Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGÔ VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN ANCALOIT TRONG HẠT CAU LÙN Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - 2011 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG Phản biện 1: PGS.TS Phạm Văn Hai Phản biện 2: PGS.TS Lê Thị Liên Thanh Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ hóa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 25 tháng năm 2011 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Lí chọn ñề tài Với phát triển không ngừng khoa học kỹ thuật, người ñã ñạt ñược nhiều thành tựu to lớn lĩnh vực ñời sống Trong ñó có ý nghĩa quan trọng lĩnh vực y học Xã hội ngày phát triển kéo theo phát sinh bệnh tật ñe dọa ñến tính mạng người Khoa học ñã góp phần lớn việc ngăn chặn, hạn chế chí loại bỏ bệnh tật cho người Con người ñã nghiên cứu, tổng hợp ñược nhiều hợp chất chữa bệnh, ức chế tiêu diệt loại vi khuẩn thâm nhập vào thể, giúp cho việc ñiều chỉnh số chức tế bào Tuy nhiên hợp chất tổng thường có tác dụng phụ như: gây dị ứng, gây buồn ngủ… Vì hạn chế mà làm cho chúng không hoàn toàn chiếm ưu thị trường Ngày nay, người ñã ngày quan tâm nhiều ñến hợp chất có tự nhiên hơn, tính ưu việc quy ñịnh như: không ñộc hại, ñược thể hấp thụ không ñể lại tác dụng phụ, phổ biến tự nhiên…Do ñó, việc nghiên cứu hợp chất thiên nhiên có tính kháng khuẩn, kháng sinh, chất mang hoạt tính sinh học ñã ñang vấn ñề quan tâm toàn xã hội Đã người Việt Nam, chắn không ñến cau Cau ñược trồng nhiều khu vực nhiệt ñới gió mùa Việt Nam, Ấn Độ, Thái Lan, Đài Loan Quả cau thường ñược kết hợp với trầu, vôi sử dụng làm nhai vui miệng thân quen với người dân Việt Nó nét ñẹp văn hóa người Việt Nam Miếng trầu có tác dụng gây hưng phấn, tăng thân nhiệt thể nhuộm màu ñỏ cho môi ñẹp, giúp ngăn ngừa bệnh miệng [17] Trên giới cau ñã ñược kết hợp số nguyên liệu thiên nhiên khác tạo chất kháng oxi hóa dùng làm mỹ phẩm, làm thuốc chống bệnh trầm cảm, bệnh cao huyết áp Cau ñược chế biến thành cháo trị chứng bệnh trẻ em[16] Các công chủ yếu dựa vào tác dụng ancaloit có hạt cau Nhiều người trồng cau ñể tạo cảnh quan cho khu vườn nhà, vừa có thêm thu nhập cho gia ñình Đặc biệt cau lùn, cau lùn ñặc biệt, ñốt 1cm, nên trồng 20 năm cao khoảng 2m, màu xanh mướt, hoa thơm lạ kì [28], loại cau mà trồng trang trí trước nhà tốt vừa có giá trị kinh tế cao, vừa làm cảnh ñẹp Hơn nữa, thân cau lùn lại thấp thu hoạch tiện ñỡ vất vã phải leo trèo cau thông thường Footer Page of 126 Header Page of 126 Cau lùn có nhiều ứng dụng quan trọng thực tế công trình nghiên cứu trước ñây trình chiết, tách hay xác ñịnh thành phần hoá học, cấu trúc hợp chất hạt cau chưa hệ thống Với mong muốn tìm hiểu hạt cau lùn nhằm làm sáng tỏ công dụng nó, ñã chọn ñề tài “Nghiên cứu chiết tách, xác ñịnh thành phần Ancaloit hạt cau lùn” Đối tượng nghiên cứu Hạt cau lùn nghiên cứu ñược lấy từ cau lùn thôn Quan Nam, xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng Mục ñích nghiên cứu - Nghiên cứu trình chiết tách hợp chất ancaloit từ hạt cau lùn - Xác ñịnh thành phần hóa học, công thức cấu tạo số ancaloit Phương pháp nghiên cứu Để thực ñề tài này, sử dụng phương pháp nghiên cứu sau: 4.1 Nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu, sách báo nước có liên quan ñến ñề tài - Hội thảo, trao ñổi kinh nghiệm với chuyên gia, thầy cô giáo ñồng nghiệp 4.2 Phương pháp thực nghiệm - Phương pháp lấy mẫu, thu hái xử lý mẫu - Xác ñịnh ñộ ẩm phương pháp trọng lượng - Xác ñịnh hàm lượng hữu phương pháp tro hoá mẫu - Xác ñịnh hàm lượng kim loại phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) - Chiết phương pháp soxhlet - Khảo sát ñiều kiện chiết thích hợp Footer Page of 126 Header Page of 126 - Xác ñịnh thành phần hợp chất dịch chiết từ hạt cau lùn dung môi chiết phương pháp sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ (LC-MS) - Phân lập dịch chiết, tách số cấu tử sắc ký cột (CC) lặp lại silicagel pha thường pha ñảo - Xác ñịnh cấu trúc phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân - Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học - Cung cấp thông tin khoa học quy trình chiết tách, xác ñịnh thành phần hóa học số ancaloit hạt cau Đà Nẵng - Cung cấp thông tin, tư liệu làm sở cho việc nghiên cứu sau 5.2 Ý nghĩa thực tiễn - Nhằm giúp cho việc ứng dụng hạt cau phạm vi rộng cách khoa học - Giải thích cách khoa học số kinh nghiệm dân gian ứng dụng hạt cau - Tổng hợp kiến thức hợp chất thiên nhiên ñể giảng dạy môn hóa nhà trường phổ thông ñược tốt Cấu trúc luận văn : Ngoài phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục luận văn gồm chương sau : Chương : TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Chương : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chương : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 GIỚI THIỆU CÂY CAU 1.1.1 Đặc tính sinh thái 1.1.1.1 Tên gọi [2] Tên thường gọi : Cây Cau, Mạy làng (Tày), Pơ lạng (K’ho)… Tên khác : Aréquier (Pháp), Arecanut (Anh), Tân lang hay Binh lang (Trung Quốc), Pinang (Malaysia) Tên khoa học : Areca catechu L 1.1.1.2 Phân loại khoa học [12] Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Bộ : Arecales Họ : Arecaceae (cau) hay họ Palmae (Dừa) Chi : Areca.L Loài : A.catechu 1.1.1.3 Phân bố - Cây cau ñược trồng nhiều nơi, khắp vùng Châu Á, phía ñông bao trùm Thái Bình Dương ñến ñảo cạnh Châu Úc, phía tây vượt Ấn Độ ñến bờ biển Châu Phi, phía bắc lấn tràn Miến Điện miền nam Trung Quốc, phía nam chiếm toàn Đông Nam Á với quần ñảo Nam Dương Cau trồng nhiều vùng nhiệt ñới Ấn Độ, Malaysia, Đài Loan, Việt Nam nhiều nước châu Á khác [21] - Cau trồng ñược khắp tỉnh thành toàn quốc, trồng nhiều Thanh Hóa, Nghệ An, An Lão - Bình Định, Tiên Phước - Quảng Nam, Cao Nhân - Hải Phòng 1.1.2 Đặc tính thực vật Cây cau sống lâu năm Thân mọc thẳng, không chia cành, có nhiều ñốt vết cũ rụng Lá tập trung ngọn, cuống phát triển thành bẹ to ôm lấy thân, phiến to, rộng, xẻ lông chim Hoa tự mọc thành buồng, có mo bao bọc, hoa ñực trên, hoa Hoa ñực nhỏ màu trắng, thơm, màu lục Hoa to, bao hoa không phân hoá Quả hạch hình trứng, lúc non có màu xanh, vỏ bóng nhẵn, già có màu vàng, vàng cam ñỏ (hình 1.1) Hạt có nội nhủ xếp Hạt hình nón cụt, ñầu tròn ñáy lõm, màu nâu nhạt, vị chát [27] Cau có hai loại chính: cau rừng cau nhà Footer Page of 126 Header Page of 126 Hiện nay, Việt Nam có trồng giống cau nhập từ Đài Loan ñó cau lùn, cao khoảng ÷ 3m, trái quanh năm (cau tứ thời) Cau lùn cho suất cao, non có màu xanh chín có màu ñỏ (hình 1.2) Đặc ñiểm cau lùn: Cau lùn thân gỗ có ñốt, ñường kính từ 15cm ñến 20cm, ñốt lóng cao 30cm, gốc thân phình rộng, mang nhiều rễ Lá mọc tập trung ñầu cành, kép lông chim, có bẹ lớn ôm thân gọi mo, phụ dạng dải màu xanh bóng (hình 1.3) Cây trồng từ bốn ñến năm năm bắt ñầu nở hoa, cụm hoa ñơn tính gốc Hoa ñực màu trắng nhỏ có mùi thơm, hoa lớn màu xanh nở hoa quanh năm có khả ñậu cao Quả hinh trứng thuôn hai ñầu, non màu lục, chín màu vàng 1.1.3 Thành phần hóa học hạt cau - Tannin catechin tỷ lệ hạt non khoảng 70% hạt già 15÷20% - Hoạt chất ancoloit tỉ lệ 2,38mg/g: chủ yếu Arecolin: C8H13NO2, Arecain : C7H11NO2, lượng nhỏ Guvacin: C6H9NO2, Guvacolin: C7H11NO2 - Mỡ béo 14%: laurin, olein, myristin - Glucid 50%, Saccharin ñược xác ñịnh cau dạng muối natri - Ngoài (lauric, myristic, palmitic, stearic, phtalic axit) hạt cau chứa ñựng amin axit: tryptophan, methinonin, 15%pirolin, 10% tyrosin, phenylalanin arginin, muối vô 5%, ñường 2%, muối vô số sắc tố ñỏ Axit Galic, tinh dầu gôm, lượng nhỏ tinh dầu dễ bay hơi, li nhin (lignin) 1.2 ANCALOIT 1.2.1 Khái niệm Theo Polonopski: "Ancaloit hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, ña số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp thực vật ñôi ñộng vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh cho phản ứng hóa học với số thuốc thử gọi thuốc thử chung ancaloit” 1.2.2 Danh pháp Các ancaloit thường có cấu tạo phức tạp, người ta thường gọi tên theo danh pháp thông thường Tên ancaloit có ñuôi in xuất phát từ: Tên chi tên loài + in [6] Footer Page of 126 Header Page of 126 1.2.3 Phân bố ancaloit 1.2.4 Cấu trúc phân loại ancaloit Đến ñã biết 16.000 ancaloit thiên nhiên với 300 dạng cấu trúc Việc phân loại chủ yếu dựa vào cấu trúc nhân dựa vào nguồn gốc tạo ancaloit 1.2.5 Một số ancaloit hạt cau [27] Theo kết nghiên cứu trước ñây, hoạt chất hạt cau gồm: arecolin, arecaidin, guvacolin, guvaxin (bảng 1.2) Đây ancaloit có nhân piridin piperidin 1.2.6 Tính chất chung ancaloit 1.2.6.1 Lý tính - Trạng thái tự nhiên: Phần lớn ancaloit công thức cấu tạo có oxi thường thể rắn nhiệt ñộ thường morophin (C17H19NO3), codein (C18H21NO3)… Những ancaloit công thức cấu tạo oxi thường thể lỏng coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2)… Các ancaloit thể rắn thường kết tinh ñược có ñiểm nóng chảy rõ ràng - Mùi vị: Đa số ancaloit mùi, có vị ñắng số có vị cay capsaicin, piperin… - Màu sắc: Hầu hết ancaloit ñều không màu trừ vài ancaloit có màu vàng berberin, palmatin, chelidonin - Độ tan: Hầu hết ancaloit dạng bazơ thường không tan nước tan dung môi hữu clorofom, ete, benzen ancol bậc có số C nhỏ CH3OH, C2H5OH Một số ancaloit có thêm nhóm phân cực nên tan phần nước kiềm Ví dụ: mocphin, cephalin có nhóm -OH phenol nên tan dung dịch kiềm bazơ chúng gần không tan ete 1.2.6.2 Hóa tính Tính bazơ: Ancaloit bazơ yếu, có mặt nguyên tử N Nhưng ñộ kiềm ancaloit không giống ảnh hưởng lớp ñiện tích nguyên tử N gây ảnh hưởng nhóm chức khác Nói chung tính bazơ giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amin bậc 1, amin bậc 2, amin bậc Với ancaloit có tính bazơ yếu cần môi trường axit mạnh ñể tạo thành muối dung dịch nước Vì môi trường axit yếu số ancaloit bazơ mạnh chuyển thành muối bazơ yếu tồn dung dịch dạng bazơ Đặc tính ñược ứng dụng việc tách nhóm ancaloit có trị số pKb khác khỏi hỗn hợp chúng (bảng 1.3) Dựa vào pKb người ta xếp ñộ kiềm ancaloit sau: Footer Page of 126 Header Page of 126 + Ancaloit có ñộ kiềm mạnh giá trị pKb < + Ancaloit có ñộ kiềm trung bình pKb : ÷ + Ancaloit có ñộ kiềm yếu pKb : ÷ 10 + Ancaloit có ñộ kiềm yếu pKb : 10 ÷ 12 Ngoại lệ: Ancaloit không tính kiềm ricinin, colchicin, có chất có phản ứng axit yếu arecaidin, guvacin Tác dụng với axit, ancaloit tạo muối tương ứng Ancaloit kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pb…) tạo muối phức Các ancaloit có phản ứng với số thuốc thử chung 1.2.6.3 Sinh tổng hợp ancaloit [3] Sinh tổng hợp ancaloit ñã ñược Vinterstein Trier chứng minh vào năm 1931 Ông cho rằng, ancaloit dẫn xuất axit amin Sau người ta sử dụng axit amin có gắn ñồng vị phóng xạ (14C, 15N) ñã chứng minh hầu hết khung ancaloit ñều ancaloit kết hợp với số gốc axetat, hemi monotecpin tạo 1.2.7 Chiết tách ancaloit 1.2.7.1 Nguyên tắc lựa chọn dung môi Theo quy tắc chọn dung môi, dung môi chiết phải có ñộ phân cực phù hợp với tính bazơ ancaloit Cụ thể, ancaloit bazơ yếu, dùng dung môi có ñộ phân cực yếu, ancaloit bazơ trung bình, mạnh dùng dung môi có ñộ phân cực trung bình hay mạnh Đối với ancaloit chưa biết bắt ñầu thăm dò từ dung môi phân cực ñến dung môi phân cực mạnh Để vết ancaloit di chuyển cao tách phù hợp thêm vào dung môi chất kiềm Trong cây, ancaloit thường không tồn dạng tự do có khả kết hợp với tanin (nhất có nhiều tanin) tạo thành muối Vì vậy, ñối với dược liệu có nhiều tanin, cần tẩm bột dược liệu kiềm thời gian ñể chuyển ancaloit thành dạng bazơ tự trước chiết Cần dùng dung môi có ñộ phân cực mạnh chiết nóng ñể tách ancaloit khỏi tanin hoà tan vào dung môi 1.2.7.2 Chiết tách ancaloit Việc chiết xuất ancaloit dựa vào tính chất Hầu hết ancaloit dạng bazơ tan ñược dung môi hữu phân cực, không tan nước Ngược lại, dạng muối, ancaloit tan nước etanol không tan dung môi hữu phân cực Mặt khác, tùy thuộc vào khả hóa hơi, khả chịu nhiệt ancaloit mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Có cách ñể chiết xuất ancaloit: chiết dung môi hữu chiết dung dịch nước axit ancol Phương pháp 1: Chiết dung môi hữu Để chiết ancaloit dung môi hữu cơ, trước hết bột dược liệu phải ñược tẩm dung dịch bazơ ñể chuyển ancaloit muối dược liệu thành dạng bazơ Bazơ thường dùng dung dịch NH3, Ca(OH)2, Na2CO3, NaOH Dung môi dùng clorofom, ete, benzen, etyl clorua Clorofom dung môi thích hợp cho hầu hết ancaloit bazơ (trừ ancaloit N bậc N-oxit có cách xử lí riêng) Phương pháp 2: Chiết dung dịch axit hay axit loãng ancol Khác với phương pháp trên, phương pháp sử dụng dung dịch axit vô hay hữu kết hợp với rượu ñể chiết ancaloit dạng muối hoà tan Chiết axit Dịch chiết trung hòa axit, cô cạn, hòa tan cặn axit, loại tạp, kiềm hoá chiết lại dung môi hữu cơ, bốc dung môi, hòa cặn clorofom ñể chấm sắc ký Cách chiết loại ñược nhiều tạp dùng natri hydrocarbonat ñể kiềm hoá chiết ñược ancaloit có chứa phenol Chiết dung dịch axit loãng ancol Thu dịch chiết dược liệu dung môi ancol - axit Bốc dung môi, lắc dịch chiết ñậm ñặc với dung môi hữu (ete, clorofom) ñể loại tạp Kiềm hoá dung dịch nước axit chiết dung môi hữu cơ, bốc dung môi thu ñược cặn ancaloit thô Với cách chiết này, ancaloit không bị dịch chiết lẫn nhiều tạp 1.2.7.3 Thuốc thử phát ancaloit - Các thuốc thử thông thường tạo kết tủa với ancaloit : + Thuốc thử Dragendorff tạo kết tủa vàng da cam ñến ñỏ với ancaloit + Thuốc thử Mayer tạo kết tủa màu trắng vàng cam với ancaloit + Thuốc thử Wagner (Bouchardat) tạo kết tủa vàng nâu với ancaloit - Các thuốc thử thông thường tạo màu với ancaloit : + Dung dịch H2SO4 ñậm ñặc (D = 1,84 g/ml) + Dung dịch HNO3 ñậm ñặc (D = 1,4 g/ml) [15] Footer Page 10 of 126 Header Page 11 of 126 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU Chúng chọn cau từ cau lùn ñược lấy thôn Quan Nam , xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng Cây cau ñược hái cao m, ñường kính thân khoảng 14 cm, có bẹ to dài khoảng 1,5 m, hình lông chim Hoa cau có mùi thơm ngọt, nhỏ, màu trắng ngà, nở rộ vào tháng năm Quả hạch hình trứng, to gần trứng gà, lúc non xanh, vỏ bóng nhẵn, già có màu vàng 2.2 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 2.2.1 Hoá chất Để thực ñề tài sử dụng số hoá chất sau: CHCl3, dung dịch C2H5OH 96%, dung dịch NH3 27%, axit H2SO4 98%, ete-dầu, dung dịch HCl 36,5% Thuốc thử Dragendorff, Mayer, Wagner (Bouchardat)… 2.2.2 Thiết bị thí nghiệm Bộ chiết soxhlet, chưng cất, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Perkin Elmer, máy ño sắc kí lỏng kết hợp với khối phổ LC-MS , máy ño sắc kí khí ghép phổ GC-MS Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp ñiện, cốc sứ, loại pipet, bình ñịnh mức, bình hút ẩm… 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Lấy mẫu xử lí mẫu Cây cau ñược chọn, bẽ lấy buồng, buồng trái chín vàng buồng trái xanh (vừa ăn) Buồng cau sau bẽ, hái lấy trái, chẻ ñôi, lấy hạt, phơi khô tự nhiên khoảng nắng gắt, sấy ñến 1000C, nghiền thành bột, bảo quản bình hút ẩm ñể nghiên cứu 2.3.2 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng khô hạt cau Để xác ñịnh hàm lượng mẫu khô hạt cau, sử dụng phương pháp trọng lượng 2.3.3 Thu ñịnh lượng ancaloit hạt cau Ancaloit ñược chiết kiệt phương pháp chiết nóng soxhlet dung môi CHCl3 ngâm kiệt ancol - axit (phần bã sau chiết CHCl3) Định lượng ancaloit thô phương pháp trọng lượng 2.3.4 Xác ñịnh số số vật lí 2.3.4.1 Độ ẩm, hàm lượng hữu Footer Page 11 of 126 Header Page 12 of 126 2.3.4.2 Xác ñịnh hàm lượng kim loại Dùng phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử ñể xác ñịnh hàm lượng kim loại: Pb, Cu, Zn, Fe, Hg, Cd, Cr, As hạt cau 2.3.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng ñến trình chiết ñiều kiện chiết tối ưu Chúng tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng ñến trình chiết như: dung môi chiết, tạp chất, tỉ lệ thể tích dung môi khối lượng nguyên liệu chiết, thời gian, pH Sử dụng phương pháp so màu phương pháp trọng lượng ñể tối ưu yếu tố ảnh hưởng ñến trình chiết 2.3.5.1 Chọn dung môi 2.3.5.2 Ảnh hưởng tạp chất 2.3.5.3 Tối ưu ñiều kiện chiết Sau chọn ñược dung môi thích hợp, nghiên cứu ảnh hưởng tạp chất, tiến hành chiết tách ancaloit từ hạt cau CHCl3 phương pháp chiết nóng soxhlet Khảo sát thời gian chiết, thể tích dung môi, pH chiết ñể thu ñược hàm lượng ancaloit cao Điều kiện chiết tối ưu ñiều kiện mà ñó lượng sản phẩm chiết nhiều kết tủa vàng nâu thu ñược ñậm − Khảo sát hàm lượng ancaloit theo thời gian chiết nóng soxhlet − Khảo sát lượng sản phẩm chiết theo tỉ lệ dung môi nguyên liệu − Khảo sát ảnh hưởng pH ñến hiệu suất chiết ancaloit 2.3.6 Các phương pháp quang phổ Sử dụng phương pháp phân tích LC-MS GC-MS ñể phân tách xác ñịnh thành phần ñịnh tính, ñịnh lượng dịch chiết hạt cau 2.3.7 Phương pháp thử hoạt tính sinh học khả chống oxi hóa Chúng tiến thử hoạt tính sinh học khả chống oxi hóa ancaloit Viện Hóa học - Hà Nội Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 2.4 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Hạt cau, thu, xử lí Xác ñịnh ñộ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại BỘT CAU KHÔ Loại tạp ete - dầu Bột cau khô tẩm NH3 6N Chiết nóng bột hạt cau CHCl3, Bã rắn: Ngâm kiệt ancolaxit ngày ñêm Dịch chiết: Chưng cất, thu cặn 1.Tối ưu thời gian chiết, tỉ lệ R/L, pH chiết Chạy LC-MS; GC-MS Dịch chiết: trung hòa, ñuổi dm 1/3, ñể yên ngày ñêm, lọc loại tạp chất Dịch thu ñược chiết CHCl3 (pH từ ñến 12) Lắc cặn với nước axit H2SO4 1% Dịch axit kiềm hóa pH=11 chiết CHCl3 Dịch chiết ancaloit/CHCl3 Loại nước Na2SO4 khan Đuổi dung môi, thu cặn Chạy GC-MS Footer Page 13 of 126 Ancaloit toàn phần Thử hoạt tính sinh học, khả chống oxi hóa Header Page 14 of 126 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THU VÀ XỬ LÍ MẪU Chúng chọn cau có buồng (1 buồng ñã chín buồng xanh), lựa trái to ñều nhau, chẽ ñôi, bóc lấy phần hạt trong, phơi khô tự nhiên, sấy, giã mịn thành bột ñể nghiên cứu 3.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ VẬT LÝ 3.2.1 Độ ẩm: Kết khảo sát ñộ ẩm hạt cau già hạt cau xanh ñược trình bày qua bảng 3.1 bảng 3.2 Bảng 3.1 Kết khảo sát ñộ ẩm hạt cau già STT m1(g) m2(g) m3(g) W (%) Wtb (%) 30,015 5,005 32,063 59,080 32,356 5,020 34,416 58,964 27,630 5,041 29,801 56,933 57,067 29,974 5,089 32,201 56,238 29,571 5,057 31,891 54,122 Bảng 3.2 Kết khảo sát ñộ ẩm hạt cau xanh Kết quả: Độ ẩm hạt cau già 57,067% Nhận xét: Cau xanh cau già ñều có ñộ ẩm cao, ñó ñộ ẩm cau xanh cao nhiều so với cau già Trong trình nghiên cứu, không bảo quản cẩn thận, hạt cau dễ bị mốc ảnh hưởng ñến kết phân tích Cần phơi (hoặc sấy) khô hạt cau bảo quản bình hút ẩm 3.2.2 Hàm lượng tro Hàm lượng tro kết khảo sát hàm lượng tro hạt cau già ñược trình bày qua bảng 3.3 Bảng 3.2 Kết khảo sát hàm lượng tro STT m1(g) m0(g) m2(g) Tro% troTB% 30,015 5,005 30,157 2,84 32,356 5,020 32,483 2,53 2,38 27,630 5,041 27,781 3,00 29,974 5,089 30,018 2,65 29,571 5,057 29,734 3,23 Vậy, hàm lượng tro trung bình hạt cau khoảng 2,38% Trong ñó: m3 khối lượng chén sứ mẫu sau tro hóa (g) m2 khối lượng chén sứ mẫu cau sau xác ñịnh ñộ ẩm (g) m khối lượng hạt cau ban ñầu (g) Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 Nhận xét: Từ bảng 3.2 nhận thấy ñược rằng: nước hạt cau chứa chủ yếu chất hữu Khi hạt già, hàm lượng nước hạt giảm hàm lượng hữu tăng lên 3.3 XÁC ĐịNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ KIM LOẠI BẰNG MÁY QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ AAS Mẫu cau già sau tro hoá ñược hoà tan dung dịch HNO3 loãng ñịnh mức ñến 50ml Lấy dung dịch ñã ñịnh mức ñem xác ñịnh hàm lượng số kim loại trung tâm ño lường chất lượng kỹ thuật, số – Ngô Quyền- Quận - Đà Nẵng Kết thu ñược trình bày bảng 3.4 Bảng 3.3 Bảng hàm lượng số kim loại hạt cau già Hàm lượng TCVN( Kim loại (mg/kg) mg/kg) 2+ As 0,190 2+ Pb 0,719 2+ Cu 1,201 30 2+ Zn 2,150 40 2+ Hg 0,042 0,05 2+ Cd 0,040 3+ Cr 0,435 Căn vào ñịnh số 867/1998/ QĐ-BYT ngày 04 tháng năm 1998 Bộ y tế việc ban hành danh mục “Tiêu chuẩn vệ sinh ñối với lương thực thực phẩm”, ñối chiếu với mục hàm lượng kim loại cho phép rau bảng kết ta nhận thấy thành phần kim loại nặng hạt cau hàm lượng cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hưởng ñến sức khoẻ người 3.4 CHIẾT TÁCH ANCALOIT TRONG HẠT CAU 3.4.1 Lựa chọn thuốc thử Bột cau già tẩm dung dịch NH3 6N, chiết nóng với clorofom, dịch chiết ñuổi dung môi ñến cặn - Các thuốc thử tạo tủa với ancaloit: hòa cặn thu ñược vào axit H2SO4 1%, thử với thuốc thử Dragendorff, Mayer, Wagner Kết thu ñược sau: + Thuốc thử Dragendorff: Tạo ñược kết tủa vàng cam rõ + Thuốc thử Mayer: Tạo ñược kết tủa vàng cam + Thuốc thử Wagner : xuất kết tủa vàng nâu rõ + Dung dịch axit picric: tạo ñược tinh thể hình kim không màu với dịch chiết rõ Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 - Các thuốc thử thông thường tạo màu với ancaloit: + Dung dịch H2SO4 98%: tạo ñược chất lỏng màu ñỏ máu + Dung dịch HNO3 ñậm ñặc (D= 1,4 g/ml): Tạo ñược chất lỏng màu hồng chuyển nhanh thành vàng + Dung dịch AgNO3 1% : tạo kết tủa nâu ñến ñen Nhận xét: Nhìn chung phản ứng dịch chiết hạt cau với thuốc thử ñều cho kết tủa màu rõ nên sử dụng ñể ñịnh tính ancaloit chiết màu triển khai sắc ký lớp mỏng 3.4.2 Lựa chọn dung môi chiết - Tiến hành: Cân mẫu hạt cau (10 gam/mẫu), tiến hành ngâm mẫu dung môi có ñộ phân cực tăng dần: Hexan, clorofom, nước cất, dung dịch hỗn hợp C2H5OH 96 HCl 2% với tỉ lệ thể tích 4:1 Lắc, quan sát thay ñổi màu sắc dịch chiết sau ngày ñêm, thu lấy dịch chiết, thử có mặt tanin dịch chiết dung dịch FeCl3; axit hóa dịch chiết thử với thuốc thử Wagner - Sau phân tích kết thực nghiệm chọn dung môi chiết lấy ancaloit hạt cau CHCl3 dung dịch hỗn hợp C2H5OH 960 + HCl 2% (4:1) + CHCl3: Làm dung môi tốt Do ancaloit kết hợp tanin tồn dạng muối cau nên tẩm kiềm ñể chuyển ancaloit dạng bazơ tự trước chiết nóng CHCl3 + Dung dịch C2H5OH 960 + HCl 2% (4:1) dùng làm dung môi tốt Vì môi trường axit ancaloit dạng este bị hủy nhiệt ñộ cao nên chiết phương pháp ngấm kiệt tốt Màu dịch chiết ñược làm phẩm nhuộm 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng tạp chất Chúng tiến hành chiết lấy ancaloit trường hợp: có loại tạp chất ete-dầu không loại tap chất Kết quả: Khi kiềm hóa dịch chiết ñể tách lấy ancaloit mẫu chưa loại tạp cho kết tủa nhiều, kết tủa bám cặn ñen, vón cục Mẫu ñã loại tạp cho kết tủa hơn, dạng huyền phù ⇒ Hạt cau chứa nhiều chất béo, tinh dầu Đây chất gây cản trở cho trình chiết, ñó cần loại chúng trước tiến hành chiết 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết ñến hiệu suất trình chiết tách Chúng tối tiến hành chiết với khoảng thời gian sau: giờ, giờ, giờ, 10 giờ, 12 Dịch chiết thu ñược, tiến hành ñuổi dung môi ñến 20 ml dịch chiết Chia dịch chiết làm phần, phần thử thuốc Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 thủ Wagner, phần ñuổi dung môi ñến cặn, ñịnh lượng Kết cảm quan cho thấy lượng kết tủa chiết từ 10 trở ñi nhiều Kết ñịnh lượng ñược trình bày bảng 3.7 Bảng 3.4 Khối lượng sản phẩm chiết theo thời gian Thời gian chiết m2 (g) ∆m (g) m1 (g) (h) 32,347 32,386 0,0390 10 30,253 30,307 0,0540 12 26,647 26,715 0,0681 14 33,397 33,465 0,0860 16 29,308 29,395 0,0870 Trong ñó: m1: khối lượng cốc ban ñầu (g) m2: khối lượng cốc chứa cặn (g) Nhận xét: Với 20 gam bột hạt cau, chiết với 140 ml CHCl3, từ 14 ñến 16 lượng cặn tăng chậm, không ñáng kể nên thời gian chiết thích hợp 14 3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng thể tích dung môi ñến hiệu suất trình chiết tách Với 20 gam hạt cau/mẫu, tiến hành chiết với thể tích dung môi CHCl3 khác nhau: 100ml, 120 ml, 140 ml, 160 ml 10 Dịch chiết ñược xử lí mục 3.4.4 Kết cảm quan cho thấy lượng kết tủa chiết với 140 ml CHCl3 rõ nhiều Kết ñịnh lượng ñược trình bày bảng 3.8 Bảng 3.5 Khối lượng sản phẩm chiết theo thể tich dung môi CHCl3(ml) m1(g) m2(g) ∆m(g) 100 30,452 30,685 0,233 120 31,615 31,931 0,316 140 29,670 30,072 0,402 160 33,618 34,031 0,413 Trong ñó: m1 khối lượng cốc ban ñầu (g) m2 khối lượng cốc chứa cặn (g) Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 Nhận xét: Với 20gam bột cau chiết với 140ml CHCl3 10 cho lượng cặn lớn Vì trình nghiên cứu chọn tỉ lệ thể tích dung môi (ml) khối lượng bột cau 140:20 3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng pH chiết ñến hiệu suất tạo ancaloit Lấy mẫu hạt cau (20 gam/1 mẫu), loại tạp ete-dầu, tẩm 30 ml dung dịch NH3 6N, ñể yên 30 phút cho vào bình soxhlet Tiến hành chiết nóng 140 ml CHCl3 650C với thời gian 10 Dịch chiết thu ñược, tiến hành loại tạp phương pháp axit - bazơ sau: hòa cặn vào dung dịch H2SO4 1% Lắc dịch chiết axit với dung dịch NH3 10% khoảng pH từ ÷ 12 cho mẫu (pH= 7, 8, 9, 10, 11, 12) ñồng thời chiết lượng ancaloit thu ñược dung môi CHCl3 Gộp dịch sản phẩm chiết, loại H2O Na2SO4 khan, ñuổi dung môi 20 ml Chia dịch chiết làm phần, phần thử thuốc thủ Wagner, phần ñuổi dung môi ñến cặn, ñịnh lượng Kết cảm quan cho thấy lượng kết tủa chiết pH = 11 rõ nhiều Kết ñịnh lượng ta ñược trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Khối lượng sản phẩm tối ưu pH chiết m2 (g) ∆m (g) pH m1 (g) 31.328 31.332 0.004 32.815 32.843 0.028 33.173 33.210 0.037 10 30.765 30.804 0.039 28.793 28.835 11 0.042 12 29.480 29.521 0.041 Trong ñó: m1 khối lượng cốc ban ñầu (gam) m2 khối lượng cốc chứa cặn (gam) ⇒ Ancaloit hạt cau có tính bazơ yếu pH thích hợp ñể chiết ñược lượng ancaloit lớn 11 3.5 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH CHIẾT TRONG DUNG MÔI CHCl3 3.5.1 Xác ñịnh thành phần hóa học dịch chiết hạt cau già CHCl3 Mẫu phân tích ñược chiết từ 20 gam bột hạt cau già, tiến hành sơ ñồ nghiên cứu 2.4 Để xác ñịnh thành phần hóa học ancaloit thô, tiến hành phân tích LC-MS, GC-MS Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 3.5.1.1 Kết ño LC-MS dịch chiết ancaloit thô - Kết phân tích LC cho thấy dịch chiết hạt cau già dung môi CHCl3 có 19 cấu tử Thành phần sản phẩm chiết arecolin chiếm 33,67% - Kết phân tích phổ khối MS cho thấy: Ở thời gian lưu 2,2 phút, với ion mảnh có khối lượng lớn M = 155,9, dựa vào ion ñồng vị cacbon (suy số nguyên tử C phân tử) quy luật phân mảnh ta xác ñịnh ñược thành phần dịch chiết Arecolin (C8H13NO2) chiếm 38,17% khối lượng sản phẩm chiết Ngoài arecolin, dịch chiết có số ancaloit khác (bảng 3.12) Bảng 3.12 Định tính ñịnh lượng số ancaloit dịch chiết ban ñầu M Thời gian M thực chuẩ %m Chất phân tích lưu nghiệm n 155,095 155,9 38,17 Arecolin C8H13NO2 Lần 2,2 Guvacol phút 141,079 141,9 C7H11NO2 in 169,110 167,8 2,012 C9H15NO2 Lần 4,1 127,063 126,8 Guvacin C6H9NO2 phút 155,095 155,9 Arecolin C8H13NO2 Guvacol Lần 24,6 141,079 140,8 22,75 C7H11NO2 in phút 127,063 126,8 Guvacin C6H9NO2 3.5.1.2 Kết phân tích GC-MS dịch chiết ancaloit thô CHCl3 - Kết phân tích GC cho thấy dịch chiết hạt cau già dung môi CHCl3 có 20 cấu tử Thành phần sản phẩm chiết arecolin chiếm 33,67% (bảng 3.14) Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 Bảng 3.14 Thành phần hóa học dịch chiết hạt cau già - Số lượng cấu tử qua cách phân tích LC-MS GC-MS gần (14 ÷ 20 cấu tử) hàm lượng cấu tử arecolin 38,17% (gần với hàm lượng arecolin phân tích phương pháp LCMS 3.5.1.3 Kết chiết ancaloit toàn phần ño GC-MS a Chiết tách ancaloit dung môi CHCl3 - Chuẩn bị mẫu chiết + Loại tạp sơ bộ: Lấy 20 gam hạt cau già, cho vào gói giấy chiết nóng soxhlet với 100 ml ete- dầu hỏa 650C + Chuyển ancaloit dạng muối thành dạng bazơ tự Cau sau ñã loại tạp ete dầu hỏa ñể khô tự nhiên ñem tẩm 30 ml dung dịch NH3 6N ñể yên - Chiết nóng soxhlet với dung môi CHCl3 10 650C Dịch chiết thu ñược có màu vàng nhạt, bã rắn sẫm màu so với nguyên liệu ñầu Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 - Loại tạp ancaloit thô thu ñược từ dịch chiết + Đuổi dung môi: Tiến hành ñuổi CHCl3 chưng cất áp suất thường 650C; loại khoảng 2/3 thể tích dịch chiết + Lắc dịch chiết với axit H2SO4 1% Lắc dịch chiết với axit H2SO4 1% + Kết tủa dịch chiết dung dịch NH3 10% chiết ancaloit vào CHCl3 Cho CHCl3 vào bình gạn, cho dịch chiết axit vào, thêm từ từ dung dịch NH3 10% vào dịch chiết axit, nâng dần pH môi trường ñến pH = 11; tiến hành chiết lần, lần 10 ml CHCl3 Do lượng ancaloit nên thu kết tủa toàn phần - Chiết kiệt ancaloit phần bã rắn + Ngấm kiệt bã rắn với dung dịch rượu axit Mục ñích: Chiết kiệt ancaloit lại xác cau sau chiết với CHCl3 Tiến hành: Chia xác cau làm phần nhau, cho vào bình Ngấm kiệt với hỗn hợp dung môi C2H5OH 960 + HCl 2% theo tỉ lệ thể tích 4:1 theo phương pháp chiết ngược dòng Dịch chiết thu ñược có màu ñỏ nâu + Trung hòa dịch chiết loại tạp Mục ñích: Tuy ñã ñược loại tạp sơ ban ñầu ete- dầu ngấm kiệt với C2H5OH 960C + HCl 2% (4:1) chiết thêm nhiều tạp béo, màu, tannin… Khi kết tủa dd NH3 10% có kết tủa tạp chất ảnh hưởng lớn ñến trình chiết ancaloit sau Tiến hành: cho từ từ dung dịch NH3 10% vào dịch chiết ñến pH = ñể yên ngày ñêm Lọc bỏ chất rắn, thu phần dịch lỏng Kết cho thấy lượng cặn tăng dần theo thời gian; dịch chiết nguyên màu sánh so với dịch chiết ban ñầu + Chiết kết tủa CHCl3 Tiến hành: Cho CHCl3 vào bình gạn, cho dịch chiết vào, thêm từ từ dung dịch NH3 10% nâng dần pH môi trường (7÷12) ñể thu ancaloit toàn phần Tiến hành chiết lần, lần 10 ml CHCl3 Gộp dịch chiết phần lại ta ñược 100ml dịch chiết ancaloit CHCl3 Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 - Loại H2O, ñịnh lượng, hòa cặn vào CHCl3 ñịnh mức trong 10 ml + Loại H2O Na2SO4 + Cô cạn dịch chiết, cân ñịnh mức cặn 10ml CHCl3 ño GC-MS b Đo phổ GC-MS; ñịnh tính, bán ñịnh lượng ancaloit thu ñược - Dựa vào kết phân tích sắc kí ñồ GC phổ khối MS nhận thấy, sản phẩm chiết có cấu tử; ñó cấu tử có hàm lượng 95,62% - Bảng 3.15 Thành phần hóa học dịch chiết hạt cau già sau loại tạp chất Theo bảng 3.15, arecolin sản phẩm chiếm 95,62% khối lượng, chất lại chiếm tỉ lệ thấp, không ñáng kể Như vậy, loại tạp phương pháp axit – bazơ thu ñược arecolin tinh khiết nên dùng phương pháp ñể tách arecolin khỏi hỗn hợp hợp chất tự nhiên 3.6 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC, HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA ANCALOIT THU ĐƯỢC Ancaloit hạt cau có khả kìm hãm hoạt ñộng enzymn peoxydaza; khả phụ thuộc vào nồng ñộ ancaloit hạt cau Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 Bảng 3.19 Khả kìm hãm hoạt ñộng enzym peoxydaza Nồng ñộ chất thử ( µg/ml) 256 64 16 % khả kìm hãm hoạt ñộng enzym peoxydaza 41 ± 2,5 28 ± 1,2 19 ± 0,9 ± 0,5 Nhận xét: Ancaloit hạt cau có hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm ñịnh: E.coli, P.aeruginasa, S.aureus, B.subtilis nồng ñộ ≥ 256 µg/m Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * Qua trình nghiên cứu ñã thu ñược số kết sau: Kết xác ñịnh ñộ ẩm, hàm lượng hữu cơ, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại hạt cau cho thấy: a Độ ẩm trung bình cau già chiếm 57,067% b Hàm lượng tro trung bình hạt cau già 2,38% c Hàm lượng kim loại nặng As, Zn, Pb, Cu, Hg, Cd, Cr hạt cau nằm giới hạn cho phép sử dụng Bộ y tế Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng ñến trình chiết a Qua nghiên cứu cho thấy, ñể bớt khó khăn trình chiết tách cần thiết phải loại tạp ete – dầu trước chiết Phần bã nên loại tạp cách ñể yên khoảng ngày ñêm b Để chiết ancaloit hạt cau nên dùng dung môi CHCl3 phần xác ngấm kiệt với hỗn hợp dung môi C2H5OH 96% + HCl 2% theo tỉ lệ thể tích 4:1 c Với 20 g cau già, ñiều kiện chiết tối ưu (lượng ancaloit thu ñược nhiều nhất) là: − Thể tích dung môi: 140 ml CHCl3 − Thời gian : khoảng 12 − pH chiết : 11 Kết phân tích thành phần hóa học dịch chiết phương pháp phổ LC-MS GC-MS cho thấy: - Dịch chiết hạt cau già CHCl3 thu ñược có 14 ÷ 20 cấu tử ñó có ancaloit: arecolin, guvacolin, guvacin, Thành phần arecolin (C8H13NO2) chiếm khoảng 33,67 ÷ 38,17% ⇒ Dùng làm dược liệu ñiều chế thuốc trị giun, sán nên sử dụng cau già ñó hàm lượng arecolin cao So sánh lần chạy phổ dịch chiết trước sau tinh khiết, nhận thấy: dịch chiết sau qua loại tạp phương pháp axit- bazo tinh khiết dịch chiết nguyên ban ñầu (arecolin chiếm 95,62%) Ancaloit thu ñược có hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm ñịnh: E.coli, P.aeruginasa, S.aureus, B.subtilis Ancaloit thu ñược có hoạt tính kháng oxi hóa Nó có khả kìm hãm hoạt ñộng enzym peoxydaza Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 * Kiến nghị: Từ nghiên cứu ñây, kiến nghị nghiên cứu tiếp theo: Nghiên cứu phân tách arecolin, guvaxin sắc kí cột Tuy loại tạp theo phương pháp axit – bazơ ñã nghiên cứu thu ñược arecolin tinh khiết trình phản ứng khỏi sản phẩm phụ không mong muốn Nghiên cứu phản ứng hoá học khả chống oxy hoá arecolin, guvaxin sản phẩm ñược ñiều chế từ chúng ñể mở rộng ứng dụng sản xuất dược liệu Nghiên cứu hợp chất màu hạt cau lùn ứng dụng Footer Page 25 of 126  ... hiểu hạt cau lùn nhằm làm sáng tỏ công dụng nó, ñã chọn ñề tài Nghiên cứu chiết tách, xác ñịnh thành phần Ancaloit hạt cau lùn Đối tượng nghiên cứu Hạt cau lùn nghiên cứu ñược lấy từ cau lùn. .. Vang, thành phố Đà Nẵng Mục ñích nghiên cứu - Nghiên cứu trình chiết tách hợp chất ancaloit từ hạt cau lùn - Xác ñịnh thành phần hóa học, công thức cấu tạo số ancaloit Phương pháp nghiên cứu Để... DỊCH CHIẾT TRONG DUNG MÔI CHCl3 3.5.1 Xác ñịnh thành phần hóa học dịch chiết hạt cau già CHCl3 Mẫu phân tích ñược chiết từ 20 gam bột hạt cau già, tiến hành sơ ñồ nghiên cứu 2.4 Để xác ñịnh thành