ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Bx TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Phúc Đạt NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KINH GIỚI Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Phúc Đạt NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KINH GIỚI Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ VIỆT HƯƠNG Hà Nội – Năm 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Đỗ Thị Việt Hương – giảng viên khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội, người thầy tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô thuộc môn Hóa Dược, Khoa Hóa học, trường ĐHKHTN, thầy cô khoa Hóa học hỗ trợ em trình tiến hành thực đề tài Xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn bè làm việc phòng Hóa Dược, khoa Hóa học, trường ĐHKHTN, cô chú, anh chị làm việc phòng Hóa sinh ứng dụng thuộc Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành kết đề tài Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Trần Phúc Đạt MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Khái quát kinh giới 1.1.1 Đặc điểm thực vật kinh giới, loài Elscholtzia ciliata, họ Lamiaceae 1.1.2 Vùng phân bố, thu hát chế biến 1.2 Nghiên cứu dược lý kinh giới 1.2.1 Tác dụng trị liệu theo kinh nghiệm dân gian 1.2.2 Những nghiên cứu khoa học 1.3 Thành phần hóa học kinh giới 1.3.1 Các hợp chất Flavonoid 10 1.3.2 Terpenoids steroids 11 1.3.3 Acid béo 14 1.3.4 Một số hợp chất có tinh dầu E ciliata 14 1.4 Hoạt tính sinh học 15 1.4.1 Khả chống oxy hóa 15 1.4.2 Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase 17 Chương - THỰC NGHIỆM 18 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3 Thực nghiệm 19 2.3.1 Chiết lớp chất từ mẫu kinh giới 19 2.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EH) phần chiết etyl acetat (EE) phương pháp sắc ký cột (CC) 21 2.3.3 Khảo sát định tính nhóm phân đoạn hệ thống sắc ký khổi phổ GC/MS 24 2.3.4 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát định tính nhóm phân đoạn hệ thống GC/MS 28 28 3.1.1 Cặn chiết n-hexan 28 3.1.2 Cặn chiết etyl acetat 36 3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học 43 3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa 43 3.2.2 Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase 45 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Thành phần hóa học nghiên cứu chi kinh giới 10 Bảng 1.2 Một số hợp chất phân lập từ loài E ciliata 10 Bảng 2.1 Hiệu suất phần chiết từ mẫu kinh giới 20 Bảng 3.1 Kết phân tách cặn chiết n-hexan sắc ký cột 28 Bảng 3.2 Thành phần hóa học dịch chiết n-hexan 29 Bảng 3.3 Các tín hiệu phổ H1 34 Bảng 3.4 Kết phân tách cặn chiết etyl acetat sắc ký cột 37 Bảng 3.5 Thành phần hóa học dịch chiết etyl acetat 38 Bảng 3.6 Kết độ hấp thụ quang 43 Bảng 3.7 Khả ức chế enzym 𝛼-glucosidase cặn chiết kinh giới .45 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cây, hoa kinh giới Hình 1.2 Cấu trúc flavonoid phân lập từ loài E ciliata .11 Hình 1.3 Cấu trúc daucosterol 14 Hình 2.1 Mẫu kinh giới thu mua 18 Hình 3.1 Sắc ký đồ GC-MS phân đoạn EH2 kinh giới .29 Hình 3.2 Các acid béo mạch dài dịch chiết kinh giới .31 Hình 3.3 Tecpenoid dịch chiết kinh giới 32 Hình 3.4 Flavonoid dịch chiết kinh giới 32 Hình 3.5 Phổ NMR hợp chất H1 .33 Hình 3.6 Cấu trúc H1 33 Hình 3.7 Sắc ký đồ H2 .35 Hình 3.8 Phổ khối H2 36 Hình 3.9 Sắc ký đồ GC-MS phân đoạn EE2 kinh giới .37 Hình 3.10 Cấu trúc E1 .39 Hình 3.11 Sắc ký đồ hợp chất E1 39 Hình 3.12 Phổ khối lượng E1 so sánh với thư viện MS 40 Hình 3.13 Cấu trúc E2 .41 Hình 3.14 Sắc ký đồ GC E2 41 Hình 3.15 Phổ khối E2 so sánh với thư viện MS 42 Hình 3.16 Đường chuẩn phenolic 43 Hình 3.17 Tổng phenolic dịch chiết từ kinh giới 44 Hình 3.18 Tổng lượng flavonoid dịch chiết kinh giới 45 Hình 3.19 Đồ thị khảo sát khả ức chế enzym 𝛼-glucosidase 46 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết từ mẫu khô 20 Sơ đồ 2.2 Phân tách phân đoạn dịch chiết n-hexan 22 Sơ đồ 2.3 Phân tách phân đoạn dịch chiết etyl acetat 23 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ý nghĩa Chữ viết tắt Abs Độ hấp thụ quang CC Sắc ký cột thường EH Cặn chiết n-hexan EE Cặn chiết etyl acetat E Elsholtzia FC sắc ký cột nhanh GC-MS Phương pháp phân tích sắc ký khí kết hợp khối phổ IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử LD50 Liều gây chết 50% đối tượng thử MIC Nồng độ ức chế tối thiểu TLC Sắc ký mỏng TT Thứ tự MỞ ĐẦU Nước Việt Nam nằm vùng nhiệt đới điều kiện khí hậu nhiệt độ, lượng mưa, ánh sáng…và hết điều kiện thổ nhưỡng đặc trưng thích hợp cho nhiều loài thực vật có giá trị tồn phát triển Đó nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo Từ thời xa xưa xã hội loài người khai thác nguồn tài nguyên để làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh, vật liệu nhiên liệu cho sống thường ngày Kinh giới, biết đến loại rau thơm, không dùng bữa ăn hàng ngày nhờ vị bạc hà đặc trưng, mà sử dụng loài nước xông chữa số bệnh da trẻ em Kinh giới thuộc chi Elsholtizia, họ Lamaecia phổ biến nước ta Do tính chất sử dụng rộng rãi, nên nhiều công trình khoa học nghiên cứu thực vật hóa học, nhằm lựa chọn nâng cao giá trị sử dụng loài Tuy nhiên nghiên cứu loài kinh giới thành phần hóa học, công dụng số lượng loài kinh giới chưa đầy đủ không đồng số tài liệu Để góp phần vào việc nghiên cứu cách sâu rộng loài riềng có nước, chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Kinh giới (Elsholtzia ciliata) Việt Nam” từ đưa hướng khai thác ứng dụng loài kinh giới đời sống Vì vậy, nhiệm vụ đặt cho là: Xây dựng quy trình chiết thích hợp để điều chế phần chiết từ kinh giới, từ định hướng khảo sát thành phần hóa học hợp chất có kinh giới Nhận dạng số hợp chất phân lập từ phân đoạn chiết kinh giới Khảo sát hoạt tính sinh học phần chiết kinh giới Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Khái quát kinh giới Chi kinh giới (Elsholtzia Willd) thuộc họ Lamiaceae, có khoảng 40 loài kinh giới giới phân bố chủ yếu Đông Á, Châu Phi, Bắc Mỹ, số quốc gia Châu Âu [10, 33] Ở Việt Nam, có loài thuộc chi kinh giới nghiên cứu ứng dụng làm thực phẩm dược phẩm 1.1.1 Đặc điểm thực vật kinh giới, loài Elscholtzia ciliata, họ Lamiaceae Tên khoa học: Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland, họ Lamiaceae Tên thông thường: Kinh giới rìa, Kinh giới trồng [1] Tên đồng nghĩa: Sideritis ciliata Thunb., Elsholtzia cristata Will., Hyssopus ocymifolius Lamk., Mentha ovata Cav., Mentha patrini Lepech., Perilla polystachya D Don, Elsholtzia pattini (Lepech.) Garcke Một số tên khác: Khương giới [3], Giả tô, Nhả nát bom (Thái), Phjăc bom khao (Tày), Bài hương thảo Mô tả thực vật Kinh giới thảo sống năm có đặc điểm sau: Thân thuộc loại cỏ đứng, cao 0,6-0,8 m, toàn có lông màu trắng, có mùi thơm [3] Thân non màu xanh, tiết diện vuông khuyết bốn cạnh Thân già màu nâu tía có bốn góc lồi tròn dọc thân Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập Phiến màu xanh đậm mặt trên, hình trứng đinh nhọn, gốc hình nêm men phần dọc theo hai bên cuống lá, kích thước 3-7 x 2,5-5 cm, bìa cưa nhọn không 2/3 phía trên, mặt nhiều chấm nhỏ (lông tiết) Gân hình lông chim, rõ mặt dưới, 4-7 cặp gân phụ cong Cuống hình trụ phẳng mặt trên, gốc cuống lồi thành u nhỏ, mặt có lông rậm màu trắng giữa, dài 2,5-4cm cứu O Gangarani Devi [33], loài E ciliata có tổng hàm lượng flavonoid thấp Hình 3.18 Tổng lượng flavonoid dịch chiết kinh giới 3.2.2 Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase Cặn chiết etyl acetat n-hexan đóng vai trò mẫu thử khảo sát hoạt tính giá trị nồng độ 0; 0,25; 1,0; 4,0; 16; 64; 256 ppm Kết độ hấp thụ quang thu bảng 3.7 Bảng 3.7 Khả ức chế enzym 𝛼-glucosidase cặn chiết kinh giới Nồng độ chất ức chế (ppm) 0,0 0,25 1,0 4,0 16 64 256 Abs 0,102 0,096 0,093 0,091 0,087 0,073 0,070 etyl acetat % Ức chế 5,88 8,82 10,78 14,71 28,43 31,37 45 Abs 0,102 0,136 0,104 0,097 0,093 0,093 0087 n-hexan % Ức chế -33,33 -1,96 4,90 8,82 8,82 14,71 Giá trị ức chế 50% mẫu thử thu qua đồ thị phụ thuộc nồng độ mẫu thử với phần trăm ức chế Giá trị IC50 chất tham chiếu arcabose 175,89 ppm Hình 3.19 Đồ thị khảo sát khả ức chế enzym 𝛼-glucosidase Từ kết khảo sát hai cặn chiết etyl acetat n-hexan kinh giới cho thấy khả ức chế enzym 𝛼-glucosidase thấp, với nồng độ vượt 256 ppm chưa đạt khả ức chế 50% Điều chứng tỏ, hai cặn chiết kinh giới có tiềm thấp cho tác dụng điều trị bệnh tiểu đường type 46 KẾT LUẬN Loài kinh giới không loại rau thơm dùng phổ biến dân gian, làm nhiều thuốc chữa bệnh, mà giá trị thí nghiệm sinh học Qua trình nghiên cứu loài Elsholtzia ciliata Việt Nam, thu kết sau: Lần khảo sát thành phần hóa học dễ bay có dịch chiết kinh giới Hà Nội, Việt Nam Đã xây dựng quy trình chiết chọn lọc lớp chất từ thân kinh giới theo độ phân cực tăng dần dung môi chiết Kết thu hai phần chiết: phần chiết n-hexan (EH) phần chiết etyl acetat (EE) với hiệu suất phần chiết 1,56% 11,63% Đã khảo sát sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (EH) chọn hệ dung môi n-hexan:etyl acetat (5:1,v/v), phần chiết etyl acetat (EE) chọn hệ dung môi n-hexan:etyl acetat:axit axetic (5:1:1, v/v/v) hệ cho kết phân tích tốt lớp mỏng Kết phân tích hệ thống GC-MS thành phần hóa học cho kết loài kinh giới bao gồm hợp chất từ acid béo bão hòa acid không bão hòa, flavonoid, đến terpenoid steroid số hợp chất khác Trong đó, phần chiết n-hexan có thành phần gồm terpenoid steroid phytol (35,42%), βsitosterol (15,18%) nerolidol (9,07%) Trong phần chiết etyl acetat có thành phần gồm methyl linolenate (25,43%), β-sitosterol (18,18%) acid palmitic (12,07%) Đã nhận dạng hợp chất kết tinh phân đoạn EH2, EH3, EE2 EE3 là: Chất H1 hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol Chất H2 emodin 47 Chất E1 cyclopropanenonanoic acid[2-(2-butylcyclopropyl)methyl] methyl ester Chất E2 loliolide Đã khảo sát số hoạt tính sinh học phần chiết kinh giới Việt Nam cho kết quả: Về hoạt tính chống oxy hóa cho thấy tiềm chống oxy hóa cao với phần cặn chiết n-hexan etyl acetat Tổng hàm lượng phenolic hai cặn chiết 79,20 48,98 mg acid galic/100g nguyên liệu khô Giá trị tổng hàm lượng flavonoid 23,15 mg 10,42 mg catechin 100 g mẫu khô Tuy nhiên, khả ức chế enzym -glucosidase hai cặn chiết thấp 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (2005), Danh mục loài thực vật Việt Nam, tập III, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Trương Thị Đẹp (2007), Thực vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội Hà Thị Bích Ngọc (2012), Điều tra, nghiên cứu số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2, Luận án tiến sĩ ngành Hóa sinh học, Khoa Sinh học-ĐH KHTN, Hà Nội Phan Tống Sơn, Phan Minh Giang (2016), Hóa học hợp chất thiên nhiên, tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh Ai-Lin Liu, Simon M.Y Lee, Yi-Tao Wang, Guan-Hua Du (2007), “Elsholtzia: review of tradutuibak uses, chemistry and pharnacology”, Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, vol 2, pp 73-78 Alison M D., Richard J P., Mark E H., Andrew D A (2003), “The synthesis of naturally occurring Vitamin K and Vitamin K analogues”, Current Organic Chemistry, vol 7, pp 1625-1634 Arati A Inamder, Muhammed M Hossain, Alison I Bernstein, Gary W Miller, Jason R Richardson, semiochemical and 1-octen-3-ol Wennstrom disrupts Bennett dopamine (2013), packaging “Fungal-derived and causes neurodegeneration”, Proc National academy of sciences of the U.S.A, vol 110, pp 19561-19566 A.V Zhukov (2015), “Palmitic acid and its role in the structure and functions of plant cell membranes”, Russian Journal of plant physiology, vol 62, pp 706-713 10 B Boncheewin, P Chantanranothai, A Paton (2015), “Elsholtzia (Lamiaceae) in Thailand”, Blumea, 59, pp 209-214 49 11 Chang YY, Cronan JE Jr (1999), “Membrane cyclopropane fatty acid content is a major factor in acid resistance of Escherichia coli”, Mol Microbiol, 33, pp 249-59 12 Elena A Korolyuk, Wilfried Konig, Alexey V Tkachev (2002), “Composition of essential oil of Elsholzia ciliata (Thunb,) Hyl From the Novosibirsk region, Russia”, Khimiya Rastitel'nogo Syr'ya, vol 1, pp 31-36 13 Gerhard Knothe (2006), “NMR charaterization of dihydrosterculic acid and methyl ester”, Lipids, 41, pp 393-396 14 Haimin Chen, Xiaojun Yan, Wei Lin, Li Zheng, Weiwei Zhang (2004), “A New Method for Screening a-Glucosidase Inhibitors and Application to Marine Microorganisms”, Pharmaceutical Biology, vol 6, pp 416–421 15 Hakamata W, Kurihara M, Okuda H, Nishio T, Oku T (2009), “Design and screening strategies for alpha-glucosidase inhibitors based on enzymological information”, Curr Top Med Chem., 9(1), pp 3-12 16 Hu HB, Zheng XD, Hu HS, Zhang YQ (2006), “Studies on chemical constituents from Elsholzia bodinieri vaniot in Ganzu, China”, J Baoji Univ Arts Sci, 26, pp 196199 17 Jean Legault and Andre Pichette (2007), “Potentiating effect of β-caryophyllene on anticancer activity of α-humulene, isocaryophyllene and paclitaxel”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol 59, pp 1643-1647 18 Jong Ro Kim, Dool-Ri Oh, Mi Hye Cha, Byoung Sik Pyo, Joon Haeng Rhee, Hyon E Choy, Won Keun Oh, Young Ran Kim (2008), “Protective effect of polygoni cuspidate radix and emodin on Vibrio vlnificus cytotoxycity and infection”, The journal of Microbiology, pp 737-743 19 Li Wing-yan (2007), Pharmacological studies on Radix et Rhizoma Rhei (Da huang) and its active component, emodin, The Hong Kong polytechnic university, Hong Kong 20 Marinova D., Ribarova F., Altanassova (2005), “Total phenolics and total flavonoids in Bulgarian fruits and vegetables”, Jounal of the university of Chemical Technology and Metallurgy, vol 40, pp 255-260 50 21 Marsden S Blois (1958), “Antioxydant determinations by the use of a stable free radical”, Nature, 181, pp 1199-1200 22 Misa Khan, Showkat Ahmad Ganie, Ishfak Hussain Wani, Bashir Ahmad Ganai, Akbar Masood, Mohmmad Afzal Zargar, Akhter Hussain Malik, Rabia Hamid (2012), “Free radical Scavenging activity of Elsholtzia densa”, Jounal of Acupuncture and Meridian studies, vol 5, pp 104-111 23 O Gangarani Devi, T Chand Singh, O Ibeton Devi, E J Singh (2016), “Phytochemical analysis of six aromatic plants”, International journal of scientific research, vol 5, pp 389-391 24 R Hodges, A L Porte (1964), “Structure of loliolide: A terpene from Lolium perenne”, Tetrahedron, 20, pp 1463-1467 25 Robert S., Goodhart and Maurice E., Shils (1980), Modern Nutrition in Health and Disease, Lea and Febinger, Philadelphia, pp 134-138 26 Sook-Jin Lee, Je-Ik Han, Geun-Shik Lee, Mi-Jin Park, In-Gyu Choi, Ki-Jeong Na, Eui-Bae Jeung (2007), “Antifungal effect of eugenol and nerolidol against Microsporum gypseum in a guinea pig model”, Biol Pharm Bull, vol 30 (1), pp 184188 27 Tian Guang-hui (2013), “Chemical constituents in essential oils from Elsholtzia ciliata and their antimicrobial activities”, Chinesse herbal medicines, vol 5(2), pp.104-108 28 T Khan, M Zahid , M Asim, Shahzad-ul Hussan, Z Iqbal, M Iqbal Choudhary, V Uddin Ahmad (2002), “Pharmacological actitivites of crude acetone extract and purified constituents of Salvia moorcraftiana Wall”, Phytomedicine, 9, pp 749-752 29 Venkata Sai Prakash Chaturvedula (2012), “Isolation of stigmasterol and βsitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus”, International Current Pharmaceutical Journal, 1, pp 239-242 30 Wafaa Benalla, Said Bellahcen, Mohamed Bnouham (2010), “Antidiabetic medicinal plants as a source of alpha glucosidase inhibitors”, Current, Diabetes Reviews, 6, pp 247-254 51 31 Xiangping Liu, Jia Jia, Lei Yang, Fengjian Yang, Hongshuang Ge, Chunjian Zhao, Lin Zhang and Yuangang Zu (2012), “Evaluation of antioxydant activities of aqueous extracts and fractionation of different parts of Elsholtzia ciliata”, Molecules, vol 17, pp 5430-5441 32 Yan Ding, Lei Zhao, Hong Mei, Shu-Ling Zhang, Zhi-Hua Huang, Yan-Ying Duan, Pian Ye (2008) “Exploration of emodin to treat alpha naphthylisothiocyanteinduced cholestic hepatitis via anti-inflammatory pathway, European journal of Pharmacology, 590, pp 377-386 33 Zhiqin Guo, Zizhen Liu, Xiaohong Wang, Weirui Liu, Rui Jiang, Ruiyang Cheng, Gaimei She (2012), “Elsholtzia: Phytochemistry and biological activities”, Chemistry central jounal, vol 52 PHỤ LỤC 53 Phổ NMR H1 54 Phổ GC-MS E1 55 56 Phổ GC-MS H2 57 Phổ GC-MS E2 58 59 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Phúc Đạt NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KINH GIỚI Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa. .. 1.3 Thành phần hóa học kinh giới Theo công trình nghiên cứu nhà hóa học giới, thân loài Kinh giới có chứa số hợp chất sau Bảng 1.1 Thành phần hóa học nghiên cứu chi kinh giới Loài E ciliata Thành. .. chế phần chiết từ kinh giới, từ định hướng khảo sát thành phần hóa học hợp chất có kinh giới Nhận dạng số hợp chất phân lập từ phân đoạn chiết kinh giới Khảo sát hoạt tính sinh học phần chiết kinh