1 Sau xác định dòng vi khuẩn phân hủy hiệu Diazinon, tiến hành nhận diện Gram, xác định hình thái tế bào, tính di động, phản ứng oxidase, phản ứng catalase, xác định tiêu sinh hóa kít API 20E (vi khuẩn gram âm) kít API Strep (vi khuẩn gram dương) giải trình tự DNA 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố môi trường lên tăng trưởng dòng vi khuẩn phân hủy Diazinon hiệu 3.2.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn Mỗi dòng vi khuẩn bố trí với nghiệm thức, lần lặp lại (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Thành phần môi trường thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn Nghiệm thức Thành phần môi trường (pH = 7)* Nhiệt độ (oC) 4900 µL MSM, Diazinon 20 ppm, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 25 4900 µL MSM, Diazinon 20 ppm, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 30 4900 µL MSM, Diazinon 20 ppm, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 37 Phương pháp nhân mật số vi khuẩn xác định mật số vi khuẩn giống mục 3.2.3.2 Mật số vi khuẩn ứng với OD600 nm = 0,7 dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17, CL36_M4 BT4_L1 tương ứng 4,67x106; 3,90x106; 3,00x106; 5,90x106; 3,5x106; 4,3 x106 CFU/mL Mật số vi khuẩn xác định phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben and Somasegaran, 1982) vào thời điểm ban đầu sau ngày nuôi cấy 3.2.4.2 Ảnh hưởng pH đến mật số vi khuẩn Mỗi dòng vi khuẩn bố trí ống nghiệm với nghiệm thức, lần lặp lại (Bảng 3.7) Bảng 3.7 Thành phần môi trường thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến sinh trưởng vi khuẩn Nghiệm thức Thành phần môi trường (nhiệt độ thí nghiệm: 30 oC) pH 4900 MSM, Diazinon 20 ppm, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 4900 µL MSM, Diazinon 20 ppm, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 4900 µL MSM, Diazinon 20 ppm, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 4900 µL MSM, Diazinon 20 ppm, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 Phương pháp hiệu chỉnh độ đục dịch vi khuẩn với OD600 nm = 0,7 giống mục 3.2.3.2 Mật số vi khuẩn ứng với OD600 nm = 0,7 dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17, CL36_M4 BT4_L1 tương ứng 5,00x106; 4,00x106; 2,00x106; 5,33x106; 3,00x106; 2,33x106 CFU/mL Mật số vi khuẩn xác định giống mục 3.2.4.1 3.2.4.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến mật số vi khuẩn Mỗi dòng vi khuẩn bố trí ống nghiệm với nghiệm thức, lần lặp lại (Bảng 3.9) Bảng 3.9 Thành phần môi trường thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng vi khuẩn Nghiệm thức Thành phần môi trường (pH = 7, nhiệt độ: 30 oC) Nguồn cacbon 4900 µL MSM, chủng 100 µL dịch nuôi vi khuẩn 0,5% glucose 4900 µL MSM, chủng 100 µL dịch nuôi vi khuẩn 0,5% TSB Phương pháp hiệu chỉnh độ đục dịch vi khuẩn với OD600 nm = 0,7 giống mục 3.2.3.2 Mật số vi khuẩn ứng với OD600 nm = 0,7 dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17, CL36_M4 BT4_L1 tương ứng 5,20x106; 3,67x106; 3,00x106; 5,40x106; 2,33x106; 3,07x106 CFU/mL Mật số vi khuẩn xác định giống mục 3.2.4.1 3.2.4.4 Ảnh hưởng nồng độ Diazinon đến mật số vi khuẩn Mỗi dòng vi khuẩn bố trí ống nghiệm với nghiệm thức, lần lặp lại (Bảng 3.11) Bảng 3.11 Thành phần môi trường thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ Diazinon đến sinh trưởng vi khuẩn Nghiệm thức Thành phần môi trường (pH = 7, nhiệt độ: 30 oC) Nồng độ Diazinon (ppm) 4900 µL MSM, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 20 4900 µL MSM, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 50 4900 µL MSM, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 100 4900 µL MSM, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 150 4900 µL MSM, chủng 100 µL dịch vi khuẩn OD600 nm = 0,7 200 Phương pháp hiệu chỉnh độ đục dịch vi khuẩn với OD600 nm = 0,7 giống mục 3.2.3.2 Mật số vi khuẩn ứng với OD600 nm = 0,7 dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17, CL36_M4 BT4_L1 tương ứng 4,50x106; 4,00x106, 2,00x106, 5,67x106, 3,47x106, 4,30x106 CFU/mL Mật số vi khuẩn xác định phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben and Somasegaran, 1982) vào thời điểm ban đầu sau ngày nuôi cấy 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng số nhân tố sinh thái đến tốc độ phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn phân hủy Diazinon hiệu 3.2.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn Mỗi dòng vi khuẩn bố trí ống nghiệm với nghiệm thức, lần lặp lại (Bảng 3.13) 12 Bảng 3.20 Thành phần môi trường thí nghiệm khảo sát khả phân hủy Diazinon đất dòng vi khuẩn HA7.1 Nghiệm thức Thành phần môi trường (nhiệt độ: 30 oC, Diazinon: 20 ppm) g đất tiệt trùng không chủng vi khuẩn g đất tiệt trùng chủng 100 L dịch vi khuẩn HA7.1 3 g đất không tiệt trùng không chủng vi khuẩn g đất không tiệt trùng chủng 100 L dịch vi khuẩn HA7.1 g đất không tiệt trùng chủng tổ hợp vi khuẩn BT4_L1, CL36_M4, HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17 3.2.7 Định danh chủng vi khuẩn phân hủy Diazinon phân lập từ đất thu từ ruộng canh tác luân canh lúa-mùa chuyên màu DNA tách chiết theo phương pháp CTAB 3% Sau đó, sản phẩm DNA khuếch đại phản ứng PCR với cặp mồi 27F/1492R có trình tự sau: 27F (5’-3’): AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R (5’- 3’): TACGGTTACCTTGTTACGACTT (Justé et al., 2008b) Kết sau giải trình tự so sánh dò tìm ngân hàng gene NCBI để xác định mức độ tương đồng dòng vi khuẩn khảo sát với trình tự lưu trữ NCBI 3.2.8 Phương pháp phân tích xử lý số liệu Số liệu xử lý công cụ microsoft excel để xử lý số liệu vẽ đồ thị Phần mềm thống kê Minitab 16.0 sử dụng để phân tích phương sai trung bình Sử dụng phần mềm MEGA6.06 (Tamura et al., 2013) để xây dựng phả hệ di truyền dòng vi khuẩn phân hủy Diazinon Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu Diazinon số tỉnh Đồng sông Cửu Long Kết điều tra cho thấy, Diazinon nông dân sử dụng mô hình canh tác chuyên màu luân canh lúa-màu nhiều mô hình canh tác lúa (Hình 4.1a) Phần trăm s ố hộ sử dụng Diazinon 7000 Lượng khuyến cáo 6000 Lượng sử dụng 5000 (a) 4000 3000 2000 1000 Bình Tân Cai Lậy Chợ Mới Bình Tân Cai Lậy Chợ Mới Bình Tân Cai Lậy Chợ Mới Chuyên lúa Lúa màu Phần trăm số hộ v phầ n trăm diện tích sử dụng Diazinon Lượng hoạt chất Diazinon (g/1000m2/năm) 13 Phần trăm diệ n tích sử dụng Diazinon 70 60 (b) 50 40 30 20 10 Bình Tân Cai Lậy Chợ Mới Bình Tân Cai Lậy Chợ Mới Bình Tân Cai Lậy Chợ Mới Chuyên lúa Chuyên màu Lúa-màu Chuyên màu Hình 4.1 (a) Phần trăm nông hộ diện tích sử dụng Diazinon, (b) liều lượng sử dụng Diazinon Hàm lượng Diazinon (ppb) Bên cạnh liều lượng Diazinon nông dân sử dụng địa điểm khảo sát cao trung bình khoảng từ 2-4 lần so với liều khuyến cáo (Hình 4.1b) 4.2 Ô nhiễm hoạt chất thuốc trừ sâu Diazinon đồng ruộng Đồng sông Cửu Long Dư lượng hoạt chất thuốc trừ sâu Diazinon mẫu đất địa điểm khảo sát thể qua Hình 4.2 Trong đó, hàm lượng Diazinon đất cao Cai Lậy mô hình chuyên canh màu 23,2 ppb Hình 4.2 Ô nhiễm Diazinon số địa điểm ĐBSCL Ghi chú: địa điểm Hòa An xã thuộc huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang 600 a 500 (b) 400 300 b 200 100 c NSP 21 NSP 42 NSP Hàm lượng Diazinon (ppb) (a) Hàm lượng Diazinon (ppb) 4.3 Lưu tồn thuốc trừ sâu Diazinon 4.3.1 Lưu tồn thuốc trừ sâu Diazinon đồng ruộng Hòa An– Hậu Giang Bình Tân-Vĩnh Long Hàm lượng Diazinon có khả ly trích từ đất hệ thống canh tác thể qua Hình 4.3 Trong đó, hàm lượng Diazinon ly trích dao động từ 0%-1,5% sau 42 ngày phun thuốc trừ sâu Diazinon với tốc độ suy giảm từ 2,35%/ngày đến 2,38%/ngày 500 400 (c) a 300 200 b 100 b NSP 21 NSP 42 NSP Hình 4.3 (a) Lưu tồn Diazinon mô hình chuyên canh mía Hòa An-Hậu Giang (2013), (b) mô hình luân canh lúa-khoai lang (vụ khoai lang) Bình Tân-Vĩnh Long, (c) mô hình chuyên màu (xà lách xoong) Bình Tân-Vĩnh Long Ghi chú: NSP: Ngày sau phun 14 (a) Hàm lượng Diazinon (ppb) Hàm lượng Diazinon (ppb) 4.3.2 Ảnh hưởng mô hình canh tác luân canh lúa-màu (2 lúa-1 màu, lúa- màu) đến lưu tồn thuốc Diazinon Long Khánh-Cai Lậy-Tiền Giang Vụ Đông Xuân kết thí nghiệm cho thấy, sau 46 ngày phun thuốc hàm lượng Diazinon ly trích giảm khoảng 50% mô hình canh tác, với tốc độ phân hủy trung bình 1,08%/ngày (Hình 4.4a) (b) Hình 4.4 (a) Lưu tồn Diazinon mô hình canh tác lúa-2 màu lúa-1 màu (vụ Đông Xuân, 2013); (b) mô hình luân canh lúa – màu (đậu xanh) (vụ Hè Thu, 2013) Vụ Hè Thu, sau 26 ngày phun thuốc trừ sâu Diazinon, hàm lượng Diazinon giảm 92% với tốc độ phân hủy trung bình 3,54%/ngày (Hình 4.4b) 4.3.3 Ảnh hưởng mô hình canh tác chuyên màu luân canh lúa-màu đến lưu tồn thuốc Diazinon điều kiện nhà lưới Qua kết khảo sát lưu tồn Diazinon, hàm lượng Diazinon sau 30 ngày phun thuốc mô hình luân canh lúa–1 màu (trồng đậu xanh), lúa – màu (vụ lúa) chuyên canh màu (đậu xanh) giảm tương ứng 89% (tốc độ phân hủy 2,97%/ngày), 76% (tốc độ phân hủy 2,53%/ngày) 87% (tốc độ phân hủy 2,90%/ngày) (Hình 4.5) (a) (b) (c) Hình 4.5 (a) Lưu tồn Diazinon mô hình luân canh lúa – màu (đậu xanh), (b) mô hình luân canh lúa – màu (vụ lúa), (c) mô hình chuyên canh màu (đậu xanh) điều kiện nhà lưới Ghi chú: NSP: Ngày sau phun 4.4 Làm giàu mật số cộng đồng vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon Từ 21 mẫu đất thu từ mô hình chuyên màu 20 mẫu đất thu từ mô hình luân canh lúa-màu làm giàu mật số 41 cộng đồng vi khuẩn có khả 15 phân hủy Diazinon Sự phát triển cộng đồng vi khuẩn sau 3-5 ngày nuôi cấy môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung Diazinon 20 ppm thể qua Hình 4.6 Hình 4.6 Sự phát triển cộng đồngvi khuẩn môi trường khoáng tối thiểu Ghi chú: ĐC (Đối chứng): Môi trường khoáng tối thiểu bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm b a a a a a BM4 b BM3 a BM2 a CL8 b BM1 a b CL7 b b b CL6 a b CL5 a CM4 a 80 CM3 a 100 CM2 120 b b 60 40 Bình Tân-VL CM1 HA9 HA10 HA8 HA7 TA4 HA6 TA3 TA2 TA1 20 Đối chúng Hàm lượng Diazinon lại (%) 4.5 Đánh giá khả phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon cộng đồng vi khuẩn Trên mô hình chuyên màu, kết thí nghiệm có 10 cộng đồng vi khuẩn phân hủy Diazinon hiệu quả, giảm từ 14,3 đến 37,9% sau 14 ngày nuôi cấy (Hình 4.7) Chợ Mới-AG Hòa An-HG Cai Lậy-TG Bình Minh-VL Hình 4.7 Sự phân hủy Diazinon cộng đồng vi khuẩn làm giàu mật số từ đất chuyên màu sau 14 ngày nuôi cấy môi trường khoáng tối thiểu Ghi chú: Đối chứng: Môi trường khoáng tối thiểu bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm a a b 80 b a b b a b b a b b b a b a CM44_M a 100 CM44_L 120 b b 60 40 20 Bình Tân (Vĩnh Long) Cai Lậy (T iền Giang) CM43_M CM42_L CM42_M CM41_L CM41_M CL49_M CL5_M CL36_M CL4_M CL4_L BT53_M BT4_L BT52_M BT52_L BT51_M BT2_L BT50_M b BT50_L Đối chứng Hàmlượng Diazinon lại (%) Trên mô hình canh tác luân canh lúa-màu, kết thí nghiệm có 13 cộng đồng vi khuẩn (4 cộng đồng vụ lúa, cộng đồng vụ màu) phân hủy Diazinon hiệu quả, giảm từ 15,3% đến 97,8% sau 14 ngày nuôi cấy (Hình 4.8) Chợ M ới (An Giang) Hình 4.8 Sự phân hủy Diazinon cộng đồng vi khuẩn làm giàu mật số từ đất canh tác luân canh lúa-màu sau 14 ngày nuôi cấy môi trường khoáng tối thiểu Ghi chú: Đối chứng: Môi trường khoáng tối thiểu bổ sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm 4.6 Phân lập vi khuẩn có khả phân hủy Diazinon Trên mô hình canh tác chuyên màu, sáu cộng đồng có ký hiệu CM1, CL7, HA7, HA10, TA3 TA4 chọn để phân lập vi khuẩn Kết phân lập 87 dòng vi khuẩn Trong đó, có 15 dòng vi khuẩn thể 16 khả phát triển môi trường khoáng tối thiểu bổ sung Diazinon 20 ppm Trên mô hình canh tác luân canh lúa-màu, kết phân lập 90 dòng vi khuẩn từ cộng đồng vi khuẩn vào vụ màu, 19 dòng vi khuẩn từ cộng đồng vi khuẩn vào vụ lúa Trong đó, có 27 dòng vi HA7.4 HA7.1 HA7.1 triển ĐC môi trường khoáng tối thiểu bổ khuẩn phát sung Diazinon 20 ppm (Hình 4.9a) HA7.1 TA4.17 ĐC BT4_L1 ĐC HA7.1 ĐC TA4.17 (a) HA7.4 TA3.2 (b) Hình 4.9 (a) Sự phát triển số dòng vi khuẩn MSM có bổ sung Diazinon 20 ppm, (b) hình dạng khuẩn lạc số dòng vi khuẩn Chú thích:Mẫu dòng: Môi trường MM + Vi khuẩn + Diazinon 20 ppm Đối chứng (ĐC): Môi trường MM + Diazinon 20 ppm a b a TA3.4 a TA3.2 b HA7.5 a 100 HA7.4 120 a a a a a a a a b b 80 60 40 20 Hòa An-HG Bình Tân-VL CM1.9 CM1.17 CM1.5 CM1.3 TA.4.17 TA.4.2 TA.4.11 TA.4.1 TA3.7 TA3.12 HA7.1 Đối chứng Phần trăm Diazinon lại (%)… Hình dạng khuẩn lạc dòng vi khuẩn đa số có dạng tròn, bờ nguyên, lài lài có mấu màu trắng đục (Hình 4.9b) 4.7 Đánh giá khả phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon dòng vi khuẩn môi trường khoáng tối thiểu Trên mô hình canh tác chuyên màu, dòng vi khuẩn có ký hiệu HA7.1, HA7.4, TA3.2 TA4.17 thể khả phân hủy Diazinon hiệu hàm lượng Diazinon giảm so với đối chứng 27,9%, 15,4%, 15,7% 24,2% sau 30 ngày nuôi ủ (Hình 4.10) Chợ Mới-AG Hình 4.10 Khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn lập từ đất chuyên canh màu, sau 30 ngày nuôi ủ môi trường khoáng tối thiểu Trên mô hình canh tác luân canh lúa-màu, nghiệm thức có bổ sung chủng vi khuẩn BT4_L1 CL36_M4 hàm lượng Diazinon giảm so với đối chứng 29,3% 20,9% (Hình 4.11) Điều chứng tỏ dòng vi khuẩn có khả phân hủy Diazinon sử dụng sản phẩm phân hủy Diazinon nguồn cacbon (Yaghoob et al., 2010) a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a CM44_L11 a CM43_M6 a CM44_L10 a b b 80 CM42_L1 a 100 CM43_M25 120 60 40 CM43_M7 CM42_L8 CL36_M4 Cai Lậy-TG Bình Tân-VL CM41_M1 CL36_M9 CL5_M6 CL36_M1 CL4_M4 CL4_M6 BT4_L20 BT4_L5 BT4_L17 BT4_L1 BT53_M4 BT52_M7 BT52_M4 BT52_M3 BT52_M2 BT52_M1 BT51_M7 BT50_L14 Đối chứng 20 BT50_M1 Phần trămDiazinon lại (% ) 17 Chợ Mới-AG Hình 4.11 Khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác luân canh lúa-màu, sau 30 ngày nuôi môi trường khoáng tối thiểu MSBĐ 10 HA7.1 HA7.4 TA3.2 25oC 30oC 37oC TA4.17 Dòng vi khuẩn Hình 4.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến gia tăng mật số dòng vi khuẩn (HA7.1, HA7.4, TA3.3, TA4.17) sau ngày nuôi ủ Lo ga rit mậ t độ tế bào vi khuẩ n (CFU /m l) Logarit mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/ml) 4.8 Ảnh hưởng nhân tố sinh thái đến gia tăng mật số khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác chuyên màu 4.8.1 Ảnh hưởng nhân tố sinh thái đến gia tăng mật số dòng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác chuyên màu Kết thí nghiệm cho thấy có dòng vi khuẩn (HA7.1, TA3.2, TA4.17) mật số tăng cao 30oC dòng vi khuẩn (HA7.4) gia tăng mật số cao 37oC (Hình 4.12) Từ kết cho thấy nhiệt độ có vai trò quan trọng gia tăng mật số vi khuẩn MSBĐ 10 HA7.1 HA7.4 pH = pH = TA3.2 Dòng vi khuẩn pH = pH = TA4.17 Hình 4.13 Ảnh hưởng pH đến gia tăng mật số dòng vi khuẩn (HA7.1, HA7.4, TA3.3, TA4.17) sau ngày nuôi ủ Ghi chú: MSBĐ: Mật số ban đầu Thí nghiệm với giá trị pH khác nhau, cho thấy đa số dòng vi khuẩn có mật số vi khuẩn cao pH Trong đó, có dòng vi khuẩn mật số tăng cao pH (HA7.4, TA3.2, TA4.17) dòng vi khuẩn gia tăng mật số cao pH (HA7.1) (Hình 4.13) Bốn dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2 TA4.17, mật số tăng cao với nguồn cacbon TSB (Hình 4.14) nồng độ Diazinon khoảng giới hạn tan (20 ppm - 50ppm) môi trường khoáng tối thiểu (Hình 4.15) 12 MSBĐ Glucose TSB 10 HA7.1 HA7.4 TA3.2 Lo garit mậ t số tế bào vi khuẩn (CFU /mL) Logarit mật số tế bào v i khuẩn (CFU/mL) 18 MSBĐ 12 20 ppm 50ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm 10 HA7.1 TA4.17 HA7.4 TA3.2 TA4.17 Dòng vi khuẩn Dòng vi khuẩn Hình 4.14 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến gia tăng mật số dòng vi khuẩn (HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17) sau ngày nuôi ủ Hình 4.15 Ảnh hưởng nồng độ Diazinon đến gia tăng mật số dòng vi khuẩn (HA7.1, HA7.4, TA3.3, TA4.17) sau ngày nuôi ủ Ghi chú: MSBĐ: Mật số ban đầu Hình 4.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn (HA7.1, HA7.4, TA3.3, TA4.17) sau 30 ngày nuôi ủ P hần trăm Diazin on cò n lại (% ) 4.8.2 Ảnh hưởng nhân tố sinh thái đến khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác chuyên màu Ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ phân hủy Diazinon thể hiên qua Hình 4.16 Ở 25oC, có dòng vi khuẩn HA7.1 có khả phân hủy Diazinon hiệu (giảm 18,3% tốc độ phân hủy 0,62%/ngày) Ở 30oC, bốn dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2 TA4.17 phân hủy Diazinon hiệu quả, thể qua tốc độ phân hủy Diazinon cao (Bảng 4.1) Chỉ có dòng vi khuẩn HA7.4 có khả phân hủy Diazinon hiệu 37oC (giảm 15,9% tốc độ phân hủy 0,53%/ngày) 120 ĐC a 100 b ab ab HA7.1 a ab HA7.4 b b b TA3.2 a a TA4.17 b ab ab b 80 60 40 20 25oC 30oC 37oC Bảng 4.1 Khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2 TA4.17 30oC môi trường khoáng tối thiểu sau 30 ngày nuôi cấy Dòng vi khuẩn HA7.1 HA7.4 TA3.2 TA4.17 Phần trăm phân hủy (%) 27,7 16,5 19,4 28,2 Tốc độ phân hủy (%/ngày) 0,92 0,55 0,65 0,94 Thí nghiệm khảo sát độ pH môi trường khoáng tối thiểu, cho thấy dòng vi khuẩn có khả phân hủy Diazinon hiệu giá trị pH khác (Hình 4.17) Đối với dòng vi khuẩn HA7.1, phân hủy Diazinon hiệu độ pH môi trường pH pH pH 7, hàm lượng Diazinon giảm tương ứng 17,6% (tốc độ phân hủy 0,59%/ngày), 28,1% (tốc độ phân hủy 0,94%/ngày) 21,3% (tốc độ phân hủy 0,71%/ngày) khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng Các dòng vi khuẩn HA7.4, TA3.2 19 Phần trăm Diazinon lại (%) TA4.17, phân hủy Diazinon hiệu độ pH 7, hàm lượng Diazinon giảm tương ứng 16,1% (tốc độ phân hủy 0,54%/ngày), 14,9% (tốc độ phân hủy 0,50%/ngày) 24,8% (tốc độ phân hủy 0,83%/ngày) Hình 4.17 Ảnh hưởng pH đến khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn (HA7.1, HA7.4, TA3.3, TA4.17) sau 30 ngày nuôi ủ ĐC 120 a 100 a a a HA7.1 a a ab ab HA7.4 TA3.2 TA4.17 a a ab ab ab ab b 80 b b b b pH = pH = b 60 40 20 Ghi chú: ĐC: Đối chứng pH = pH = Kết thí nghiệm cho thấy, dòng vi khuẩn có khả phân hủy Diazinon hiệu quả, môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung Diazinon đạt nồng độ từ 20 ppm đến 50 ppm (Hình 4.18) Phần trăm phân hủy tốc độ phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2 TA4.17 giảm dần tăng nồng độ Diazinon môi trường nuôi cấy, kết trình bày qua Bảng 4.2 Bảng 4.2 Phần trăm phân hủy tốc độ phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn (HA7.1, HA7.4, TA3.3, TA4.17) sau 30 ngày nuôi ủ Dòng vi Chỉ tiêu khảo sát Nồng độ Diazinon (ppm) khuẩn 20 50 100 150 200 Phần trăm phân hủy (%) 27,9 20,6 17,4 3,00 5,00 HA7.1 Tốc độ phân hủy (%/ngày) 0,93 0,69 0,58 0,10 0,17 Phần trăm phân hủy (%) 16,7 12,1 9,92 4,36 2,81 HA7.4 Tốc độ phân hủy (%/ngày) 0,56 0,41 0,33 0,15 0,09 Phần trăm phân hủy (%) 18,9 11,1 8,70 3,92 4,49 TA3.2 Tốc độ phân hủy (%/ngày) 0,63 0,37 0,29 0,13 0,15 Phần trăm phân hủy (%) 25,9 16,8 3,82 2,09 3,88 TA4.17 Tốc độ phân hủy (%/ngày) 0,86 0,56 0,13 0,07 0,13 ĐC Phần trăm Diazinon lại (% ) 120 Hình 4.18 Ảnh hưởng nồng độ Diazinon đến khả phân hủy Diazinon chủng vi khuẩn (HA7.1, HA7.4, TA3.3, TA4.17) sau 30 ngày nuôi ủ a 80 HA7.1 a 100 b b b b HA7.4 a b b b b b bc TA3.2 ab a a a a a TA4.17 a a a a a c 60 40 20 20 ppm 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm Ghi chú: ĐC: Đối chứng Ảnh hưởng mật số vi khuẩn đến khả phân hủy Diazinon thể qua Bảng 4.3 Kết nghiên cứu tương tự với nghiên cứu Abo-Amer and Aly (2011), mật số vi khuẩn tỷ lệ thuận với tốc độ phân hủy Diazinon môi trường khoáng tối thiểu 20 Bảng 4.3 Ảnh hưởng mật số vi khuẩn đến khả phân hủy Diazinon chủng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.3 TA4.17 Dòng vi khuẩn HA7.1 HA7.4 TA3.2 TA4.17 MS P* MS P* MS P* MS P* a a a (ĐC) 100 (ĐC) 100 (ĐC) 100 (ĐC) 100 a ab ab ab 6,67.10 88.4 7,00.10 91.8 4,67.10 89.9 5,67.104 92.8ab bc b ab 4,30.10 79.2 6,30.10 84.9 4,00.10 86.2 6,00.105 82.7 bc c b b 5,67.10 70.7 5,30.10 80.1 5,30.10 81.9 4,30.106 75.1 c Ghi chú: P*: Phần trăm Diazinon lại sau 30 ngày nuôi cấy (%) MS: Mật số vi khuẩn ĐC: Đối chứng Các chữ theo sau giống khác biệt không ý nghĩa mức  = 0,05 M SBĐ 25oC 30oC 37oC Logarit mật số tế bào vi khuẩn (CFU/ml) Logarit mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/ml) 4.9 Ảnh hưởng nhân tố sinh thái đến gia tăng mật số khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác luân canh lúa-màu 4.9.1 Ảnh hưởng nhân tố sinh thái đến gia tăng mật số dòng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác luân canh lúa-màu Kết thí nghiệm cho thấy hai dòng vi khuẩn BT4_L1 CL36_M4 mật số vi khuẩn tăng cao nhiệt độ môi trường 30oC, pH 7, nguồn cacbon TSB nồng độ Diazinon dao động từ 20 ppm đến 50 ppm (Hình 4.19, Hình 4.20) MSBĐ pH = pH = pH = pH = BT4_L1 CL36_M4 Dòng vi khuẩn BT4_L1 CL36_M4 Dòng vi khuẩn Hình 4.19 Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến gia tăng mật số dòng vi khuẩn (BT4_L1, CL 36_M4) sau ngày nuôi ủ 12 11 10 MSBĐ Glucose TSB 12 Logarit mật số tế bào vi khuẩn (CFU /ml) Logarit mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/ml) Ghi chú: MSBĐ: Mật số ban đầu MSBĐ 150 ppm 20 ppm 200 ppm 50ppm 100 ppm 10 BT4_L1 CL36_M4 Dòng vi khuẩn BT4_L1 Dòng vi khuẩn CL36_M4 Hình 4.20 Ảnh hưởng nguồn cacbon (glucose, TSB) nồng độ Diazinon đến gia tăng mật số dòng vi khuẩn (BT4_L1, CL 36_M4) sau ngày nuôi ủ Ghi chú: MSBĐ: Mật số ban đầu 21 4.9.2 Ảnh hưởng nhân tố sinh thái đến khả phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác luân canh lúa-màu Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phân hủy Diazinon hai dòng vi khuẩn BT4_L1 CL36_M4 thể qua Hình 4.21 Đối với dòng vi khuẩn BT4_L1 có khả phân hủy Diazinon hiệu nhiệt độ 25oC 30oC, giảm tương ứng 14,8% (tốc độ phân hủy 0,49%/ngày) 31,0% (tốc độ phân hủy 1,03%/ngày) Bên cạnh đó, dòng vi khuẩn CL36_M4 có khả phân hủy Diazinon hiệu 30oC, giảm tương ứng 21,1% (tốc độ phân hủy 0,70%/ngày) ĐC Hình 4.21 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn (BT4_L1, CL 36_M4) sau 30 ngày nuôi ủ Phần trăm Diazinon lại (%) 120 BT4_L1 a a b 80 CL36_M4 a ab 100 a a b b 60 40 20 25oC 30oC 37oC Phân hủy sinh học thuốc bảo vệ thực vật đường chủ yếu chịu ảnh hưởng nhiều nhân tố Trong đó, pH nhân tố có vai trò quan trọng thúc đẩy trình phân hủy Diazinon (Gunther, 1974) Kết thí nghiệm thể Bảng 4.4, cho thấy dòng vi khuẩn BT4_L1 có khả phân hủy Diazinon hiệu pH 5, pH pH 7, hàm lượng Diazinon giảm tương ứng 16% (tốc độ phân hủy 0,53%/ngày), 21,1% (tốc độ phân hủy 0,70%/ngày), 30,5% (tốc độ phân hủy 1,02%/ngày) Đối với dòng vi khuẩn CL36_M4 thể khả phân hủy Diazinon hiệu pH pH 7, hàm lượng Diazinon giảm tương ứng 13,8% (tốc độ phân hủy 0,46%/ngày), 21,7% (tốc độ phân hủy 0,72%/ngày) Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH đến phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn (BT4_L1, CL 36_M4) sau 30 ngày nuôi ủ Giá trị pH Dòng vi khuẩn pH = pH = pH = pH = Đối chứng 100 a 100 a 100 a 100 a a b b Dòng BT4_L1 95,6 84,1 78,9 69,5 b a ab b Dòng CL36_M4 94,3 90,4 86,2 78,3 b Ghi chú: Các số liệu bảng 4.4 thể phần trăm Diazinon lại (%) Các chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng giá trị pH Dòng vi khuẩn BT4_L1 phân hủy Diazinon hiệu bổ sung Diazinon đạt nồng độ từ 20 ppm đến 50 ppm, hàm lượng Diazinon giảm tương ứng từ 29,2% (giảm 0,97%/ngày) 16,5% (giảm 22 0,55%/ngày) Tương tự, dòng vi khuẩn CL36_M4 phân hủy Diazinon hiệu bổ sung Diazinon đạt nồng độ từ 20 ppm đến 50 ppm, hàm lượng Diazinon giảm tương ứng từ 20,1% (giảm 0,67%/ngày) 12,6% (giảm 0,42%/ngày) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng Bảng 4.5 Ảnh hưởng nồng độ Diazinon đến phân hủy Diazinon dòng vi khuẩn (BT4_L1, CL 36_M4) sau 30 ngày nuôi ủ Nồng độ Diazinon (ppm) Dòng vi khuẩn Đối chứng Dòng BT4_L1 Dòng CL36_M4 20 100 a 70,8 b 79,9 b 50 100 a 83,5 b 87,4 b 100 100 a 90,9 91,1 b b 150 100 a 98,0 a 97,5 a 200 100 a 96,5 a 97,1 a Ghi chú: Các số liệu bảng 4.5 thể phần trăm Diazinon lại (%) Các chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng nồng độ Diazinon Ảnh hưởng mật số vi khuẩn đến khả phân hủy Diazinon hai dòng vi khuẩn BT4_L1 CL36_M4, thể qua Bảng 4.6 Kết thí nghiệm cho thấy, dòng vi khuẩn BT4_L1 phân hủy Diazinon hiệu mật số vi khuẩn chủng ban đầu 6,67.104 cfu/mL 5,67.106 cfu/mL, hàm lượng Diazinon giảm tương ứng từ 12,7% (giảm 0,42%/ngày) đến 35,4% (giảm 1,18%/ngày) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng Dòng vi khuẩn CL36_M4 phân hủy Diazinon hiệu mật số vi khuẩn chủng ban đầu đạt từ 6,3.105 cfu/mL đến 5,3.106 cfu/mL, hàm lượng Diazinon giảm tương ứng từ 14,8% (giảm 0,49%/ngày) đến 22,2% (giảm 0,74%/ngày) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng Bảng 4.6 Ảnh hưởng mật số vi khuẩn đến phân hủy Diazinon (BT4_L1, CL 36_M4) vi khuẩn sau 30 ngày nuôi ủ Dòng vi khuẩn BT4_L1 CL36_M4 Mật số vi khuẩn P* Mật số vi khuẩn 100 a Đối chứng Đối chứng b 87,3 6,67.10 7,00.104 b 4,30.10 80,3 6,30.105 c 5,67.10 64,6 5,30.106 dòng P* 100 a 88,3ab 85,2 b 77,8 b Ghi chú: P* phần trăm Diazinon lại sau 30 ngày nuôi cấy (%) Các chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng nồng độ Diazinon Theo kết xác định độ pH mẫu đất số tỉnh Đồng sông Cửu Long, dao động từ 4,5 đến 5,5 Vì thế, dòng vi khuẩn HA7.1 chọn để tiếp tục nghiên cứu khả phân hủy Diazinon đất Đồng thời, nghiên cứu tương tác dòng vi khuẩn HA7.1 với cộng đồngvi khuẩn đất đến tốc độ phân hủy Diazinon 4.10 Ảnh hưởng mô hình canh tác đến cấu trúc cộng đồngvi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon 23 Trên mô hình luân canh lúa màu đồng ruộng, cấu trúc cộng đồng vi khuẩn hiếu khí phân hủy diazinon đất vào vụ màu chứa nhóm vi khuẩn khác nhau, vụ lúa, chứa nhóm vi khuẩn Trong điều kiện nhà lưới, mô hình chuyên màu cấu trúc cộng đồng vi khuẩn phân hủy diazinon đất phân tách thành nhóm vi khuẩn khác Trong mô hình luân canh lúa-màu cho thấy đất vụ màu có chứa nhóm vi khuẩn khác nhau, đất vụ lúa chứa nhóm vi khuẩn khác (Hình 4.22, Hình 4.23) Hình 4.22 Cấu trúc cộng đồng vi khuẩn: (1) mô hình luân canh lúa màu vụ lúa, (2) mô hình luân canh lúa màu vụ màu (đậu xanh), (3) mô hình chuyên canh màu (đậu xanh) điều kiện nhà lưới (1) (2) (3) Hình 4.23 Cấu trúc cộng đồng vi khuẩn: (1) mô hình luân canh lúa-màu vụ lúa (BT50_L), (2) mô hình luân canh lúa màu vụ màu (khoai lang) (BT50_M) đồng ruộng (1) (2) 4.11 Đánh giá khả phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon dòng vi khuẩn HA7.1, đất điều kiện phòng thí nghiệm Kết thí nghiệm cho thấy, nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn (NT2, NT4, NT5) hàm lượng Diaiznon giảm theo thời gian so với đối chứng (NT1) Trong đó, thời điểm 30 ngày, nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn HA7.1 hàm lượng Diazinon giảm khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng Trong đó, nghiệm thức hàm lượng Diazinon giảm mạnh so với nghiệm thức 2, giảm tương ứng 63,7% (giảm 2,11%/ngày) 48,6% (giảm 1,62%/ngày) Kết tương tự với kết nghiên cứu Cycon et al (2009), tổ hợp hệ vi khuẩn gồm chủng vi khuẩn tốc độ phân hủy Diazinon gấp 2,1 lần so với chủng vi khuẩn độc lập (Hình 4.24) 24 HàmlượngDiazinoncònlại (% ) NT1 120 a a a a 100 a NT2 a NT3 a NT5 a a a 80 NT4 a a b b 60 b 40 20 10 ngày 20 ngày 30 ngày Hình 4.24 Khả phân hủy Diazinon vi khuẩn đất phòng thí nghiệm Ghi chú: NT1: Đất tiệt trùng + không bổ sung vi khuẩn (đối chứng); NT2: Đất tiệt trùng + bổ sung vi khuẩn HA7.1; NT3: Đất không tiệt trùng + không bổ sung vi khuẩn; NT4: Đất không tiệt trùng + bổ sung vi khuẩn HA7.1; NT5: Đất không tiệt trùng + bổ sung tổ hợp vi khuẩn BT4_L1, CL36_M4, HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17 Các chữ khác ứng với thời điểm thể khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng 4.12 Định danh chủng vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon Kết giải mã trình tự gen 16S rRNA sáu dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17, CL36_M4 BT4_L1 thể qua Bảng 4.8, Bảng 4.9 Trong đó, Achromobacter xylosoxidans BT4_L1 biết đến dòng vi khuẩn có khả phân hủy hiệu hợp chất thuốc trừ sâu lân hữu công bố nghiên cứu trước (Niansheng et al., 2007) Bảng 4.8 Định danh số dòng vi khuẩn phân hủy hoạt chất thuốc phân lập từ đất thu từ ruộng luân canh lúa-màu Dòng Độ Thông tin sở liệu tương Vi khuẩn Số đăng kí đồng (%) BT4_L1 100 Achromobacter KP240967.1 xylosoxidans strain CIFT MFB 14375(TK50) 100 Achromobacter JQ923444.1 xylosoxidans strain BL6 100 Achromobacter HQ676601.1 xylosoxidans strain M66 100 Achromobacter HQ393893.1 xylosoxidans strain WB-24 100 Achromobacter DQ466568.1 xylosoxidans strain B8L 100 Achromobacter AB161691.1 xylosoxidans strain NFRIA1 CL36_M4 98 Cupriavidus sp USMAA2-4 KF460029.1 98 Cupriavidus gilardii isolate EF114429.1 MSMB32 98 Cupriavidus sp DQ351699.1 USMAA1020 98 Cupriavidus sp KF460028.1 USMAHM13 trừ sâu Diazinon Định danh Achromobacter xylosoxidans BT4_L1 Cupriavidus sp CL36_M4 25 Bảng 4.9 Định danh số dòng vi khuẩn phân hủy hoạt chất thuốc phân lập từ đất thu từ ruộng chuyên canh màu Dòng Độ tương Thông tin sở liệu đồng (%) Vi khuẩn Số đăng kí HA7.1 99 Lactobacillus plantarum strain CP014780.1 JBE245 99 Lactobacillus plantarum strain CP010528.1 B21 99 Lactobacillus plantarum strain CP012122.1 LZ95, 99 Lactobacillus plantarum strain CP015126.1 CAUH2 HA7.4 97 Pandoraea sp B2-9 EF467849.1 97 Pandoraea pnomenusa strain LAEF191352.1 97 Pandoraea sp LA-1 EF191351.1 97 Pandoraea sp S14 AY741155.1 97 Pandoraea sp 2001032141 AY268169.1 97 Pandoraea sp G8107 AF247695.1 97 Pandoraea pnomenusa strain NR_114519.1 LMG 18087 TA3.2 97 Sinomonas atrocyanea strain B80 LN890256.1 97 Sinomonas atrocyanea strain B54 LN890230.1 97 Sinomonas atrocyanea strain B42 LN890218.1 97 Sinomonas atrocyanea strain KF687069.1 JN144 97 Sinomonas atrocyanea strain KF687060.1 JN132 97 Sinomonas atrocyanea strain KF150415.1 JN170 TA4.17 99 Achromobacter xylosoxidans CP014065.1 strain FDAARGOS_162 99 Achromobacter xylosoxidans JX042463.1 strain SSB2 99 Achromobacter denitrificans FJ810080.1 strain 22426 trừ sâu Diazinon Định danh Lactobacillus plantarum HA7.1 Pandoraea sp HA7.4 Sinomonas atrocyanea TA3.2 Achromobacter xylosoxidans TA4.17 26 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Lượng thuốc trừ sâu Diazinon nông dân sử dụng nhiều mô hình chuyên màu luân canh lúa-màu Mô hình canh tác luân canh lúa-màu chuyên màu ảnh hưởng đến phân hủy dư lượng thuốc trừ sâu Diazinon Trên mô hình chuyên màu, phân lập dòng vi khuẩn HA7.4, TA3.2, TA4.17, HA7.1 có khả phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon hiệu quả, giảm từ 15,4% đến 27,9% sau 30 ngày nuôi ủ Mật số bốn dòng vi khuẩn đạt cao điều kiện nhiệt độ 30oC, độ pH (ngoại trừ dòng HA7.1 mật số cao pH 6), nguồn cacbon TSB nồng độ Diazinon 20 ppm – 50ppm sau ngày nuôi ủ Các dòng vi khuẩn thể khả phân hủy Diazinon hiệu nhiệt độ 30oC, độ pH pH 7, nồng độ Diazinon 20 ppm mật số vi khuẩn khoảng 106 CFU/mL Trên mô hình canh tác luân canh lúa–màu, phân lập dòng vi khuẩn ký hiệu CL36_M4 BT4_L1 phân hủy hiệu Diazinon 20,9% 29,3% sau 30 ngày nuôi cấy Mật số hai dòng vi khuẩn CL36_M4 BT4_L1 đạt cao nhiệt độ 30oC, độ pH 7, nguồn cacbon TSB nồng độ Diazinon 20 ppm–50ppm Hai dòng vi khuẩn phân hủy Diazinon hiệu nhiệt độ 30oC, độ pH 7, nồng độ Diazinon 20 ppm mật số vi khuẩn khoảng 106 CFU/mL Mô hình canh tác luân canh lúa-màu chuyên canh màu ảnh hưởng đến cấu trúc cộng đồng vi khuẩn phân hủy Diazinon điều kiện nhà lưới đồng ruộng Kết giải mã trình tự gen 16S rRNA sáu dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17, CL36_M4 BT4_L1 cho thấy chúng định danh Lactobacillus plantarum HA7.1, Pandoraea sp HA7.4, Sinomonas atrocyanea TA3.2, Achromobacter xylosoxidans TA4.17, Cupriavidus sp.CL36_M4 Achromobacter xylosoxidans BT4_L1 5.2 Kiến nghị Tiếp tục có thí nghiệm khảo sát khả phân hủy Diazinon loài vi khuẩn Lactobacillus plantarum HA7.1, Pandoraea sp HA7.4, Sinomonas atrocyanea TA3.2, Achromobacter xylosoxidans TA4.17, Cupriavidus sp.CL36_M4 Achromobacter xylosoxidans BT4_L1 đồng ruộng phương pháp làm giàu sinh học kích thích sinh học ... Diazinon nông dân sử dụng nhiều mô hình chuyên màu luân canh lúa- màu Mô hình canh tác luân canh lúa- màu chuyên màu ảnh hưởng đến phân hủy dư lượng thuốc trừ sâu Diazinon Trên mô hình chuyên màu, ... sung Diazinon đạt nồng độ 20 ppm theo dõi phát triển dòng vi khuẩn 3.2.3.2 Đánh giá khả phân hủy Diazinon chủng vi khuẩn phân lập mô hình canh tác luân canh lúa- màu chuyên màu Các dòng vi khuẩn. .. mật số cộng đồng vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon Từ 21 mẫu đất thu từ mô hình chuyên màu 20 mẫu đất thu từ mô hình luân canh lúa- màu làm giàu mật số 41 cộng đồng vi khuẩn có khả 15 phân