Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN VĂN TUYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ RƠM LÚA Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Mã số : 60.54.02 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT - ĐÀ NẴNG, NĂM 2011 - Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH Phản biện : PGS.TS LÊ THỊ LIÊN THANH Phản biện : PGS.TS TRẦN THỊ XÔ Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Kỹ thuật Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng 07 năm 2011 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết ñề tài Cây lúa giữ vị trí trung tâm nông nghiệp kinh tế Việt Nam Hình ảnh ñất Việt thường ñược mô tả ñòn gánh khổng lồ với hai ñầu hai vựa thóc lớn Đồng sông Cửu Long Đồng sông Hồng Việc sản xuất lúa gạo ñã tạo lượng lớn phế phẩm từ lúa bao gồm rơm trấu Phần lớn lượng phế phẩm ñược bón trở lại ruộng sau thu hoạch, sử dụng làm chất ñốt cho hộ nhà nông làm thức ăn cho gia súc … Bên cạnh ñó lượng không nhỏ rơm rạ bị thải làm ô nhiễm môi trường Với ứng dụng Công nghệ Sinh học ñã sử dụng phế liệu tạo nhiều sản phẩm có giá trị etanol, phân vi sinh, nấm.v.v ñặc biệt axit lactic ñược quan tâm nhiều năm gần ñây Nhu cầu axit lactic ngày nhiều, chúng ñược ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực bảo quản chế biến thực phẩm, y học, môi trường công nghiệp nhẹ, axit lactic dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm thuộc da, y học dược học, kết hợp với phát triển công nghệ sinh học di truyền, axit lactic ñược nghiên cứu nhằm sản xuất phục vụ nhu cầu thiết yếu sức khỏe người Trong phẫu thuật chỉnh hình, hợp chất cao phân tử tổng hợp từ axit lactic dẫn xuất chất liệu cấy ghép sinh học thích hợp hiệu cao Canxi lactat loại dược phẩm nhằm bổ sung canxi dạng dễ hấp thu cho thể Sắt lactat ñược sử dụng ñể chữa bệnh thiếu máu Trong công nghiệp rượu, axit lactic ñược Footer Page of 126 Header Page of 126 dùng dạng muối canxi Đặc biệt gần ñây, nhà khoa học giới ñã nghiên cứu tổng hợp nhựa axit polylactic (PLA) – loại nhựa sinh học từ axit lactic thân thiện với môi trường PLA lựa chọn thích hợp thay cho nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ, vừa phân huỷ ñược, vừa ñộc tính ñối với người PLA ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất bao bì phân bón, thực phẩm loại bát, ñĩa dùng lần.…[6], [25], [33] Tổng thị trường giới axit lactic 86.000 vào năm 2001, 500.000 vào năm 2010 Ở Việt Nam: vào năm 2006, ñại diện công ty dược IIdong (Hàn Quốc) xuất số luợng lớn chế phẩm axit lactic sang hãng MERAP phân phối ñược Việt Nam với giá trị hợp ñồng 3,7 triệu USD [37], [38], [39] Chính thực tế trên, mạnh dạn chọn ñề tài “Nghiên cứu trình lên men axit lactic từ rơm lúa” việc làm cấp thiết Mục ñích nghiên cứu - Xác ñịnh thông số công nghệ tốt nồng ñộ dịch ñường, tỉ lệ giống vi khuẩn, thời gian lên men… cho trình lên men axit lactic cách sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic sau lên men cao Đối tượng nghiên cứu - Sử dụng rơm làm nguồn nguyên liệu ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch ñường tiến hành lên men axit lactic dịch ñường ñã thủy phân Footer Page of 126 Header Page of 126 Phạm vi nghiên cứu - Lên men axit lactic từ rơm ñược thu nhận ñồng lúa Quế Xuân, Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam - Quá trình lên men ñược thực với chủng giống vi sinh vật Lactobacillus casei Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu bảo quản mẫu - Phương pháp hóa lý - Phương pháp hóa học - Phương pháp hóa sinh - Phương pháp vi sinh vật - Phương pháp toán học Ý nghĩa khoa học ñề tài - Phân tích xác ñịnh hàm lượng ñường dịch sau thủy phân xác ñịnh hàm lượng axit lactic phương pháp hóa học - Tối ưu hóa ñiều kiện lên men phương pháp quy hoạch thực nghiệm phương pháp tối ưu nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic cao Ý nghĩa thực tiễn ñề tài - Tận dụng lượng phế phẩm rơm rạ nông nghiệp ñể tạo nguồn nguyên liệu ñể sản xuất axit lactic - Giải ñược vấn ñề ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng ñồng, nâng cao hiệu kinh tế sản xuất - Tăng nguồn thu nhập cho người nông dân Footer Page of 126 Header Page of 126 - Giảm lượng axit lactic ngoại nhập, chủ ñộng sản xuất, tiết kiệm ngoại tệ Kết cấu luận văn Ngoài phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục luận văn bao gồm chương sau: + Chương 1: Tổng quan + Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu + Chương 3: Kết thảo luận + Chương 4: Kết luận kiến nghị Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu axit lactic 1.2 Vi sinh vật lên men lactic 1.3 Cơ sở qúa trình lên men axit lactic 1.4 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic yếu tố ảnh hưởng ñến trình lên men 1.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon 1.4.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ 1.4.3 Nhu cầu chất hữu 1.4.4 Nhu cầu muối vô 1.4.5 Ảnh hưởng ñiều kiện lên men 1.4.5.1 Ảnh hưởng nhiệt ñộ 1.4.5.2 Ảnh hưởng pH 1.4.5.3 Vi sinh vật tạp nhiễm trình lên men 1.5 Ứng dụng axit lactic 1.5.1 Trong bảo quản chế biến thực phẩm 1.5.2 Trong y học 1.5.3 Trong môi trường 1.5.4 Trong mỹ phẩm 1.6 Tình hình nghiên cứu axit lactic giới 1.7 Những nghiên cứu nước 1.8 Rơm dịch thủy phân từ nghuyên liệu rơm 1.8.1 Rơm 1.8.1.1 Xenluloza 1.8.1.2 Hemixenluloza 1.8.1.3 Lignin 1.8.2 Dịch thủy phân xenluloza Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Rơm ñã qua tiền xử lý Quá trình tiền xử lý rơm ñược tiến hành sau [4]: Rơm Rửa phơi ngày Cắt thành ñoạn (1→ 2cm), lấy 20g Cốc 500ml Tiền xử lý lò vi sóng (700 W, 30 phút) Trung hòa axit axetic 1% Rửa sấy (650C, ngày) Xay (0,5 → 1mm) Rơm sau tiền xử lý Footer Page of 126 200 ml dung dịch NaOH 1% Header Page of 126 2.2 Enzym Enzym ñược sử dụng enzym cellusoft có nguồn gốc từ Novo Norzyme – Đan Mạch Enzym ñược mua công ty TNHH Nam Giang, 133/11 Hồ Văn Huệ, quận Phú Nhuận với tên thương mại Cellusoft L, có dạng lỏng, màu nâu ñỏ Đây chế phẩm cellulase ñiều chế phương pháp lên men chìm với hoạt tính biểu thị 1500 NCU/g Hoạt tính biểu thị ñược xác ñịnh theo phương pháp phân tích NovoNorzym, AF 187.2 Các thông số enzyme Cellusoft L: - Nhiệt ñộ hoạt ñộng tối ưu 500C - pH hoạt ñộng tối ưu 4.8 2.3 Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic ñược sử dụng chủng Lactobacillus casei CNTP 6545 Viện sinh học, 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội cung cấp 2.4 Thiết bị, hóa chất Thiết bị: - Tủ sấy: dùng ñể sấy nguyên liệu dụng cụ - Máy so màu - Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp trùng Hirayama HVE-50; Cân ñiện tử Excell; Tủ ấm Memmert; Máy lắc Edmund Buhler Gmbtt… Hóa chất: Sử dụng hóa chất phòng thí nghiệm Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng số hóa chất liên quan mua Đà Nẵng TP Hồ Chí Minh 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp hóa học Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 10 2.5.1.1 Xác ñịnh hàm lượng axit lactic phương pháp hóa học [12] 2.5.1.2 Xác ñịnh hàm lượng ñường khử phương pháp so màu sử dụng axit dinitro salicylic (DNS) [6] 2.5.2 Phương pháp tiền xử lý thủy phân rơm [7] 2.5.3 Môi trường lên men lactic [20] 2.5.4 Phương pháp lên men lactic 2.5.5 Phương pháp xử lý sau lên men ñể ñịnh lượng axit lactic 2.5.6 Phương pháp vi sinh vật 2.5.6.1 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn 2.5.6.2 Phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào cách ñếm khuẩn lạc phát triển môi trường thạch [10] 2.5.6.3 Phương pháp chuyển giống sang môi trường lên men 2.5.7 Phương pháp toán học Footer Page 10 of 126 Header Page 11 of 126 11 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát trình thủy phân xenluloza từ rơm: Rơm nguyên liệu thu nhận ñồng lúa Quế Xuân, Huyện Quế Sơn, Tỉnh Quảng Nam ñược bảo quản nhiệt ñộ phòng cho ñến sử dụng Thành phần ban ñầu rơm là: xenluloza, hemixenluloza lignin, có số thành phần tro khoáng Trong ñó, xenluloza chiếm khoảng 42%, lignin 7,35% ñộ ẩm rơm thô lúc 11,67% Sau tiền xử lý kiềm lò vi sóng ñược thực theo nghiên cứu Lê Phạm Thiên Hằng [4] thành phần xenluloza, ligin rơm thu ñược tương ứng là: 70% 4,1%, ñộ ẩm rơm lúc 6,67% Trong công trình nghiên cứu Lê Phạm Thiên Hằng trình thủy phân xenluloza từ rơm, tác giả ñã nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố ñến trình thủy phân sau: ảnh hưởng nhiệt ñộ, thời gian, tỉ lệ enzym Cellusoft® L/cơ chất ñến trình thủy phân, nhiên số hạn chế khiến cho lượng ñường glucoza thu ñược sau thủy phân không cao, cụ thể tác giả chưa nghiên cứu ñược ảnh hưởng số yếu tố như: lượng chất tham gia vào trình thủy phân, pH trình thủy phân…Vì tiến hành khảo sát lại số yếu tố ảnh hưởng ñến trình thủy phân xenluloza từ rơm 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng lượng chất (rơm sau tiền xử lý) tham gia vào trình thủy phân Thực khảo sát ảnh hưởng lượng chất cho vào lên trình thủy phân Các thí nghiệm ñược tiến hành ñiều kiện (xem phần 2.5.2): nhiệt ñộ 51 C; pH: 4,8 (bổ sung 100ml dung dịch ñệm Footer Page 11 of 126 Header Page 12 of 126 12 Xitric/Natri xitrat); tốc ñộ lắc 150 rpm (vòng/phút); thời gian 96 giờ; tỉ lệ enzym Cellusoft® L/cơ chất sử dụng 0,26 ml/g với lượng chất thay ñổi từ 7g/l ñến 13g/l Sau kết thúc trình thủy phân, dịch lọc thu ñược sau thuỷ phân ñược pha loãng 100 lần ño mật ñộ quang (OD) máy so màu theo phương pháp DNS bước sóng 540nm Từ kết ño OD, tính ñược nồng ñộ dịch ñường Từ kết thí nghiệm, biểu diễn ñồ thị Hàm lượng glucose dịch thủy phân (g/l) sau (xem thêm bảng 2.1 phụ lục 2): 32.00 30.00 28.00 26.00 24.00 22.00 20.00 10 11 12 13 14 Hàm lượng chất (g/l) Hình 3.1 Ảnh hưởng hàm lượng chất sử dụng ñến trình thuỷ phân Trong khoảng 7-10g/l chất, hàm lượng ñường glucoza thu ñược dung dịch tăng từ 22,375g/l ñến 31,356g/l Sau ñó hàm lượng chất tăng từ 11g/l ñến 13g/l, hàm lượng glucoza thu Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 13 ñược có giá trị thay ñổi không ñáng kể Hàm lượng glucoza lớn thu ñược 10g/l chất Thật vậy, hàm lượng chất tăng cao, lượng xenluloza tăng Như vậy, lượng xenluloza bị công enzym tăng lên kết lượng glucoza dung dịch tăng theo Tuy nhiên, hàm lượng chất tăng cao, enzym bị bão hòa chất, khả tác ñộng enzym giảm ảnh hưởng tới lượng glucoza tạo thành Mặt khác, hàm lượng chất cao, dung dịch ñậm ñặc, trình khuếch tán enzym toàn khối nguyên liệu khó khăn dẫn ñến phản ứng thủy phân diễn khó khăn 3.1.2 Khảo sát hàm lượng enzym Cellusoft® L cần dùng Tỷ lệ enzyme/cơ chất yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn ñến trình thủy phân [13] Với loại enzyme chất khác cần nghiên cứu xác ñịnh ñược tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp ñể trình thủy phân ñạt hiệu cao Chuẩn bị mẫu thí nghiệm ñiều kiện sau: nhiệt ñộ 51 C; pH: 4,8 (bổ sung 100ml dung dịch ñệm Xitric/Natri xitrat); thời gian 96 giờ; tốc ñộ lắc 150 rpm (vòng/phút); với lượng chất 10g thể tích enzym sử dụng tăng dần từ 2ml ñến 3,2ml Từ kết thí nghiệm thu ñược (xem bảng 2.2 phụ lục 2) biểu diễn ñồ thị hình 3.2 Footer Page 13 of 126 Hàm lượng glucose dịch thủy phân (g/l) Header Page 14 of 126 14 33.00 32.00 31.00 30.00 29.00 28.00 27.00 26.00 25.00 24.00 2.2 2.4 2.6 2.8 3.2 3.4 Thể tích enzym (ml) Hình 3.2 Ảnh hưởng thể tích enzym ñến trình thuỷ phân Qua ñồ thị ta thấy, thời ñiểm ta khảo sát, lượng chế phẩm enzym Cellusoft® L bổ sung tăng lượng dịch ñường tạo thành cao Khi hàm lượng enzym 3,0ml lượng ñường tạo thành cao Nếu tiếp tục tăng hàm lượng enzym bổ sung, thiếu chất thừa enzym nên lúc hàm lượng ñường tạo thành trở nên bão hòa (giá trị thay ñổi không ñáng kể) Chính vậy, nghiên cứu thủy phân xenluloza 3,0ml (tương ứng tỷ lệ enzym/cơ chất 0,30ml/g) chế phẩm enzym Cellusoft® L ñể tạo dịch ñường cho trình lên men lactic 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ñến trình thuỷ phân xenluloza rơm enzym Cellusoft® L Thời gian thủy phân có ảnh hưởng lớn ñến trình thuỷ phân phương pháp enzym, ñịnh ñến hiệu suất Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 15 thuỷ phân [13] Tham khảo công trình nghiên cứu giới ([18], [22]) chọn mốc thời gian 60, 72, 84, 96, 108 ñể theo dõi trình thuỷ phân chọn khoảng thời gian thích hợp cho trình Các thí nghiệm ñược thực với ñiều kiện ñã nói trên, kết thí nghiệm thu ñược ñược trình bày bảng 2.3 phụ lục Hàm lượng glucose dịch thủy phân (g/l) ñược biểu diển ñồ thị hình 3.3 36.00 34.00 32.00 30.00 28.00 26.00 24.00 22.00 20.00 60 72 84 96 108 120 Thời gian thủy phân (h) Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian ñến trình thuỷ phân Từ 60 ñến 84 tốc ñộ thuỷ phân thành glucoza nhanh nồng ñộ ñường khử thu ñược cao Nồng ñộ ñường khử tăng dần theo thời gian ñạt cao 96 giờ, lúc nồng ñộ ñường khử ñạt ñến khoảng 33,771g/l Nhưng kéo dài thời gian từ 96 ñến 108 nồng ñộ ñường khử tăng không ñáng kể Điều chứng tỏ trình thủy phân enzym tăng mạnh cho ñến thời gian 96 Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 16 sau ñó hoạt ñộng xúc tác thuỷ phân enzym Cellusoft® L diễn chậm Như vậy, với enzym Cellusoft® L ñiều kiện thí nghiệm chúng tôi, trình thủy phân nên kéo dài ñến 96 ñạt ñược hiệu suất thủy phân cao * Nhận xét: Như vậy, sau thực thí nghiệm với ñiều kiện ñã khảo sát như: lượng chất (rơm sau tiền xử lý) 10g; thể tích enzym Cellusoft® L cần dùng 3,0ml; thời gian thủy phân 96h ñiều kiện khác ñã nói hàm lượng ñường glucoza thu ñược sau trình thủy phân 34g/l So với nhiều nghiên cứu giới hàm lượng ñường glucoza thu ñược cao Theo nghiên cứu S Zhu cộng sự, thủy phân rơm lúa enzyme Trichoderma reesei cellulase, nồng ñộ ñường khử thu ñược 35,5g/l Tác giả Lu Zhao Xin thuộc Trung tâm nghiên cứu khoa học nông nghiệp Trung Quốc với nghiên cứu trình thuỷ phân rơm lúa ñã qua tiền xử lý dung dịch kiềm kết hợp với tia xạ ñã thu ñược nồng ñộ ñường glucose 36% [20] So với nghiên cứu tác giả Lê Phạm Thiên Hằng (nồng ñộ ñường glucoza 30 g/l) hàm lượng ñường glucoza thu ñược cao nhiên lượng enzym cần bổ sung vào trình thủy phân lại nhiều 3.2 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng ñến trình lên men lactic Trong trình lên men lactic, hoạt ñộng vi khuẩn Lactobacillus casei, chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố nhiệt ñộ, nồng ñộ dịch ñường, hàm lượng vi khuẩn bổ sung, thời gian lên men…dịch ñường bị chuyển hóa sản phẩm tạo thành cuối chủ yếu axit lactic Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 17 Chúng tiến hành thực trình lên men ñể nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố thông thường như: hàm lượng giống vi khuẩn Lactobacillus casei, nồng ñộ dịch ñường, thời gian lên men Ngoài ra, theo Archibald and Fridovich (1981b)[15] số chủng Lactobacillus yêu cầu nồng ñộ mangan cao cho phát triển Sự có mặt mangan giúp ngăn cản trình tự phân ổn ñịnh cấu trúc tế bào Trong trường hợp Lactobacillus casei họ cho mangan có vai trò thành phần lactate dehydrogenase chịu trách nhiệm sản xuất axit lactic Vì vậy, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng mangan sunphat ñến trình lên men lactic Trước khảo sát trình lên men, chọn phương pháp so màu sử dụng axit dinitrosalycilic (DNS), ñược trình bày mục 2.5.1.2 phụ lục 1.2 ñể xác ñịnh ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường chuẩn bị lên men Đồng thời với trình trên, chuẩn bị trước dịch vi khuẩn ñể khảo sát ñộng thái sinh trưởng phát triển loại vi khuẩn nhằm thuận lợi cho trình lên men 3.2.1 Khảo sát trình hoạt hóa nhân giống vi khuẩn 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ giống vi khuẩn Lactobacillus casei ñến trình lên men Cố ñịnh nồng ñộ dịch ñường 5%; nhiệt ñộ 37 C; pH = 6; thời gian lên men 72h; hàm lượng sunphat mangan cần bổ sung 0,5g/l Tiến hành chuẩn bị mẫu thí nghiệm với hàm lượng giống ban ñầu khác theo tỉ lệ % thể tích nuôi cấy Kết thí nghiệm ñược thể bảng 2.4 phụ lục hình 3.7 Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 18 Hàm lượng axit lactic (g/l) 17.00 16.50 16.00 15.50 15.00 14.50 14.00 Tỷ lệ giống vi khuẩn (%) Hình 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành Khi tỷ lệ giống ban ñầu tăng lên, lượng axit lactic tạo thành tăng lên Tuy nhiên ñiều ñúng khoảng ñịnh, vượt ngưỡng giá trị, tăng tỷ lệ giống vi khuẩn không làm tăng lượng axit lactic tạo thành Lý với tỷ lệ giống lớn, vi khuẩn sử dụng ñường có dịch thủy phân ñể tăng sinh khối lượng axit lactic giảm theo Nếu lượng giống ban ñầu thấp so với lượng chất có môi trường lên men trình sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp axit lactic kéo dài thời gian lên men tạo số sản phẩm phụ không mong muốn rượu etylic, axit bay không kinh tế cho việc lên men quy mô công nghiệp Kết qủa thể ñồ thị cho thấy tỷ lệ giống vi khuẩn Lactobacillus casei cho vào thích hợp cho việc lên men tạo axit lactic 4% Sinh trưởng phát triển thuộc tính sở sinh Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 19 vật Sự sinh tổng hợp axit lactic Lactobacillus casei cao hay thấp phụ thuộc vào trình sinh trưởng sử dụng nguồn dinh dưỡng nhiều hay Tỷ lệ giống ban ñầu thích hợp giúp cho trình lên men sinh tổng hợp axit lactic tốt 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng Sunfat Mangan (MnSO4) Các thí nghiệm ñược tiến hành với ñiều kiện sau: nồng ñộ dịch ñường 5%; nhiệt ñộ 37 C; pH = 6; thời gian lên men 72h; tỷ lệ giống vi khuẩn Lactobacillus casei 4% Theo Archibald and Fridovich cộng [15] hàm lượng sunphat mangan thích hợp cho vi khuẩn Lactobacillus casei nằm khoảng 0,2g/l ñến 1,25g/l.Vì vậy, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng sunphat mangan ñến trình lên men lactic giá trị : 0g/l; 0,25g/l; 0,50g/l; 0,75g/l; 1g/l; 1,25g/l Kết ñược thể bảng 2.5 phụ lục biểu diễn ñồ thị hình 3.8 Hàm lượng axit lactic (g/l) 17.00 16.00 15.00 14.00 13.00 12.00 11.00 0.2 0.4 0.6 0.8 Lượng sunfat mangan (g/l) Footer Page 19 of 126 1.2 1.4 Header Page 20 of 126 20 Hình 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng MnSO4 ñến lượng axit lactic tạo thành Từ ñồ thị cho thấy lượng MnSO4 có ảnh hưởng quan trọng ñến tạo thành axit lactic vi khuẩn Lactobacillus casei Có thể thấy Lactobacillus casei sản xuất axit lactic cao có thêm hổ trợ 0,75 g/l MnSO4 Vậy việc bổ sung sunfat mangan (MnSO4) thật có hiệu Đây bước quan trọng ảnh hưởng lớn ñến hiệu suất trình lên men Vì thế, tiến hành bổ sung 0,75 g/l MnSO4 ñể sử dụng cho nghiên cứu 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường Các thí nghiệm ñược tiến hành với ñiều kiện sau: nhiệt ñộ 37 C; pH = 6; thời gian lên men 72h; tỷ lệ giống vi khuẩn Lactobacillus casei 4%;%; hàm lượng sunphat mangan cần bổ sung 0,75g/l; nồng ñộ dịch ñường thay ñổi từ 2% ñến 8% (g/100ml) Các kết ñược thể bảng 2.6 phụ lục biểu diễn ñồ thị hình 3.9 Hàm lượng axit lactic (g/l) 19.00 17.00 15.00 13.00 11.00 9.00 7.00 Nồng ñộ dịch ñường (%) Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 21 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo thành Trong ñiều kiện thí nghiệm, nguồn cacbon ñược cho vào dạng chủ yếu ñường ñơn khử Hàm lượng ñường ñược ñưa vào môi trường nuôi cấy với lượng thích hợp giúp chủng nghiên cứu sinh trưởng sinh tổng hợp tốt Ngược lại, lượng ñường thấp không ñủ nguồn cacbon cung cấp cho vi sinh vật phát triển lượng ñường cao tạo áp lực thẩm thấu môi trường làm ảnh hưởng ñến trạng thái sinh lý tế bào dẫn ñến hiệu suất trình không cao Thông qua ñồ thị cho thấy hàm lượng ñường dịch ñường thích hợp cho việc tạo axit lactic cao nồng ñộ ñường 6% (g/100ml) 3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men Quá trình lên men ñược thực nồng ñộ dịch ñường 5%; nhiệt ñộ 37 C; pH = 6; thời gian lên men 72h; tỷ lệ giống vi khuẩn Lactobacillus casei 4%; hàm lượng sunphat mangan cần bổ sung 0,75g/l Lấy mẫu theo khoảng thời gian ñịnh 8h, xác ñịnh khả sinh tổng hợp axit lactic chủng khảo sát thời ñiểm thời gian xác ñịnh ñó Các kết ñược thể bảng 2.7 phụ lục biểu diễn ñồ thị hình 3.10 Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 22 Hàm lượng axit lactic (g/l) 18.00 16.00 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 Thời gian lên men (h) Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit lactic tạo thành Chúng ñã xác ñịnh với thời gian 72 lượng axit lactic sinh cao Vi khuẩn lactobacillus casei ñược ñưa vào môi trường, chúng sử dụng dưỡng chất ñể sinh trưởng diễn qua giai ñoạn thích nghi, phát triển, cân suy vong Giai ñoạn ñầu chủng ñược nhân giống môi trường có thành phần giống thành phần môi trường lên men Quá trình phát triển tạo sinh khối nhiều ñồng thời tạo lượng axit lactic tăng tương ứng Như theo thời gian axit lactic tạo nhiều ñược biểu thị qua hàm lượng axit lactic tăng dần theo thời gian Tuy nhiên, thời gian dài axit lactic tăng mà quần thể ñạt bão hòa axit lactic giảm ñi ñáng kể chất môi trường giảm, môi trường không ñược ñiều chỉnh pH yếu tố theo thời gian kìm hãm phát triển tổng hợp lactic chủng ta nghiên cứu Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 23 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng ñồng thời hai yếu tố ñến trình lên men lactic Qua kết nghiên cứu ñơn biến ảnh hưởng yếu tố ñến trình lên men lactic: Tỷ lệ giống vi khuẩn Lactobacillus casei, lượng sunfat mangan cần bổ sung, nồng ñộ ñường glucoza, thời gian lên men Tuy nhiên trình lên men yếu tố tác ñộng phụ thuộc lẫn Vì thời gian ñiều kiện không cho phép nên nghiên cứu ảnh hưởng ñồng thời yếu tố: nồng ñộ dịch ñường tỷ lệ giống vi khuẩn Do ñó, ñể nâng cao hiệu suất trình lên men phải tìm mức thích hợp thông qua tối ưu hóa hai yếu tố 3.3.1 Lập ma trận quy hoạch thực nghiệm xác ñịnh hệ số phương trình 3.3.2 Kiểm ñịnh có nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student 3.3.3 Kiểm tra tương thích phương trình hồi quy 3.3.4 Tối ưu hóa thực nghiệm * Thí nghiệm kiểm chứng Để khẳng ñịnh lại kết trình tối ưu, tiến hành thực nghiệm kiểm chứng ñiều kiện tối ưu bảng 3.13 Lên men với nồng ñộ dịch ñường 6,2%; tỷ lệ giống vi khuẩn 4,6%; lên men nhiệt ñộ 370C thời gian 72 giờ, pH = 6, chế ñộ lắc ban ñầu Sau trình lên men, hàm lượng axit lactic tạo thành ñạt ñược gần 17,69 (g/l) Kết gần thỏa mãn giá trị tối ưu theo bảng 3.14 ñã tính Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Khảo sát ñược yếu tố công nghệ tối ưu cho trình thủy phân xenluloza rơm thành ñường glucoza phương pháp enzym: + Hàm lượng chất sử dụng 10g/l + Tỷ lệ enzym/cơ chất: 0,30ml/g + Thời gian thủy phân: 96 + Hàm lượng ñường khử tạo thành: 34g/l Từ ñó, xây dựng ñược quy trình kỹ thuật thủy phân xenluloza rơm quy mô phòng thí nghiệm Sau kiểm ñịnh có nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student kiểm tra tương thích phương trình hồi quy, xây dựng ñược phương trình phù hợp với số liệu thực nghiệm sau: y = 15,879 + 0,148x1 + 0,502x2 + 0.064x1x2 Trong ñó: x1 biến số mã hóa biến thực z1 (nồng ñộ dịch ñường) x2 biến số mã hóa biến thực z2 (tỷ lệ giống vi khuẩn) y hàm lượng axit lactic tạo thành (g/l) Xác ñịnh ñược ñiều kiện tối ưu lên men + Tỷ lệ giống vi khuẩn thêm vào trình lên men 4,6(%) + Hàm lượng Mangan sulfat (MnSO4) 0,75g/l Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 25 + Nồng ñộ dịch ñường lên men 6,2% + Thời gian lên men 72 + Hàm lượng axit lactic tạo thành ñạt ñến 17,69 g/l KIẾN NGHỊ Nếu tiếp tục nghiên cứu lên men axit lactic từ rơm lúa, ñề nghị ñược lên men ñiều kiện tối ưu hơn, tức có thiết bị lên men với suất nhỏ Từ kết thực nghiệm, mạnh dạn ñưa quy mô sản xuất axit lactic theo pilot Từ axit lactic tạo thành, tinh chế ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp khác Footer Page 25 of 126  ... dịch ñường lên men 6,2% + Thời gian lên men 72 + Hàm lượng axit lactic tạo thành ñạt ñến 17,69 g/l KIẾN NGHỊ Nếu tiếp tục nghiên cứu lên men axit lactic từ rơm lúa, ñề nghị ñược lên men ñiều kiện... tài Nghiên cứu trình lên men axit lactic từ rơm lúa việc làm cấp thiết Mục ñích nghiên cứu - Xác ñịnh thông số công nghệ tốt nồng ñộ dịch ñường, tỉ lệ giống vi khuẩn, thời gian lên men cho trình. .. lên men axit lactic dịch ñường ñã thủy phân Footer Page of 126 Header Page of 126 Phạm vi nghiên cứu - Lên men axit lactic từ rơm ñược thu nhận ñồng lúa Quế Xuân, Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam - Quá