Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA LECTIN TỪ HẠT ĐẬU ĐỎ TÂY (PHASEOLUS VULGAIS) VÀ ĐỀ XUẤT HƯỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Đồ uống Mã số : 60.54.02 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2011 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học:PG S T S.Trần Thị Xô Phản biện 1: GS.TS Đào Hùng Cường Phản biện 2: GS.TSKH Lê Văn Hoàng Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ k ỹ t h u ậ t họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng năm 2011 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin -Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Lectin glycoprotein có hoạt tính sinh học, có khả gắn kết với tế bào hồng cầu, tương tác có chọn lọc với saccharide Lectin ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nông nghiệp, sinh hóa, vi sinh vật học, tế bào học, miễn dịch học, y dược học… Lectin có khả gây ngưng kết với tế bào vi khuẩn, nấm men nấm mốc Do vậy, lectin từ ñậu tương (SBA) ốc sên (HPA) dùng ñể nhận dạng vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis (chủng khó phân biệt với chủng Bacillus khác) [13] Lectin ñược phân bố rộng rãi thực vật, ñộng vật vi sinh vật Lectin thu nhận từ nguồn khác có cấu trúc, trọng lượng phân tử thành phần hóa học ñặc tính sinh học khác Xuất phát từ lí trên, ñể ñi sâu vào nghiên cứu lectin họ ñậu chọn ñề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu chiết tách, khảo sát tính chất lectin từ hạt ñậu ñỏ tây (phaseolus vulgaris) ñề xuất hướng ứng dụng”, nhằm góp phần khai thác nguồn tài nguyên lectin phong phú từ nguồn thực vật Việt Nam MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Chiết tách lectin từ hạt ñậu ñỏ tây, tinh lectin - Khảo sát số tính chất lý hóa lectin - Đề xuất hướng ứng dụng ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Nguyên liệu hạt ñậu ñỏ tây - Tế bào hồng cầu người Footer Page of 126 Header Page of 126 - Nấm men bia - Nghiên cứu ñược thực quy mô phòng thí nghiệm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp xác ñịnh ñộ ẩm, phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein, phương pháp xác ñịnh hàm lượng gluxit tổng phương pháp Bertran, phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ lectin, phương pháp ñiện di gel polyacrylamide Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Khảo sát số thành phần hóa học hạt ñậu ñỏ tây mua ñịa bàn Đà Nẵng Khảo sát ñược hàm lượng lectin có ñậu ñỏ tây - Tăng thêm hiểu biết cấu tạo tính chất lectin họ ñậu Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Xây dựng qui trình chiết tách xác ñịnh tính chất lý hóa ñặc trưng lectin, từ ñó thu nhận lectin quy mô lớn ñể ñưa vào ứng dụng thực tế - Từ nguồn lectin ñã ñược nghiên cứu ñặc tính ñề xuất hướng ứng dụng khác CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Ngoài phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục luận văn ñược thành chương sau : Chương 1: Tổng quan Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Footer Page of 126 Header Page of 126 Chương TỔNG QUAN 1.1 LƯỢC SỬ VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LECTIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.1.1 Sơ lược lịch sử lectin 1.1.2 Tình hình nghiên cứu lectin giới Việt Nam 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu lectin giới 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu lectin Việt Nam 1.2 SỰ PHÂN BỐ LECTIN TRONG SINH GIỚI 1.2.1 Sự phân bố lectin thực vật Ở Việt Nam tính phổ biến lectin lần ñầu tiên ñược nghiên cứu vào năm 1983 Nguyễn Thị Thịnh cộng Kết nghiên cứu 90% loài ñậu Việt Nam có chứa lectin [11] 1.2.2 Sự phân bố lectin ñộng vật 1.2.3 Sự phân bố lectin vi sinh vật 1.3 TÍNH CHẤT CỦA LECTIN 1.3.1 Thành phần hóa học, cấu trúc khối lượng phân tử lectin 1.3.1.1 Thành phần hóa học Vậy lectin có chất protein, chủ yếu glycoprotein 1.3.1.2 Cấu trúc lectin Lectin loại protein nên lectin có cấu trúc bậc 1, 2, bậc protein thông thường khác Ngoài lectin có cấu trúc không gian ñơn giản, lectin có cấu trúc không gian phức Footer Page of 126 Header Page of 126 tạp ñều chứa trung tâm hoạt ñộng, ñây nơi liên kết với carbohydrate ñịnh hoạt ñộ lectin Theo tác giả Bourillon (1973) gốc acid amin tạo nên trung tâm hoạt ñộng, số ion kim loại tham gia hoạt ñộng lectin ion Mg2+, Mn2+ 1.3.1.3 Khối lượng phân tử lectin Lectin polyme sinh học, có khối lượng phân tử lớn, khối lượng phân tử dao ñộng phạm vi rộng từ hàng ngàn cho ñến hàng trăm ngàn Dalton [30] Lectin từ nguồn gốc thực vật có khối lượng phân tử bé lectin từ rễ Urtica dioica (họ gai Urticaceae), khoảng 8,5 kDa Lectin từ số thực vật ñã ñược xác ñịnh khối lượng phân tử lectin số loài mít chi Artocarpus có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa, lectin từ loài tảo ñỏ (Plumosa plumosa) có khối lượng phân tử 150 kDa [20] 1.3.2 Các tính chất ñặc trưng lectin 1.3.2.1 Tính tan lectin 1.3.2.2 Sự tương tác lectin với ñường Khả tương tác với ñường tính chất ñiển hình lectin Lectin liên kết với phân tử ñường ñơn lẫn gốc ñường nằm bề mặt tế bào Các loại ñường glucose, galactose, manose … có khả tương tác với nhiều loại lectin [20] Khả tương tác ñặc hiệu lectin - ñường ñã ñược ứng dụng nhiều nghiên cứu tế bào học, huyết học miễn dịch học 1.3.3 Đặc tính sinh học miễn dịch học lectin 1.3.3.1 Khả gây ngưng kết tế bào Footer Page of 126 Header Page of 126 1.3.3.2 Khả kích thích kìm hãm phân bào 1.3.3.3 Các ñịnh kháng nguyên nhận biết 1.4 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN Sử dụng lectin ñể phân loại nhóm máu ứng dụng sớm nhất, cho ñến ñược áp dụng rộng rãi Phương pháp xác ñịnh nhóm máu lectin cho kết nhanh, xác mà không cần dùng huyết mẫu Lectin ñược sử dụng công cụ chẩn ñoán có hiệu (dựa vào khả tác dụng ñặc hiệu lên số loại vi sinh vật), kết hợp với xét nghiệm thông thường khác ñể nâng cao giá trị chẩn ñoán bệnh Do bề mặt vi khuẩn mang gốc ñường, lectin kết hợp với vị trí liên kết tiềm này, thêm vào ñó tính ñặc hiệu khiến chúng trở thành công cụ hữu ích việc nhận dạng vi khuẩn [22] Do có khả liên kết với ñường hợp chất chứa ñường (thành phần cấu tạo quan trọng bề mặt tế bào), lectin có tiềm ứng dụng lớn sinh - y học Việc nghiên cứu lựa chọn lectin tương tác ñặc hiệu với loại vi khuẩn giúp ích việc ñịnh danh vi sinh vật 1.5 TỔNG QUAN VỀ ĐẬU ĐỎ TÂY Đặc tính thực vật: ñậu tây (Phaseolus vulgaris) thuộc họ thực vật Fabiaceae Cây thuộc loại thân thảo thấp hay dây leo Hàm lượng protein ñậu tây chiếm khoảng 17-23% trọng lượng chất khô [24] Footer Page of 126 Header Page of 126 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Nguyên liệu nghiên cứu hạt ñậu ñỏ tây (Phaseolus vulgaris) Thu mua Trung tâm Thương nghiệp, thành phố Đà Nẵng 2.1.2 Hóa chất Những hoá chất sử dụng nghiên cứu hoá chất có ñộ tinh khiết cao, sử dụng phân tích, ñược mua hãng Sigma, Merk Trung Quốc Các dụng cụ hóa chất thuộc trung tâm công nghệ sinh học môi trường thuộc ñại học Bách Khoa Đà Nẵng trung tâm y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng - Hồng cầu nhóm máu người khoa Huyết học, bệnh viện Đa Khoa Đà Nẵng cung cấp 2.1.3 Dụng cụ thiết bị Sử dụng dụng cụ thiết bị thuộc trung tâm công nghệ sinh học môi trường thuộc ñại học Bách Khoa Đà Nẵng trung tâm y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp xác ñịnh ñộ ẩm [14] 2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein 2.2.2.1 Xác ñịnh hàm lượng protein thô [14] 2.2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein tổng số phương pháp ño quang [6] Footer Page of 126 Header Page of 126 Xác ñịnh hàm lượng protein tổng số ño hấp thụ quang λ=280 λ=260 (nm) máy quang phổ kế hiệu UV (SmartSpecTM Plus Spectrophotometer - Bio Rad) Hàm lượng protein ñược tính theo công thức PC (pr) = (1,55*A280 - 0,77*A260)* D Trong ñó: (mg/ml) PC (pr): Nồng ñộ protein (mg/ml) A260, A280 : Độ hấp thụ quang mẫu λ = 260 (nm) λ = 280 (nm) D: Độ pha loãng dung dịch mẫu (lần) 2.2.3 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng gluxit tổng phương pháp Bertran 2.2.4 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ lectin [13] Hoạt ñộ lectin ñược xác ñịnh theo phương pháp ngưng kết hồng cầu Gebauer nhựa ñáy nhọn microtitter Cách tiến hành: Dùng micropipetter cho vào giếng nhựa microtitter 50 µl ñệm PBS pH 7,2 Lấy 50 µl mẫu thí nghiệm cho vào giếng thứ trộn ñều, lấy 50 µl ñưa vào giếng thứ hai trộn ñều, lại lấy 50 µl từ giếng thứ hai cho vào giếng thứ 3… cho ñến giếng thứ 10 (lấy 50 µl bỏ ñi) Như ta có nồng ñộ mẫu pha loãng 2n lần (n số giếng ñã pha loãng, ñây giếng thứ 10) Giếng thứ 11 12 mẫu ñược sử dụng làm mẫu ñối chứng Cho vào giếng nhựa 50 µl hồng cầu nhóm máu Hồng cầu nhóm máu trước sử dụng ñược rửa nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) từ 2-3 lần (ly tâm 3000 rpm/5’) pha loãng nồng ñộ 2-5% nước muối sinh lý Vậy tổng thể tích mẫu hồng cầu giếng 100 µl Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 10 Để yên nhựa chứa mẫu lectin hồng cầu nhiệt ñộ phòng từ 30 phút ñến giờ, tiến hành ñọc kết Kết ñược ñọc dựa ñối chiếu với giếng ñối chứng Giếng ñối chứng có tượng hồng cầu tụ gọn xuống ñáy giếng Giếng mà hồng cầu tạo lớp màng mỏng không tụ gọn xuống ñáy giếng chứng tỏ có tượng ngưng kết, nghĩa có hoạt tính lectin Kết ñọc giếng cuối có ngưng kết Hoạt tính gây ngưng kết ñược tính sau : - Hoạt ñộ chung (HĐC) lectin (viết tắt HAA) ñược xác ñịnh nghịch ñảo ñộ pha loãng lớn dịch lectin mà ñó có khả gây ngưng kết toàn lượng hồng cầu [28] HĐC (Đv/ml) = Trong ñó 2n V n số giếng hoạt tính lectin V : thể tích mẫu thí nghiệm (µl) - Hoạt ñộ riêng (HĐR): giá trị hoạt ñộ lectin mg protein HĐR (Đv/mgpr) = HĐC mgpr 2.2.5 Phương pháp chiết tách tinh lectin 2.2.6 Phương pháp ñiện di gel polyacrylamide [27] 2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC CỦA ION KIM LOẠI - LECTIN VÀ CÁC LOẠI ĐƯỜNG - LECTIN 2.3.1 Tương tác ion kim loại - lectin 2.3.2 Tương tác loại ñường - lectin Footer Page 10 of 126 12 Header Page 12 of 126 3.2 NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH LECTIN 3.2.1 Nghiên cứu phương pháp chiết tách Quá trình chiết tách ñược thực theo sơ ñồ sau: Bột ñậu ñỏ Hòa ñệm PBS (pH =7,2) Tỷ lệ bột ñậu: ñệm 1:5 Ly tâm lạnh (40C) 6000 vòng/ 15phút Cặn Dịch chiết protein thô Với mục tiêu khảo sát ñiều kiện chiết dịch lectin thô ñạt hiệu cao, tiến hành theo phương pháp khác nhau: Lấy lượng bột ñậu ñỏ (50g) hòa tan vào lượng ñệm (250ml) tiến hành chiết theo phương pháp khác nhau: - Phương pháp 1: Bột ñậu sau hòa ñệm tiến hành khuấy (30 phút) - Phương pháp 2: Bột ñậu sau hòa ñệm tiến hành siêu âm máy siêu âm (30 phút) - Phương pháp 3: Bột ñậu sau hòa ñệm tiến hành làm lạnh ñông - tan giá - lạnh ñông - tan giá Sau chiết tách dịch protein thô phương pháp trên, tiến hành xác ñịnh hàm lượng protein thô theo phương pháp ño quang mục (2.2.2.2) Kết thu ñược bảng 3.2 Footer Page 12 of 126 13 Header Page 13 of 126 Bảng 3.2: Hàm lượng protein dịch chiết thô Phương pháp Hàm lượng protein (mg/ml) 49,19 51,83 49,90 Hàm lượng protein thô thu nhận theo phương pháp cao sử dụng tác nhân vật lý sóng siêu âm có tác dụng phá vỡ tế bào nên protein ñược giải phóng nhiều Nhằm xác ñịnh hoạt ñộ lectin thu ñược theo phương pháp tiến hành thử khả ngưng kết với hồng cầu theo phương pháp ñược trình bày mục 2.2.4 Kết ñược thể bảng 3.3 Bảng 3.3: Hoạt ñộ lectin mẫu thu nhận theo phương pháp Nhóm HĐC (ñv/ml) HĐR (ñv/mgpr) máu 3 A 1280 2560 2560 26,02 49,39 51,3 B 1280 2560 2560 26,02 49,39 51,3 O 640 640 640 13,01 12,35 12,8 AB 2560 2560 2560 52,04 49,39 51,3 1- Mẫu thu ñược theo phương pháp 2- Mẫu thu ñược theo phương pháp 3- Mẫu thu ñược theo phương pháp Để so sánh hoạt ñộ chung lectin thu ñược mẫu xây dựng ñồ thị hình 3.2 3.3 Footer Page 13 of 126 14 Header Page 14 of 126 HĐC (ñv/ml) 3000 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2500 Mẫu 2000 Mẫu 1500 1280 Mẫu 1280 1000 640 640 640 500 A B O AB Nhóm máu Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hoạt ñộ chung mẫu HĐR (ñv/mg) dịch lectin thô 60 50 49.39 51.3 49.39 51.3 52.0449.39 51.3 40 Mẫu Mẫu 30 26.02 26.02 Mẫu 20 13.01 12.3512.8 10 A B O AB Nhóm máu Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn hoạt ñộ riêng mẫu dịch lectin thô Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 15 Kết cho thấy hoạt ñộ chung lectin mẫu thấp so với mẫu lại Trong ñó mẫu mẫu có hoạt ñộ chung ñối với ngưng kết nhóm máu Mẫu có HĐR thấp so với mẫu Mẫu có HĐR cao so với mẫu lại Qua chiết tách dịch lectin theo phương pháp cho thấy phương pháp ñạt hiệu suất chiết tách cao, nhiên phương pháp lại tiêu tốn nhiều thời gian nhiên liệu so với phương pháp Dựa vào kết thu ñược trên, chọn mẫu chiết tách theo phương pháp ñể thực nghiên cứu 3.2.2 Khảo sát tỷ lệ ñệm dùng ñể chiết Nhằm khảo sát tỷ lệ ñệm PBS dùng ñể chiết tách lectin ñạt hiệu cao tiến hành chiết tách lectin theo phương pháp ñã chọn phần sử dụng ñệm PBS (pH = 7,2) với mẫu 1,2,3 tương ứng theo tỷ lệ nguyên liệu ñệm khác 1:4; 1:5; 1:6 ñược chiết lượng bột ñậu 50g Sau chiết tách tiến hành xác ñịnh hàm lượng protein tổng hoạt ñộ lectin Kết thu ñược ñược biểu diễn ñồ thị hình 3.4 Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 16 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hoạt ñộ lectin mẫu với tỷ lệ ñệm chiết khác Kết hình 3.4 thấy lượng ñệm tăng lượng protein thu nhận ñược tăng theo Hàm lượng protein thu nhận ñược nhiều mẫu không lớn nhiều so với mẫu Đồ thị cho thấy hoạt ñộ riêng lectin mẫu lớn (49,911ñv/mgpr) so với mẫu lại Footer Page 16 of 126 17 Header Page 17 of 126 Trên sở so sánh hàm lượng protein tổng số hoạt ñộ lectin thu ñược theo tỷ lệ ñệm khảo sát khác nhận thấy sử dụng tỷ lệ bột ñậu ñỏ: ñệm PBS 1:5 cho hiệu chiết tách cao Vì chọn tỷ lệ ñệm dùng ñể chiết tách dịch protein lectin 1:5 ñể chiết tách 3.3 NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA LECTIN 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ lectin Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ lectin Nhiệt ñộ tối thích cho lectin hoạt ñộng khoảng 300C ÷ 400C Kết phù hợp với kết công bố số tác giả nghiên cứu lectin họ ñậu [1] Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 18 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ lectin Kết hình 3.6 cho thấy lectin ñậu ñỏ tây biểu hoạt ñộ cao vùng pH trung tính kiềm, pH = ÷ Trong khoảng pH hoạt ñộ cao 2560ñv/ml Theo kết nghiên cứu tác giả Trương Văn Châu lectin chiết tách từ hạt ñậu cove có khoảng pH tối thích ÷ 8, tương tự với kết thu nhận nghiên cứu Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ lectin 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại ñến hoạt ñộ lectin Bảng 3.4: Ảnh hưởng ion kim loại ñến hoạt ñộ lectin Muối Nồng ñộ kìm hãm Nồng ñộ kích thích BaCl2 - 0,25M CuSO4 - 0,0625M Mg(NO3)2 - 0,25M CaCO3 - 0,25M KCl - - Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 19 Ghi chú: dấu “-“ bảng biểu thị phản ứng không bị kìm hãm Từ kết thực nghiệm cho thấy muối KCl không ảnh hưởng ñến hoạt ñộ lectin Các loại muối lại, thành phần chúng có cation Ba2+, Cu2+, Mg2+, Ca2+ ñều có ảnh hưởng ñến hoạt ñộ lectin Sự có mặt ion làm tăng hoạt ñộ lectin Tuy nhiên khả kích thích cation Cu2+ mạnh nồng ñộ thấp 0,0625M ñã có tác dụng làm tăng hoạt ñộ lectin 3.3.4 Khảo sát tương tác ñặc hiệu với loại ñường Kết thu ñược bảng 3.5 Bảng 3.5: Tương tác ñặc hiệu ñường với loại lectin Tên loại ñường Nồng ñộ kìm hãm D - Glucose - D - Manose - D - Arabinose - Lactose - Saccharose - Ghi chú: - không kìm hãm Qua kết thu ñược thấy loại ñường sử dụng D-glucose, D-manose, D-arabinose, lactose, saccharose loại ñường có khả ức chế rõ rệt ñến hoạt ñộ lectin ñậu ñỏ tây Kết tương ñồng với nghiên cứu trước ñó lectin ñậu ñỏ tây không tương tác với loại ñường ñơn mà tương tác với oligosaccharide polysaccharide [20] Footer Page 19 of 126 20 Header Page 20 of 126 3.4 TINH SẠCH LECTIN ĐẬU ĐỎ TÂY Tiến hành tinh lectin thông qua sơ ñồ tinh lectin sau Bột ñậu ñỏ tây Chiết rút ñệm PBS, pH 7,2 tỉ lệ bột ñậu: ñệm PBS 1:5 Khuấy, siêu âm 30 phút; li tâm lạnh (4oC), 6000 vòng/phút Ly tâm lạnh (40C), 6000 vòng/ 15phút Cặn (bỏ) Dịch chiết protein thô chứa lectin Kết tủa protein etanol 96% (tỉ lệ dịch chiết: etanol 1:3, t = 30 phút, 40C) Dịch tủa protein Ly tâm lạnh (40C), 6000 vòng/ 15phút Dịch (bỏ) Thu tủa protein Hòa tan lại ñệm PBS (pH = 7,2) Chế phẩm lectin thô Chạy qua cột sắc ký Silicagel Chế phẩm lectin 3.4.1 Xử lý sơ mẫu thô Mẫu dịch lectin sau tiến hành sơ bước kết thu ñược có hàm lượng protein thô 22,03mg/ml hoạt ñộ lectin 2560ñv/ml Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 21 3.4.2 Tinh qua sắc ký qua cột Silicagel Dịch lectin thu ñược tiến hành tinh phương pháp sắc ký qua cột sắc ký có chứa hạt Silicagel Kích thước cột 1,7 x 20cm Pha ñộng ñược sử dụng ñệm PBS (pH =7,2) Trước cho mẫu vào chạy sắc ký cột ñã ñược cân với ñệm PBS (pH = 7,2) thời gian Quá trình sắc ký ñược tiến hành sau: - Lượng dịch lectin cho vào cột sắc ký 2ml Tốc ñộ dòng chảy 14ml/h Thể tích thu ñược phân ñoạn 1,4ml tương ứng với 30 giọt Sử dụng thu hồi tự ñộng (biofrac fraction collector) ñể tách phân ñoạn sau sắc ký Sau thu nhận, tiến hành ñánh giá hàm lượng protein tổng số phân ñoạn phương pháp ño quang ñã ñược trình bày mục 2.2.2.2 ñánh giá hoạt ñộ lectin cho phân ñoạn ñược tiến hành theo phương pháp ñược trình bày mục 2.2.4 Kết ñánh giá ñược biểu diễn theo ñồ thị hình 3.8 Footer Page 21 of 126 22 Đường biểu diễn hàm lượng protein hoạt ñộ lectin ñậu ñỏ tây 0.45 250 0.415 0.378 192.771 0.4 0.35 0.3 0.298 0.25 136.986 124.223 105.820 96.618 0.2 0.15 200 HĐR (ñv/mgpr) Hàm lượng protein (mg/ml) Header Page 22 of 126 150 100 75.471 0.1 50 0.05 00 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 phân ñoạn Hàm lượng Protein HĐR (ñv/mgpr) Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hoạt ñộ lectin ñậu ñỏ tây Hàm lượng protein bắt ñầu xuất phân ñoạn thứ 18 0,16mg/ml ñến phân ñoạn 37; xuất pic lớn ñạt ñỉnh phân ñoạn 20 với hàm lượng protein 0,415mg/ml Dựa vào kết phân tích hoạt ñộ lectin phân ñoạn cho thấy từ phân ñoạn 17 ñến phân ñoạn 20 hoạt ñộ lectin tăng lên theo chiều tăng protein ñạt ñến giá trị lớn phân ñoạn 20 với hoạt ñộ riêng 192,771ñv/mgpr Toàn kết thu ñược trình tinh chế protein ñược thể bảng 3.6 Footer Page 22 of 126 23 Header Page 23 of 126 Bảng 3.6: Tóm tắt kết chiết tách tinh chế lectin ñậu ñỏ tây Các giai ñoạn tinh chế Protein HĐC HĐR Độ (Đv/ml) (ñv/mgpr) (lần) 51,291 2560 49,911 1,00 22,030 2560 116,205 2,32 0,415 80 192,770 3,86 tổng số (mg/ml) Dịch chiết thô Dịch protein hòa tan sau tủa Dịch lectin sau sắc ký Dựa vào kết thu ñược thấy lectin thu ñược sau sắc ký qua cột Silicagel có ñộ cao gấp 3,86 lần so với dịch chiết thô ban ñầu 3.4.3 Điện di gel polyacrylamide Với mục ñích xác ñịnh khối lượng phân tử lectin thu ñược sau sắc ký tiến hành ñiện di mẫu lectin thu ñược phân ñoạn 20, 22, 24 gel polyacrylamide có SDS Kết ñiện di thể hình 3.9 Ghi chú: Dãy 1: protein tiêu chuẩn (markers) Dãy 2: dịch sau sắc ký phân ñoạn 20 Dãy 3: dịch sau sắc ký phân ñoạn 22 Dãy 4: dịch sau sắc ký phân ñoạn 24 Hình 3.9 : Ảnh kết ñiện di chế phẩm lectin gel polyacryamide Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 24 Theo tài liệu ñã ñược công bố [20] lectin ñậu ñỏ tây có khối lượng phân tử khoảng 25 ñến 30 kDa Kết phân tích ñiện di sản phẩm lectin thu nhận có băng protein 33,5kDa 22,19 kDa phù hợp với kết ñã ñược công bố Trong ba phân ñoạn ñiện di ñều có băng protein rõ nét với khối lượng 53,61kDa, lớn so với khối lượng phân tử lectin chiết tách từ ñậu ñỏ ñã ñược công bố, cần có nghiên cứu ñể làm rõ vai trò protein 3.5 ĐỀ XUẤT HƯỚNG ỨNG DỤNG Lectin ñược chiết tách từ ñậu tây theo nghiên cứu tác giả trước ñây, khả tương tác với monosaccharide mà tương tác với oligosaccharide polysaccharide [20] Do cấu tạo bề mặt màng tế bào vi khuẩn, nấm men ñều có chứa thành phần polysaccharide, ñây vị trí phản ứng tiềm lectin Kết nghiên cứu Bùi Phương Thuận khả tương tác lectin với tế bào loại vi khuẩn Salmonela, E.coli [13] Dựa sở ñó, tiến hành thử khả ngưng kết lectin chiết tách ñược từ ñậu ñỏ tây với tế bào nấm men Kết thu ñược tiến hành thử ngưng kết hình 3.10 Footer Page 24 of 126 25 Header Page 25 of 126 Hình 3.10: Tương tác lectin với tế bào nấm men Chú thích: Giếng thứ 1: có chứa dịch lectin thô - tế bào nấm men Giếng thứ 2: mẫu ñối chứng Giếng thứ ñã xuất kết tụ thành mảng lớn tế bào nấm men, ñiều ñó cho thấy lectin có khả ngưng kết mạnh với tế bào nấm men Giếng thứ tượng ngưng kết Kết thử nghiệm ñã cho thấy lectin có khả ngưng kết tế bào nấm men Vì dựa vào kết nghiên cứu trên, ñịnh hướng nghiên cứu ứng dụng lectin vào dịch lên men bia sau lên men nhằm mục ñích tạo kết tụ tế bào nấm men sau trình lên men ñể tăng hiệu suất trình lọc Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu rút số kết luận - Đã xác ñịnh ñược số thành phần hóa học hạt ñậu ñỏ tây - Qua nghiên cứu chiết tách lectin từ hạt ñậu ñỏ tây ñã xác ñịnh chiết tách lectin phương pháp siêu âm với tỷ lệ bột ñậu ñỏ tây: ñệm PBS (pH = 7,2) 1:5 ñạt hiệu chiết cao - Lectin ñậu ñỏ tây hoạt ñộng tốt khoảng nhiệt ñộ tối thích 30 ÷ 400C, pH tối thích ÷ Lectin hoạt ñộng tốt có mặt ion kim loại Ba2+, Cu2+, Mg2+, Ca2+ ñó Cu2+ làm tăng hoạt ñộ lectin mạnh - Lectin ñậu ñỏ tây không tương tác với loại ñường ñơn mà tương tác với oligosaccharide polysaccharide - Đã tinh ñược lectin chiết tách ñược phương pháp sắc ký cột Silicagel xác ñịnh ñược khối lượng phân tử lectin phương pháp ñiện di 33,5kDa 22,19kDa - Đề xuất ñược hướng ứng dụng lectin trình sản xuất có giai ñoạn lên men nấm men, dựa nghiên cứu lectin có khả ngưng kết với tế bào nấm men B KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng lectin vào trình sản xuất bia nhằm tăng hiệu suất trình lọc Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tiến hành thử nghiệm lectin ñến chất lượng sản phẩm bia - Nghiên cứu ứng dụng lectin ñậu ñỏ tây việc nhận dạng chủng vi khuẩn gây ngộ ñộc thực phẩm Salmonela, Escherichia coli dựa sở lectin có khả ngưng kết tế bào vi khuẩn Footer Page 26 of 126 ... trên, ñể ñi sâu vào nghiên cứu lectin họ ñậu chọn ñề tài nghiên cứu: Nghiên cứu chiết tách, khảo sát tính chất lectin từ hạt ñậu ñỏ tây (phaseolus vulgaris) ñề xuất hướng ứng dụng , nhằm góp... nguyên lectin phong phú từ nguồn thực vật Việt Nam MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Chiết tách lectin từ hạt ñậu ñỏ tây, tinh lectin - Khảo sát số tính chất lý hóa lectin - Đề xuất hướng ứng dụng ĐỐI TƯỢNG VÀ... lượng phân tử lectin chiết tách từ ñậu ñỏ ñã ñược công bố, cần có nghiên cứu ñể làm rõ vai trò protein 3.5 ĐỀ XUẤT HƯỚNG ỨNG DỤNG Lectin ñược chiết tách từ ñậu tây theo nghiên cứu tác giả trước