Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN NHO DŨNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TINH DẦU VÀ DỊCH CHIẾT TỪ LÁ TRẦU KHÔNG Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60.44.27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - Năm 2011 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Đào Hùng Cường Phản biện 1: Phản biện 2: Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng bảo vệ chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày tháng năm 2011 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm thông tin - Học liệu - Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Lý chọn ñề tài Con người không tránh khỏi lần mắc bệnh Mỗi bệnh dù nhẹ hay nặng ñều làm người ta khó chịu phải tìm cách chữa trị Hiện nay, y học phát triển mạnh nên có quyền lựa chọn cách chữa trị phù hợp với bệnh tật với hoàn cảnh Với ñiều kiện kinh tế nước ta nay, ña số người dân nghèo việc tìm cách chữa trị vừa rẻ tiền vừa mang lại hiệu quả, không ñể lại tác dụng phụ ñược người dân quan tâm lựa chọn Nền y học dân gian dùng cỏ ñể trị bệnh hình thức chữa bệnh cổ nhân loại, ñã có từ nhiều ngàn năm trước Trên giới, xu hướng nhân loại ngày ưa thuốc có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Việt Nam nước nằm vùng nhiệt ñới ẩm ướt nên hệ thực vật phong phú ña dạng, ñó nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo ñược, nhiều thuốc quý với ñầy ñủ chủng loại số lượng lớn Vậy câu hỏi ñặt là: “Tại không sử dụng chúng ñể chữa bệnh?” [1], [4], [11] Cây trầu có tên trầu không có tên khoa học Piper betle, thuộc loài P.betle Theo ñông y, trầu có vị cay nồng, tính ấm, có tác dụng chữa ho, trị bệnh ñường tiêu hóa, ñau bụng sa sau sinh Lá trầu có chất tinh dầu giúp ngăn ngừa phát sinh ưng thư gan, thực quản, ñại tràng, da Các nhà khoa học Ấn Độ cho biết trầu có Carotenoid, chất xơ có lợi cho tiêu hóa, chống lão hóa hạ ñược cholesterol, làm vững thành mạch, chữa bệnh tăng huyết áp [2], [6] Lá trầu có nhiều công dụng theo ñược biết thực tế, công trình nghiên cứu trước ñây trình chiết, Footer Page of 126 Header Page of 126 tách hay xác ñịnh thành phần hóa học, cấu trúc hợp chất ñó chưa hệ thống Với mong muốn tìm hiểu trầu nhằm làm sáng tỏ công dụng nó, chọn ñề tài “Nghiên cứu chiết tách, xác ñịnh thành phần hóa học tinh dầu dịch chiết từ trầu không” Mục ñích nghiên cứu - Xác ñịnh hàm lượng, số số vật lý, hóa học tinh dầu dịch chiết trầu huyện Tiên Phước - Quảng Nam - Xây dựng quy trình chiết tách số hợp chất hóa học từ tinh dầu dịch chiết trầu - Xác ñịnh thành phần hóa học, công thức cấu tạo số hợp chất tinh dầu dịch chiết - So sánh số thành phần hóa học tinh dầu, dịch chiết trầu Tiên Phước với trầu nơi khác ñã công bố - Khảo sát hoạt tính sinh học tinh dầu dịch chiết trầu Đối tượng nghiên cứu Lá trầu nghiên cứu ñược lấy từ trầu huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam Phương pháp nghiên cứu 4.1 Nghiên cứu lý thuyết 4.2 Phương pháp thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Cấu trúc luận văn: phần mở ñầu, chương (tổng quan), chương (nguyên liệu phương pháp nghiên cứu, chương (kết thảo luận), kết luận kiến nghị, tài liệu tham khảo phụ lục Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát họ Hồ tiêu [2], [4], [10] Họ Hồ tiêu (Piperaceae) họ thực vật chứa 2.000 loài, ñược nhóm chi Chúng loại bụi hay dây leo khu vực nhiệt ñới Các loài họ nói chung có hoa ñược chia thành chuỗi, thông thường có mùi thơm mạnh, cay nồng Quan trọng mặt kinh tế họ bao gồm loại ăn hạt, tiêu, trầu, lốt, xem hình 1.1 Cây trầu Tiêu núi Tiêu ăn hạt Cây lốt Hình 1.1 Một số loài thuộc họ hồ tiêu 1.1.1 Phân loại khoa học [10], [11] Tên khoa học trầu Piper betle Cây trầu ñược gọi trầu không, betel Baum (Đức), árbol de betel (Tây Ban Nha), arbre de betel (Pháp), pokok sirih (Malaisia), Betel Boom (Hà Lan) Footer Page of 126 Header Page of 126 1.1.2 Phân bố [10], [24] Loài có nguồn gốc vùng Đông Nam Á ñược trồng Ấn Độ, Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam, Malaysia Lá trầu loại tốt thuộc giống "Magahi" (từ vùng Magadha) sinh trưởng gần Patna Bihar, Ấn Độ Ở nước ta, trầu ñược trồng khắp vùng miền với quy mô lớn nhỏ khác Có thể trồng riêng lẻ hộ gia ñình trồng thành vườn 1.1.3 Đặc tính thực vật [10] Cây trầu hay trầu không gia vị, thuốc Đây loại thường có màu xanh, dây leo, sống lâu năm, hình trái tim có mặt bóng hoa ñuôi sóc màu trắng 1.1.4 Thành phần hóa học trầu [13], [15], [20] Các công trình nghiên cứu trước ñây cho thấy trầu chứa thành phần sau: - Lá trầu chứa tinh dầu gồm 23 thành phần, ñó chủ yếu: 3-Allyl- 6-methoxyphenyl acetate (14,95%); 4-Allyl-1,2- diacetoxybenzene (8,98%); Chvicol (4,57%); Eugenol (9,03%); Beta-caryophyllene (7,06%); linalol (1,55%) Tinh dầu có màu vàng nhạt, hương thơm nồng, nếm có vị nóng cay - Nhiều nghiên cứu gần ñây cho biết trầu chứa chất tanin, ñường khử, pectin 10%, flavonoid, alkaloid, phytosterol, steroid, axit hữu 1.1.5 Công dụng trầu [1], [2], [25] * Truyền thuyết trầu * Trầu - ăn lá, làm lễ vật gặp gỡ, cưới hỏi làm thuốc chữa bệnh * Những thuốc chữa bệnh trầu [4], [11] Footer Page of 126 Header Page of 126 Bệnh ñái dắt, suy nhược thần kinh, chữa ñau ñầu, bệnh phổi, táo bón, ñau họng số công dụng khác 1.2 Tổng quan tinh dầu [1], [9], [22], [23] Từ xưa, người ñã biết tách sử dụng tinh dầu Ngày nay, tinh dầu ñược xem nguyên liệu hóa học dùng công nghiệp hương liệu, tổng hợp chất thơm, công nghiệp xà phòng, dược phẩm…, ñặc biệt lĩnh vực y học 1.2.1 Sơ lược tinh dầu [28] 1.2.1.1 Khái niệm: Tinh dầu (còn gọi hương du hay tinh du) chất có mùi thơm hay mùi hắc khó chịu mà ta tách ñược từ loài hay loài vật 1.2.1.2 Vai trò tinh dầu 1.2.1.3 Tính chất vật lí 1.2.1.4 Sơ lược số thành phần hóa học tinh dầu dễ bay 1.2.1.5 Kiểm nghiệm bảo quản tinh dầu 1.2.2 Phương pháp chiết tách ñịnh lượng tinh dầu [6], [7] 1.2.2.1 Chiết tách tinh dầu: chưng cất lôi nước 1.2.2.2 Phương pháp ñịnh lượng tinh dầu: theo dược ñiển Việt Nam 1.3 Một số phương pháp phân tích sắc ký [17], [18] 1.3.1 Định nghĩa sắc ký 1.3.2 Quá trình sắc ký 1.3.3 Phương pháp tiến hành sắc ký 1.3.4 Sắc ký lỏng (Liquid Chromatagraphy – LC) 1.3.5 Sắc ký khí (Gas Chromatagraphy – GC) 1.3.6 Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry - MS) 1.4 Cơ sở lý thuyết phương pháp thử hoạt tính sinh học [13] 1.4.1 Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH 1.4.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Thu gom nguyên liệu 2.1.2 Xử lý nguyên liệu 2.1.2.1 Mẫu tươi 2.1.2.2 Mẫu khô 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 2.2.1 Hóa chất Sử dụng số hóa chất hữu như: n-hexane, chloroform, methanol, etyl axetat số hóa chất vô khác 2.2.2 Thiết bị thí nghiệm Bộ chiết soxhlet, máy ño quang UV-VIS, thiết bị cô quay chân không, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy ño sắc ký khí ghép khối phổ, máy ño sắc ký lỏng ghép khối phổ 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Lấy mẫu xử lý mẫu [12] 2.3.2 Xác ñịnh ñộ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại [3], [18] 2.3.2.1 Xác ñịnh ñộ ẩm nguyên liệu 2.3.2.2 Xác ñịnh hàm lượng tro nguyên liệu 2.3.2.3 Xác ñịnh hàm lượng kim loại 2.3.3 Nghiên cứu chiết tách tinh dầu trầu 2.3.3.1 Chiết tách tinh dầu Tinh dầu ñược chiết tách phương pháp chưng cất lôi nước - Nguyên liệu: Lá trầu non trầu già ñược xay nhỏ, nước cất - Dụng cụ: cân phân tích, bếp ñiện ñiều nhiệt, chưng cất lôi nước (bộ tinh dầu nhẹ nước) Footer Page of 126 Header Page of 126 Quy trình chiết tinh dầu trầu ñược trình bày theo sơ ñồ hình 2.6 Lá trầu non, trầu già Xử lí Chưng cất phương pháp lôi nước Tinh dầu Xác ñịnh thành phần, công thức số chất (GC/MS) Na2SO4 Xác ñịnh số số hóa lí Thử nghiệm hoạt tính sinh học Hình 2.6 Sơ ñồ chiết tách tinh dầu trầu 2.3.3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng ñến lượng tinh dầu * Khảo sát nồng ñộ NaCl; nguyên liệu không xay nguyên liệu xay; * Khảo sát tỉ lệ tươi / nước; thời gian chưng cất 2.3.3.3 Định lượng tinh dầu, xác ñịnh số hóa lý tinh dầu [8] * Định lượng tinh dầu: theo phương pháp dược ñiển Việt Nam * Các số vật lý, hóa học tinh dầu trầu non, trầu già 2.3.3.4 Xác ñịnh thành phần hóa học tinh dầu: phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 2.3.3.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh hoạt tính chống oxy hóa DPPH 2.3.4 Nghiên cứu chiết tách số hợp chất hóa học trầu 2.3.4.1 Phương pháp chiết nóng soxhlet 2.3.4.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng ñến trình chiết tách Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 10 Dung môi, tỉ lệ nguyên liệu / thể tích dung môi, thời gian chiết 2.3.4.3 Xác ñịnh thành phần cấu tạo số hợp chất dịch chiết [5], [17], [18] Quy trình chiết tách số hợp chất hóa học trầu dung môi hữu cơ, ñược thực theo sơ ñồ hình 2.8 Lá trầu, xử lý Xác ñịnh kim loại, hàm lượng tro Khảo sát dung môi, tỉ lệ R/L thời gian Bột trầu Chiết nóng soxhlet methanol Dịch chiết methanol Huyề Đuổi dung môi Dịch cao ñặc Hòa tan nước cất Lọc qua giấy lọc thường Đo GC/MS Dịch chiết n-hexane Đuổi dung môi Dịch chiết n-hexane Đo GC/MS Dịch chiết, phần không tan n-hexane Thử hoạt tính sinh học Phần cặn không tan (M), phân lập, ño LC/MS giải phổ xác ñịnh công thức cấu tạo số chất Chloroform Đuổi dung môi Phần tan CHCl3, ño GC/MS xác ñịnh thành phần Sơ126 ñồ chiết tách số hợp chất dung môi hữu Footer Hình Page2.8 10 of Header Page 12 of 126 12 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác ñịnh ñộ ẩm, hàm lượng tro hàm lượng kim loại 3.1.1 Độ ẩm: Lá trầu non 85,4%, trầu già 82,8% 3.1.2 Hàm lượng tro: Lá trầu non 13,3%, trầu già 15,1% 3.1.3 Hàm lượng kim loại Kết phân tích cho thấy thành phần kim loại nặng trầu nghiên cứu nhỏ nhiều so với hàm lượng tối ña cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hưởng ñến sức khoẻ người 3.2 Kết nghiên cứu chiết tách tinh dầu 3.2.1 Tính chất cảm quan tinh dầu trầu non trầu già Tinh dầu thu ñược theo phương pháp chưng cất lôi nước từ trầu non trầu già ñều có màu vàng nhạt, mùi hắc, vị cay, nhẹ nước, không tan nước 3.2.2 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng ñến lượng tinh dầu 3.2.2.1 Kết khảo sát nguyên liệu không xay nguyên liệu xay * Nguyên liệu không xay: - Lá trầu non: thời gian tối ưu thể tích tinh dầu 0,8ml - Lá trầu già: thời gian tối ưu thể tích tinh dầu 1,0ml * Nguyên liệu xay nhỏ: - Lá trầu non: thời gian tối ưu thể tích tinh dầu 1,2ml - Lá trầu già: thời gian tối ưu thể tích tinh dầu 1,5ml 3.2.2.2 Kết khảo sát tỉ lệ khối lượng tươi / nước - Lá trầu non: tỉ lệ mnguyên liệu / Vnước = 1:3,0 Vtinh dầu(ml) 1,2ml - Lá trầu già: tỉ lệ mnguyên liệu / Vnước = 1:3,0 Vtinh dầu(ml) 1,5ml 3.2.2.3 Kết khảo sát nồng ñộ muối ăn NaCl: - Lá trầu non: nồng ñộ NaCl tối ưu 10% Vtinh dầu(ml) 1,2ml - Lá trầu già: nồng ñộ NaCl tối ưu 10% Vtinh dầu(ml) 1,5ml Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 13 3.2.2.4 Kết khảo sát thời gian chưng cất: tối ưu 3.2.3 Kết xác ñịnh hàm lượng tinh dầu 3.2.3.1 Kết xác ñịnh hàm lượng tinh dầu trầu non 1,2% 3.2.3.2 Kết xác ñịnh hàm lượng tinh dầu trầu già 1,5% 3.2.4 Kết xác ñịnh số hóa lý tinh dầu non già 3.2.4.1 Tỉ trọng: trầu non 0,8733 (g/ml); trầu già: 0,9110 (g/ml) 3.2.4.2 Kết số khúc xạ: trầu non 1,428; trầu già 1,471 3.2.4.3 Chỉ số axit (Ax): Lá trầu non 7,72; trầu già 8,31 3.2.4.4 Chỉ số este (Es): Lá trầu non 11,73; trầu già 12,91 3.2.4.5 Chỉ số xà phòng hóa: Lá trầu non 19,45; trầu già 21,22 3.2.5 Kết xác ñịnh thành phần hóa học tinh dầu trầu 3.2.5.1 Tinh dầu trầu non Thành phần hóa học tinh dầu trầu non ñược xác ñịnh phương pháp sắc ký GC/MS, có kết hình 3.2 Hình 3.2 Sắc ký ñồ GC tinh dầu non Nhận xét: Thành phần hóa học tinh dầu trầu non gồm 36 cấu tử có thành phần dẫn xuất phenol: phenol,2methoxy-4-propenyl-(26,55%);phenol,4-allyl-2-methoxy acetate(15,23%) 3.3.5.2 Tinh dầu trầu già Thành phần hóa học tinh dầu trầu già ñược xác ñịnh phương pháp sắc ký GC/MS, có kết hình 3.4 Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 14 Hình 3.4 Sắc ký ñồ GC tinh dầu trầu già Nhận xét: Thành phần hóa học tinh dầu trầu già gồm 42 cấu tử có thành phần dẫn xuất phenol: phenol,2methoxy-4-propenyl- (26,68%); phenol,4-allyl-2-methoxy, acetate (15,58%) Ngoài ra, có isocaryophyllene (6,88%); 4-allyl- 1,2diacetoxybenzene (7,75%) 3.2.5.3 So sánh thành phần hóa học tinh dầu trầu non trầu già Kết so sánh thành phần hóa học tinh dầu dầu trầu non tinh dầu trầu già ñược trình bày qua bảng 3.32 Bảng 3.32 Bảng so sánh thành phần hóa học hợp chất tinh dầu trầu non trầu già STT Hàm lượng % Hợp chất Lá non Lá già Phenol,2-methoxy-4-propenyl- 26,55 26,68 Isocaryophyllene 7,16 6,88 Germacrene D 5,47 4,89 Phenol,4-allyl-2-methoxy-,acetate 15,23 15,58 4-Allyl-1,2-diacetoxybenzene 7,15 7,75 Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 15 Nhận xét: Thành phần cấu tử tinh dầu trầu non trầu già gần giống nhau, tinh dầu trầu già có thành phần cao hơn, ñiều giải thích sau trình sinh trưởng phát triển hình thành nên ñiều kiện thí nghiệm 3.2.5.4 So sánh thành phần tinh dầu trầu huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam số vùng khác ñã công bố Việt Nam [13], [15], [16] Chúng tiến hành so sánh thành phần hóa học tinh dầu trầu Tiên Phước với số vùng khác ñã công bố Việt Nam Thành phần tinh dầu Tiên Phước (lá trầu non có 36 cấu tử, trầu già có 42 cấu tử), thành phần tinh dầu trầu huyện Hóc Môn Thành phố Hồ Chí Minh, có 51 cấu tử, thành phần tinh dầu trầu huyện Quế Sơn - Quảng Nam có 49 cấu tử thành phần cấu tử ñược trình bày bảng 3.33 Bảng 3.33 So sánh thành phần hóa học tinh dầu trầu non trầu già Tiên Phước với vùng khác Việt Nam Hàm lượng % TT Hợp chất Phenol,2-methoxy-4propenyl- I II III IV 26,55 26,68 26,93 25,78 Isocaryophyllene 7,16 6,88 7,78 6,07 Germacrene D 5,47 4,89 5,21 4,12 15,23 15,58 16,55 13,68 7,15 7,75 8,34 6,31 Phenol,4-allyl-2methoxy-,acetate 4-Allyl-1,2diacetoxybenzene Trong ñó: I (lá trầu non), II (lá trầu già), III (lá trầu Quế Sơn), IV (lá trầu Tp HCM) Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 16 Nhận xét: Đối chiếu thành phần hóa học tinh dầu trầu non trầu già Tiên Phước với số vùng miền khác ñã ñược nghiên cứu Việt Nam, rút số nhận ñịnh sau: Thành phần hóa học tinh dầu trầu Tiên Phước số vùng miền khác ñều có thành phần % cấu tử Phenol,2methoxy-4-propenyl- , chênh lệch không nhiều Bên cạnh ñó, tinh dầu thu ñược vùng miền khác theo công bố số lượng cấu tử tương ñối nhiều tinh dầu trầu Tiên Phước 3.2.6 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học tinh dầu Qua trình phân tích thành phần tinh dầu non già khác không nhiều Để tiết kiệm mặt thời gian kinh tế, ñó chọn mẫu tinh dầu trầu già ñể thử hoạt tính sinh học khảo sát thành phần chất có dịch chiết 3.2.6.1 Hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH Kết tinh dầu trầu hoạt tính chống oxi hóa hệ DPPH nồng ñộ < 256 µg/ml 3.2.6.2 Hoạt tính kháng sinh Kết tinh dầu trầu hoạt tính kháng chủng vi sinh vật nấm kiểm ñịnh nồng ñộ < 256 µg/ml 3.3 Kết nghiên cứu chiết tách số hợp chất trầu 3.3.1 Kết lựa chọn dung môi chiết 3.3.1.1 Bằng cảm quan Ngâm 20g bột trầu ñã xử lý thể tích (100ml) dung môi có ñộ phân cực tăng dần: n-hexane, chloroform, methanol, nước cất ngày ñêm, hình 3.6 Dịch chiết trầu với dung môi khác thu ñược sau ngày ñêm sau lọc có màu sắc hình 3.7 Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 17 Hình 3.6 Trầu ngâm dung môi Hình 3.7 Dịch chiết sau ngày Trong ñó: Mẫu A dịch chiết methanol; Mẫu B dịch chiết nước cất; Mẫu C dịch chiết chloroform; Mẫu D dịch chiết n-hexane Nhận xét: Dựa vào kết cảm quan, lựa chọn methanol làm dung môi ñể chiết tách hợp chất hữu trầu 3.3.1.2 Bằng phương pháp ño khối lượng: Tổng chất rắn hòa tan dung môi methanol lớn Điều chứng tỏ thành phần trầu phần lớn chất phân cực Từ kết chọn dung môi methanol làm dung môi tốt cho trình chiết 3.3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng thể tích dung môi ñến hiệu suất trình chiết tách (tỉ lệ rắn – lỏng) Dựa vào việc quan sát màu sắc dịch chiết kết hợp phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS ño ñộ hấp thụ quang Kết quả, ứng với khối lượng bột trầu 10,001g chiết 100ml dung môi methanol ño ñược mật ñộ quang lớn Nhận xét: Phổ hấp thụ UV-VIS mẫu chiết methanol ñược trình bày hình 3.9 Từ phổ hấp thụ cho thấy bước sóng hấp thụ cực ñại λmax = 288 nm Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 18 Hình 3.9 Phổ hấp thụ dịch chiết với tỉ lệ R/L khác Ký hiệu: Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu số ứng với mật ñộ quang lớn 2,564 Như vậy, tỉ lệ R/L = 1/10 tỉ lệ tốt ñể chiết phòng thí nghiệm 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết ñến hiệu suất chiết Dựa vào việc quan sát màu sắc dịch chiết kết hợp phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS ño ñộ hấp thụ quang Phổ hấp thụ UV-VIS mẫu chiết methanol cho thấy bước sóng hấp thụ cực ñại λmax = 288 nm, ñược trình bày hình 3.10 Hình 3.10 Phổ hấp thụ dịch chiết với thời gian chiết Ký hiệu: Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 19 Mẫu số ứng với mật ñộ quang lớn 2,859 Vậy thời gian chiết thích hợp 3.3.4 Xác ñịnh thành phần cấu tạo cấu tử dịch chiết 3.3.4.1 Thành phần cấu tạo chất dịch chiết MeOH Kết cho thấy hình 3.11 Hình 3.11 Sắc ký ñồ GC dịch chiết MeOH Nhận xét: Thành phần hóa học trầu dung môi MeOH gồm 12 cấu tử có thành phần dẫn xuất phenol: 2,6-Dimethylbenzoic acid (40,70%); 4-allyl-1,2-diacetoxybenzene (24,30%) Ngoài ra, số thành phần khác có hàm lượng lớn như: Phenol,2-methoxy-4-propenyl- (12,42%); Phenol,2allyl-2-methoxy-acetate (10,51%) 3.3.4.2 Thành phần cấu tạo chất dung môi n-hexane Kết cho thấy hình 3.12 Hình 3.12 Sắc ký ñồ GC dịch chiết n-hexane Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 20 Nhận xét: Thành phần hóa học trầu dung môi nhexane gồm 39 cấu tử có thành phần dẫn xuất phenol: 4-allyl-1,2-diacetoxybenzene (23,68%) Ngoài ra, số thành phần khác có hàm lượng lớn như: Phenol,2-methoxy-4propenyl- (10,72%); Phenol,4-allyl-2-methoxy-acetate (19,53%) 3.3.4.3 Thành phần cấu tạo chất dung môi CHCl3 Sắc kí ñồ GC dịch chiết trầu dung môi chloroform ñược trình bày hình 3.13 Hình 3.13 Sắc ký ñồ GC dịch chiết chloroform Nhận xét: Trong dung môi chloroform gồm 24 cấu tử có thành phần là: Phenol,2-methoxy-4-propenyl- (32,41%) 3.3.4.4 So sánh chất có hàm lượng cao dung môi Từ kết phân tích ñược dịch chiết trên, so sánh số chất có hàm lượng cao dung môi trên, kết ñược trình bày bảng 3.46 Bảng 3.46 So sánh số chất có hàm lượng cao dung môi TT Hợp chất MeOH Hexane CHCl3 Phenol,2-methoxy-4-propenyl- 12,42% 10,72% 32,41% 2,6-Dimethylbenzoic acid 40,70% Phenol,4-allyl-2-methoxy-acetate 10,51% 19,53% - 4-allyl-1,2-diacetoxybenzene 24,30% 23,68% - Footer Page 20 of 126 - - Header Page 21 of 126 21 Nhận xét: Trong dịch chiết thu ñược, dịch chiết chứa số lượng cấu tử khác với hàm lượng không giống Cả dịch chiết ñều thu ñược cấu tử Phenol,2-methoxy-4-propenyl- hàm lượng không giống 3.3.5 Xác ñịnh thành phần công thức cấu tạo số hợp chất dịch chiết etyl axetat [13], [15], [16], [19], [21], [22] Sau tiến hành tách chất dung môi có ñộ phân cực khác từ dịch cô M theo sơ ñồ hình 2.9, ta ñược dịch chiết etyl axetat tinh khiết Đem cô ñuổi dung môi, hút 2ml mẫu thổi khô, ñịnh mức lại etyl axetat, pha loãng, tiếp tục lọc áp suất thấp giấy lọc 0,45µm (giấy lọc băng xanh) ñược phân tích thiết bị sắc ký lỏng - khối phổ liên hợp (LC/MS) Agilent Sắc ký ñồ LC cao etyl axetat ñược thể qua hình 3.14 Hình 3.14 Sắc ký ñồ LC cao etyl axetat Nhận xét: Thành phần hoá học cấu tử dịch chiết etyl axetat sau ñược phân lập dung môi, ño LC/MS hai lần MS có 11 cấu tử thành phần cấu tử ñược trình bày bảng 3.48, sau: Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 22 Bảng 3.48 Thành phần cấu tử dịch etyl axetat T RT T (ph) 3,74 CTPT C18H32O2 M=280 Tên gọi acid(9Z,12Z)-octadeca-9,12dienoic % 15,98 Có thể chất sau 5,79 C18H18O6 ñây: 4,2′′-dihydroxy-4′′,5′′,6′′- C17H14O7 trimethoxychalcone hoặc: M=330 27,13 3,5,4’-trihydroxy-3’,7dimetoxyflavon 7,44 10,62 M=335 C21H34O2 M=318 chưa ñịnh danh Axit 2-(2,6-ñicloanilino) phenylaxetit 16,87 15,99 Nhận xét: Thành phần chất dịch etyl axetat cấu tử có hàm lượng lớn 27,13%, tương ứng với thời gian lưu 5,79 Đối với chất có hàm lượng lớn tiến hành tìm công thức cấu tạo dựa phổ khối MS thu ñược với giúp ñỡ phần mềm ChemSketch tài liệu tham khảo Sau qua hệ thống LC/MS (2 lần MS) khoảng khối lượng từ 100 - 450, với thời gian lưu (RT) từ 5,58 - 6,20 tương ứng với pic có m/z = 331,2 Cho kết xuất pic tương ñối lớn có khối lượng 331,2; 317,3; 211,2; 166,9 122,4 Trong ñó pic 331,2 ion phân tử hay pic gốc [M+H]+ ñược nhận diện là: Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 23 * 4,2′-dihydroxy-4′,5′,6′-trimethoxychalcone, C18H18O6 (M=330), có cấu tạo sau: OH OH H CO H CO OCH O * 3,5,4’-trihydroxy-3’,7- dimetoxyflavon: C17H14O7 (M=330), có cấu tạo sau: OCH OH H CO O OH OH O Các pic lại ñáng lưu ý 211,2 166,9 ñó ion mảnh chủ yếu bắn phá ion phân tử ñược máy ghi lại Dựa vào công thức cấu tạo chất trên, với hỗ trợ phần mềm ChemSketch, cho chế phân mảnh ñược giải thích hình 3.16 Với phổ khối hình 3.15 sơ ñồ phân mảnh hình 3.16, cho thấy phân mảnh [M+H]+ m/z = 331,2 theo hướng: - Hướng 1: [M+H]+ ( 331,2) → [A]+ (221,2) - Hướng 2: [M+H]+ ( 331,2) → [B]+ (167) Từ lập luận kết nhận ñược phổ ñồ ñã bước ñầu xác ñịnh ñược hợp chất có thời gian lưu 5,79 có [M+H]+ = 331 4,2′-dihydroxy-4′,5′,6′-trimethoxychalcone, CTPT: C18H18O6 (M = 330) sơ ñồ phân mảnh giải thích hình 3.16, ñây Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 Molecular Formula 24 = C 18H18 O6 OH OH m/z = 331.117066 Formula W eight [M] = 330.33192 OH H CO +H + O H CO + H2 (1) C 8H 7O 1 9 D a H CO H CO OCH +H + O H 2O D a (2) H CO OH C 10H 12O 2 D a O + OH H CO m/z = 331.117066 (2) OCH OH2 C 9H 6O 4 D a H CO OCH H CO O C OCH C 9H 11O 7 D a Molecular Formula Formula W eight [A] + O = C 10 H11O5 = 211.19134 H CO C H CO + Formula Weight [B]= 167.1812914 OCH Hình 3.16 Sơ ñồ phân mảnh ion phân tử [M+H]+ có m/z = 331 3.4 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết 3.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH Mẫu hoạt tính chống oxi hóa hệ DPPH nồng ñộ < 256 µg/ml 3.4.2 Hoạt tính kháng sinh Mẫu hoạt tính kháng chủng vi sinh vật nấm kiểm ñịnh nồng ñộ < 256 µg/ml KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu, ñã thu ñược số kết sau: a Kết xác ñịnh ñộ ẩm, hàm lượng tro vô cơ, hàm lượng kim loại nặng, hàm lượng tinh dầu trầu Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 25 - Độ ẩm (lá trầu non 85,4%, trầu già 82,8%), hàm lượng tro vô (lá trầu non 13,3%, trầu già 15,1%), hàm lượng tinh dầu (lá trầu non 1,2%, trầu già 1,5%) - Hàm lượng kim loại nặng Hg, As, Pb, Cu trầu nằm giới hạn cho phép sử dụng Bộ y tế b Kết khảo sát ñiều kiện tối ưu ñể chiết tách tinh dầu hợp chất trầu dung môi MeOH - Điều kiện tối ưu ñể chiết tách tinh dầu trầu Tỉ lệ nguyên liệu rắn : nước cất 1: thời gian chiết - Điều kiện tối ưu ñể chiết hợp chất trầu dung môi MeOH Tỉ lệ nguyên liệu rắn : dung môi lỏng 1:10 thời gian chiết c Kết xác ñịnh số số vật lý, hóa học thành phần cấu tử tinh dầu trầu sau - Tỉ trọng (lá non 0,8733g/ml già 0,9110g/ml), số khúc xạ (lá non 1,428 già 1,471), số axit (lá non 7,72 già 8,31), số este (lá non 11,73 già 12,91), số xà phòng hóa (lá non 19,45 già 21,22) - Thành phần cấu tử tinh dầu trầu chủ yếu phenol,2methoxy-4-propenyl (lá non 26,55% già 26,68%); phenol,4-allyl-2-methoxy-acetate (lá non 15,23% già 15,58%); isocaryophyllene (lá non 7,16% già 6,88%) 4allyl-1,2diacetoxybenzene (lá non 7,15% già 7,75%) d Kết cấu tử dịch chiết trầu, phương pháp sắc ký GC/MS LC/MS - Thành phần cấu tử dịch chiết MeOH ñã ñịnh danh ñược 12 cấu tử, ñó chiếm % cao 2,6-dimethylbenzoic acid (40,70%) Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 26 - Thành phần cấu tử dịch chiết n-hexane ñã ñịnh danh ñược 39 cấu tử, ñó chiếm % cao 4-allyl-1,2diacetoxybenzene (23,68%) - Thành phần cấu tử dịch chiết chloroform ñã ñịnh danh ñược 24 cấu tử, ñó chiếm % cao phenol,2- methoxy-4propenyl (32,41%) - Thành phần cấu tử dịch cao etyl axetat ñược phân tích phương pháp LC/MS thể thời gian lưu, tương ứng với ñơn cấu tử, ñó cấu tử có hàm lượng lớn (27,13%) ứng với thời gian lưu 5,79 khẳng ñịnh 4,2′-dihydroxy-4′,5′,6′trimethoxychalcone - Bước ñầu dự ñoán ñược công thức cấu tạo hợp chất có dịch cao etyl axetat là: 4,2′-dihydroxy-4′,5′,6′-trimethoxychalcone, có công thức phân tử C18H18O6 (M = 330) e Kết khảo sát thử hoạt tính sinh học: Tinh dầu dịch chiết trầu dung môi n-hexane ñều hoạt tính kháng chủng vi sinh vật nấm kiểm ñịnh nồng ñộ < 256 µg/ml KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc ký cột ñể tách ñược cấu tử tinh khiết từ tinh dầu dịch chiết trầu, ño cộng hưởng từ hạt nhân ñể xác ñịnh cấu trúc hợp chất Làm giàu cấu tử thử hoạt tính sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng Có thể nghiên cứu theo hướng mở rộng ñể xác ñịnh thành phần chất có thân, rể hoa trầu, so sánh với thành phần chất có trầu Từ ñó, lựa chọn ñược nguồn nguyên liệu tối ưu ñể tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học phục vụ cho y học Footer Page 26 of 126 ... hóa học từ tinh dầu dịch chiết trầu - Xác ñịnh thành phần hóa học, công thức cấu tạo số hợp chất tinh dầu dịch chiết - So sánh số thành phần hóa học tinh dầu, dịch chiết trầu Tiên Phước với trầu. .. sánh thành phần hóa học tinh dầu trầu non trầu già Kết so sánh thành phần hóa học tinh dầu dầu trầu non tinh dầu trầu già ñược trình bày qua bảng 3.32 Bảng 3.32 Bảng so sánh thành phần hóa học. .. phòng hóa: Lá trầu non 19,45; trầu già 21,22 3.2.5 Kết xác ñịnh thành phần hóa học tinh dầu trầu 3.2.5.1 Tinh dầu trầu non Thành phần hóa học tinh dầu trầu non ñược xác ñịnh phương pháp sắc ký