kffj I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN KHOA SINH HC o0o Lờ Th Liờn NGHIấN CU TC DNG CA DCH CHIT H TH ễ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LấN KH NNG SINH TNG HP MELANINE MC IN VITRO V IN VIVO LUN VN THC S KHOA HC H Ni 2016 I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN KHOA SINH HC Lấ TH LIấN NGHIấN CU TC DNG CA DCH CHIT H TH ễ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LấN KH NNG SINH TNG HP MELANINE MC IN-VITRO V IN-VIVO Chuyờn ngnh : Sinh hc thc nghim Mó s : 60420114 LUN VN THC S KHOA HC NGI HNG DN KHOA HC TS NGUYN èNH THNG H Ni 2016 LI CM N Hon thnh ti nghiờn cu ny, tụi xin by t lũng bit n sõu sc ti TS Nguyn ỡnh Thng ó tn tỡnh ch bo, hng dn, giỳp v ng viờn tụi sut quỏ trỡnh hc v nghiờn cu Tụi xin by t lũng bit n ti cỏc thy, cụ giỏo thuc Khoa Sinh hc, Trng i hc Khoa hc T nhiờn, c bit l cỏc thy, cụ giỏo thuc chuyờn ngnh Sinh hc thc nghim ó truyn t cho tụi nhng kin thc quý bỏu sut thi gian hc v nghiờn cu lun ny Tụi cng xin gi li cm n chõn thnh ti cỏc cỏn b, sinh viờn Phũng Sinh hc Nano v ng dng v phũng Ung th thc nghim - thuc Phũng Thớ nghim trng im Cụng ngh Enzym v Protein nhng ngi ó giỳp tụi rt nhiu tụi cú th hon thnh ti nghiờn cu ny Tụi cng gi li cm n ti ti mang mó s KLEPT-14-02 vỡ ó h tr kinh phớ cho cỏc nghiờn cu lun ny Cui cựng, tụi xin gi li cm n n gia ỡnh, bn bố, nhng ngi ó to cho tụi iu kin tt nht hon thnh ti nghiờn cu ny H Ni, ngy 29 thỏng nm 2016 Hc viờn Lờ Th Liờn MC LC M U CHNG TNG QUAN 1.1 Mụ hỡnh nghiờn cu 1.1.1 Mụ hỡnh nghiờn cu in vitro .2 1.1.2 Mụ hỡnh nghiờn cu in vivo 1.2 H th ụ (Polygonum multiflorum) 1.2.1 c im chung 1.2.2 Tỏc dng h th ụ y hc .4 1.2.3 Mt s nghiờn cu trờn th gii 1.3 Melanin 1.3.1 Gii thiu v melanin 1.3.2 Melanocyte 1.3.3 Melanosome .7 1.3.4 C s húa sinh ca quỏ trỡnh tng hp melanin 1.3.5 C s di truyn ca quỏ trỡnh tng hp melanin 1.3.6 Con ng tớn hiu iu hũa sinh tng hp melanin 1.3.7 Cỏc ch th phõn t xỏc nh mc biu hin melanin 10 1.4 S hỡnh thnh sc t melanin s sinh trng ca cỏ nga 11 1.4.1 Cỏ nga 11 1.4.2 S hỡnh thnh sc t melanin quỏ trỡnh phỏt trin ca cỏ nga 14 CHNG 2: I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 17 2.1 Vt liu 17 2.1.1 i tng nghiờn cu .17 2.1.2 Húa cht 17 2.1.3 Thit b .18 2.1.4 Dng c v vt t tiờu hao 18 2.2 Ni dung v phng phỏp nghiờn cu 18 2.2.1 Tỏch chit h th ụ 18 2.2.2 Kho sỏt tỏc dng ca cỏc dch chit lờn kh nng sinh tng hp melanin mc in vitro 20 2.2.3 Kho sỏt tỏc dng ca cỏc dch chit lờn kh nng sinh tng hp melanin mc in vivo 25 CHNG 3: KT QU V THO LUN 29 3.1 Tỏch chit h th ụ 29 3.2 Kt qu nghiờn cu in vitro 29 3.2.1 Kt qu hot húa v nhõn nuụi t bo 29 3.2.2 c tớnh ca cao dch chit h th ụ i vi s sinh trng ca t bo SK-MEL-28 30 3.2.3 nh hng ca cao dch chit lờn s tng sinh tng hp melanin ca cỏc t bo SK-MEL-28 32 3.2.4 Con ng tỏc dng ca cao dch chit HTO lờn s tng hp melanin .34 3.3 Kt qu in vivo 41 3.3.1 Th c tớnh ca methanol lờn s phỏt trin ca phụi cỏ nga 41 3.3.2 Th c tớnh ca dch chit ca h th ụ methanol lờn s phỏt trin ca phụi cỏ nga .45 3.3.3 ỏnh giỏ kh nng tng sinh tng hp melanin ca dch chit h th ụ methanol lờn cỏ nga mc phiờn mó 48 KT LUN 52 KIN NGH 53 TI LIU THAM KHO 54 DANH MC BNG Bng 1.1 c im ni bt ca cỏc thi kỡ phỏt trin ca phụi cỏ nga 13 Bng 2.1 Húa cht s dng nghiờn cu 17 Bng 2.2 Thit b s dng nghiờn cu 18 Bng 2.3 Dng c v vt t tiờu hao nghiờn cu 18 Bng 2.4 Cỏc on mi c hiu s dng thớ nghim 24 Bng 2.5 Cỏc thnh phn phn ng PCR nghớ nghim in vitro 24 Bng 2.6 Cỏc c im gõy cht quỏ trỡnh phi nhim phụi 26 Bng 2.7 Trỡnh t cp mi khuch i on gen ef1 26 Bng 2.8 Cỏc thnh phn ca phn ng PCR thớ nghim vi vitro 27 Bng 2.9 Trỡnh t cp mi khuch i on gen mitf 27 Bng 2.10 Trỡnh t cp mi khuch i on gen tyrosinase 28 Bng 3.1 Khi lng cỏc cao dch chit thu c t bt khụ r HTO 29 Bng 3.2 Kt qu o nanodrop ca RNA tng s tỏch c t t bo 35 Bng 3.3 Di nng methanol dựng th c tớnh lờn phụi cỏ nga 41 Bng 3.4 Bng thng kờ d dng gõy bi methanol 42 Bng 3.5 Di nng dch chit h th ụ methanol dựng th c tớnh lờn phụi cỏ nga 45 Bng 3.6 Bng thng kờ d dng gõy bi dch chit h th ụ methanol 46 Bng 3.7 Mụi trng phi nhim phụi cỏ nga dựng cho thớ nghim th hot tớnh 48 Bng 3.8 Kt qu tinh sch ARN tng s 48 Bng 3.9 Kt qu tng hp cADN 49 DANH MC HèNH Hỡnh 1.1 Cõy v c h th ụ .3 Hỡnh 1.2 Cụng thc húa hc ca eumelanin v pheomelanin Hỡnh 1.3 Chui phn ng tng hp melanin .7 Hỡnh 1.4 Con ng tớn hiu iu khin quỏ trỡnh sinh tng hp melanin .9 Hỡnh 1.5 Cỏc giai on phỏt trin ca phụi cỏ nga 14 Hỡnh 2.1 Hỡnh nh t bo SK-MEL-28 20 Hỡnh 2.2 Chu trỡnh nhit PCR 27 Hỡnh 3.1 T bo SK-MEL-28 (sau 24h hot húa) .30 Hỡnh 3.2 T bo sau b sung cao dch chit HTO cỏc nng khỏc 31 Hỡnh 3.3 Biu ỏnh giỏ c tớnh HTO 31 Hỡnh 3.4 T bo sn sinh melanin ni bo v ngoi bo 33 Hỡnh 3.5 S khỏc bit v hm lng melanin sinh i vi cỏc nng dch chit HTO khỏc 33 Hỡnh 3.6 Biu ỏnh giỏ hm lng melanin tng s 34 Hỡnh 3.7 Mc biu hin ca gene gi nh GAPDH ca cDNA cỏc mu t bo melanoma 36 Hỡnh 3.8 Mc biu hin ca gene MC1R ca cDNA cỏc mu t bo melanoma 37 Hỡnh 3.9 Mc biu hin ca gene MITF (A) v tyrosinase (B) ca cDNA cỏc mu t bo melanoma .38 Hỡnh 3.10 Mc biu hin ca gene Nras (120bp) ca cDNA cỏc mu t bo melanoma .39 Hỡnh 3.11 Mc biu hin ca gene ERK ca cDNA cỏc mu t bo melanoma .40 Hỡnh 3.12 Mt s d dng quan sỏt c phi nhim bng methanol 43 Hỡnh 3.13 Biu biu din t l sng sút v t l d dng phi nhim bng methanol phụi (u th) cỏ nga bn ngy tui 44 Hỡnh 3.14 Mt s d dng quan sỏt c phi nhim bng dch chit h th ụ methanol .46 Hỡnh 3.15 Biu biu din t l sng sút v t l d dng phi nhim bng dch chit h th ụ methanol phụi (u th) cỏ nga bn ngy tui 47 Hỡnh 3.16 Kt qu in di v phõn tớch hỡnh nh in di Chỳ thớch: A Gen ef1 B Gen mitf C Gen tyrosinase 50 DANH MC CH VIT TT ARN cADN : Acid ribonucleic : Complement acid deoxyribonucleic cAMP : Cyclic adenosine monophosphate CREB : response element-binding protein cAMP C DMEM (protein bỏm vựng ỏp ng cAMP) : i chng : Dulbeccos Modified Eagle Medium DOPA : Dihydroxyphenylalanine dpf : Day post fertilisation (ngy sau th tinh) ef1 : Elongation factor alpha (nhõn t kộo di alpha) ERK EtAc : extracellular -signal -regulated kinases : Ethyl acetate Fw HTO mc1r MC1R MeOH : Forward Primer (Mi xuụi) : H th ụ : Melanocortin receptor : Melanocortin-1-receptor : Methanol MT NC n-hex OD OECD PBS Rv : Microphthalmia-associated transcription factor (nhõn t phiờn mó liờn kt vi microphthalmia) : Mụi trng : i chng : n-hexane : Mt quang : Organisation for Economic Co-operation and Development : Phosphate buffered saline : everse primer (Mi ngc) PCR PKA SDS TRP1 TRP2 UV -MSH : Polymerase Chain Reaction (phn ng nhõn gen) : Protein kinase A : Sodium dodecyl sulphate : Tyrosinase-related protein : Tyrosinase-related protein : Tia cc tớm : -Melanocyte-stimulating hormone mitf Lun Thc s Lờ Th Liờn M U Melanin l mt loi sc t mu nõu hoc en, c tỡm thy rt nhiu cỏc sinh vt sng, t nm, thc vt n ng vt cú vỳ Nú cú chc nng khỏc tt c cỏc sinh vt [13] ngi, melanin l yu t quyt nh chớnh ca mu da, mu túc Melanin cng c tỡm thy cỏc mụ sc t nm bờn di trũng en ca mt, t bo thn kinh v sc t mang cỏc khu vc ca nóo, chng hn nh cỏc locus coeruleus v cht en [43] Ri lon tng hp hoc ng truyn dn melanin c xem l nguyờn nhõn chớnh gõy hin tng túc b nht mu, nỏm, tn nhang, m nõu v sm da S ri lon sc t melanin c gõy bi rt nhiu nguyờn nhõn, bao gm: yu t ni sinh (do di truyn) v yu t ngoi sinh (ch dinh dng khụng hp lý, thng xuyờn thc khuya, hỳt thuc lỏ, b stress, sc tõm lý, tia UV ) [52] thi im hin ti, cha cú mt s liu thng kờ c th no v t l bnh nhõn b bc túc sm, nỏkm, tn nhang, sm da v cng cha cú nhiu nghiờn cu chuyờn sõu v melanin v c ch sinh tng hp melanin t ú tỡm cỏc phng phỏp iu tr [52] Ngy nay, vic cha bnh bng cỏc dc liu cú ngun gc t nhiờn ang c cỏc nh khoa hc quan tõm v nghiờn cu T lõu, ngun dc liu cú sn t nhiờn ny c dõn gian s dng lm thuc iu tr nhiu loi bnh, chng hn nh bnh tim, hen suyn, ho, thp khp, tiu ng, v cho thy cú nhng kt qu kh quan [3] Bờn cnh ú, nhiu kt qu nghiờn cu cho thy rng, cỏc loi thuc cú ngun gc tho dc ớt cú tỏc hi i vi sc khe ngi, ú thuc tng hp húa hc li rt d gõy cỏc tỏc dng ph khụng mong mun [3] Cỏc nc phng ụng, c bit l Vit Nam, nm khu vc nhit i giú núng m quanh nm, vy m h thng thc vt tng i a dng v phong phỳ, to iu kin thun li cho vic phỏt trin thuc cha bnh t cỏc loi tho dc Theo kinh nghim dõn gian, ụng cha ta ó bit dựng h th ụ cha bc túc sm H th ụ cú nh hng n quỏ trỡnh sinh tng hp melanin tr li cõu hi ny, chỳng tụi chỳng tụi thc hin ti: Nghiờn cu tỏc dng ca dch chit h th ụ (Polygonum multiflorum) lờn kh nng psinh tng hp melanin mc in vitro v in vivo vi mc ớch: Phõn tớch nh hng ca cỏc dch chit h th ụ lờn kh nng tng sinh tng hp ca melanin trờn mụ hỡnh t bo v mụ hỡnh phụi cỏ nga Lun Thc s Lờ Th Liờn CHNG TNG QUAN 1.1 Mụ hỡnh nghiờn cu 1.1.1 Mụ hỡnh nghiờn cu in vitro th nghim trờn t bo Phng phỏp nghiờn cu sinh hc thc nghim cho phộp ngi nghiờn cu s dng thnh phn, hay b phn ca mt sinh vt (thng quy mụ t bo hay vi khun) di dng cụ lp c mụi trng thụng thng ca nú, cú th nghiờn cu v phõn tớch chi tit hn trc thc hin trờn sinh vt sng Núi cỏch khỏc, õy l th nghim thng c gi l "thớ nghim ng nghim" [54] Viờ c cac tờ bao ụ ng võ t co thờ nuụi cõ y , tri s tng sinh cac chai , ia cang dờ dang hn cac phong thi nghiờ m a m hng i mi quan trng cụng cuụ c tim kiờ m cac hoa t chõ t co vai trũ quan tr ng lnh vc y hc Cú th thy c cỏc u im ca mụ hỡnh nghiờn c u la kha nng t ụ ng húa cao , rut ngn c thi gian nghiờn cu v cho phộp quan sỏt tr c tip din biờ n tra ng thai bờ nh li cua tờ bao ng thi, nh nghiờn cu cú th thao tỏc cựng luc trờn nhiu dũng t bo khỏc , nhiờ u h p chõ t khac vi dai nụ ng ụ rụ ng Tuy nhiờn, mụ hinh co nh c iờ m l tng tỏc gia cỏc t bo vi hp chõ t chi theo mụ t chiờ u , thiờ u i s tng tac gia cac tờ bao vi hờ miờn dich cung nh cua hờ miờn dich vi chõ t th nghiờ m ; iờ u kiờ n lam viờ c phai hoan toan vụ trựng ũi hi ki thuõ t va kinh nghiờ m cao cua ngi lam thi nghiờ m , chi phi cho thi nghiờ m t tiờ n 1.1.2 Mụ hỡnh nghiờn cu in vivo th nghim trờn cỏ nga Phng phỏp in vivo c dựng ch nhng thớ nghim dựng cỏc mụ sng hay ton b c th cũn sng lm i tng th nghim Cỏc phng phỏp in vivo khỏc vi in vitro (thớ nghim ngoi c th sng, th nghim ng nghim) v cỏc thớ nghim trờn cỏc mụ hay c th ó cht Thụng thng, núi n in vivo, ngi ta thng ngh n cỏc thớ nghim, th nghim trờn i tng l sinh vt sng Cỏc thớ nghim s dng ng vt hay cỏc th nghim lõm sng trờn ngi l vớ d ca nghiờn cu in vivo [55] Mụ hin h in vivo cú u im ni bt l ỏnh giỏ c chớnh xỏc tỏc ng ca thuụ c lờn co thờ sinh võ t co õ y u s tng tac cua yờ u tụ : chõ t th nghiờ m va hờ miờn dich cua i tng th nghim Lun Thc s Lờ Th Liờn hong, tn thng liờn quan n mch mỏu v hoi t (hỡnh 3.12B, 3.12C, 3.12D) T nhng kt qu phõn tớch trờn, cú th kt lun rng, mc gõy d dng ca methanol ph thuc vo nng v thi gian phi nhim Mt cht c coi l tỏc nhõn gõy quỏi thai t s TI (LC50/EC50) > [47] T nhng s liu thu c, cỏc giỏ tr LC50 v EC50 u th cỏ nga ngy sau th tinh cng c tớnh toỏn v kt qu l: LC50 (4dpf) = 2,128 %v/v; EC50 (4dpf) = 1,821 %v/v Nh vy, methanol l cht gõy quỏi thai u th cỏ nga ngy tui (TI = 1,17) Sau thớ nghim th c tớnh vi methanol, chung tụi thu c kt qu cc k quan trng: Vi nng 0,75% v/v tr xung, methanol hon ton khụng gõy nh hng lờn quỏ trỡnh sinh trng ca phụi cỏ nga Kt qu ny c s dng cho thớ nghim tip theo 3.3.2 Th c tớnh ca dch chit ca h th ụ methanol lờn s phỏt trin ca phụi cỏ nga ỏnh giỏ mt cỏch chớnh xỏc nh hng ca dch chit h th ụ methanol lờn s sinh trng ca phụi cỏ nga vn, chỳng tụi s dng methanol nng 0,75% hũa tan cao dch chit h th ụ, m bo rng methanol khụng lm nh hng n phụi cỏ nga Tng t nh methanol, th c tớnh dch chit h th ụ, chung tụi ó tin hnh cỏc thớ nghim s b thu hp nng v cui cựng th c tớnh vi di nng cho bng 3.5 Bng 3.5 Di nng dch chit h th ụ methanol dựng th c tớnh lờn phụi cỏ nga Nng Dch chit h th ụ (mg/l) 135 175 225 295 385 500 650 845 Sau phi nhim cỏ nga vi mụi trng cú cha dch chit h th ụ, ngoi cỏc d dng quan sỏt c nh phi nhim methanol, cũn xut hin kiu hỡnh thõn d thng: uụi cong (hỡnh 3.14B, 3.14D, 3.14F, 3.14G) 45 Lun Thc s Lờ Th Liờn Bng 3.6 Bng thng kờ d dng gõy bi dch chit h th ụ methanol D dng Ngy th nht Ngy th hai + Phự mng noón hong Phự mng bao tim Tn thng liờn quan n mch mỏu Hoi t uụi cong Ngy th ba + + Ngy th t + + + + + + + + Hỡnh 3.14 Mt s d dng quan sỏt c phi nhim bng dch chit h th ụ methanol Chỳ thớch: e phự n (phự mng noón hon/bao tim); h tn thng liờn quan n mch mỏu; n hoi t; t cong uụi 46 Lun Thc s Lờ Th Liờn Phõn tớch s liu thng kờ v s lng cỏ th sng sút v d dng phụi (u th) cỏ nga ngy tui ta cú biu sau: Hỡnh 3.15 Biu biu din t l sng sút v t l d dng phi nhim bng dch chit h th ụ methanol phụi (u th) cỏ nga bn ngy tui Chỳ thớch: T l sng sút T l d dng Khi phi nhim phụi cỏ nga bng dch chit h th ụ methanol, chung tụi thu c kt qu tng t nh phi nhim bng methanol: Mc d dng ph thuc cht ch vo nng v thi gian phi nhim Tuy nhiờn, dch chit h th ụ cú cha hn hp cỏc cht cú lng phõn t ln, vic chuyn khú khn hn so vi methanol, ú m d dng xut hin mun hn õy, vo ngy th hai, phụi cỏ nga bt u cú nhng bin i bt thng: phự mng noón hong v t ngy th ba tr i, cỏc c im d thng khỏc mi xut hin (bng 3.6) Mc d dng tng dn theo thi gian phi nhim cũn biu hin rừ trờn hỡnh Ti nng 385 mg/l v 500 mg/l, ngy th t, mc phự mng bao tim tng lờn rừ rt (hỡnh 3.14C, 3.14D, 3.14F, 3.14G) T biu hỡnh 3.15, chỳng tụi thy rng, 135 mg/l l nng an ton, ti õy, cỏ nga sinh trng hon ton bỡnh thng T nng ln hn 175 mg/l ó bt u xut hin d dng, vy t nng 385 mg/l tr lờn, phụi (u th) cỏ nga mi b cht Giỏ tr LC50, EC50, EC10 ca u th cỏ nga ngy tui th bng dch chit h th ụ c tớnh toỏn v kt qu ln lt l: 456 mg/l; 400 47 Lun Thc s Lờ Th Liờn mg/l v 245 mg/l Nh vy, dch chit h th ụ methanol cng c coi l mt tỏc nhõn gõy quỏi thai cỏ nga ngy tui (TI = 1,14) Sau th c tớnh ca dch chit h th ụ methanol lờn s sinh trng ca phụi cỏ nga vn, chỳng tụi la chn cỏc nng di giỏ tr EC10 (l nng m ti ú 10% s lng cỏ th b d dng) ỏnh giỏ hot tớnh tng sinh tng hp melanin cỏ nga 3.3.3 ỏnh giỏ kh nng tng sinh tng hp melanin ca dch chit h th ụ methanol lờn cỏ nga mc phiờn mó Da vo kt qu thu c t thớ nghim th c tớnh ca dch chit h th ụ methanol lờn cỏ nga vn, chỳng tụi tin hnh phi nhim phi nhim cỏ nga mụi trng cú cha dch chit h th ụ methanol vi cỏc nng khỏc c cho di bng 3.7 Bng 3.7 Mụi trng phi nhim phụi cỏ nga dựng cho thớ nghim th hot tớnh Mu Mụi trng Nng E3 MeOH 0,75% v/v HTO/ (0,75% MeOH) 135 mg/l HTO/ ( 0,75% MeOH) 225 mg/l Sau ngy phi nhim, chỳng tụi tin hnh thu mu, tinh sch v o hm lng ARN tng s Kt qu c trỡnh by bng 3.8 Bng 3.8 Kt qu tinh sch ARN tng s Mu Nng (ng/àl) A260/280 235,5 1,91 79,9 1,85 22,8 1,78 45 1,93 48 Lun Thc s Lờ Th Liờn T kt qu bng trờn, ta thy rng, tinh sch ca ARN khỏ cao, hon ton iu kin tin hnh phn ng tng hp cADN Tip theo, chỳng tụi tng hp cADN t lng ARN thu c v kt qu c th hin bng 3.9 Bng 3.9 Kt qu tng hp cADN Mu Nng (ng/àl) A260/280 3856,7 1,63 3077,6 1,61 1826,3 1,55 2124,0 1,01 Theo bng 3.9, ta thy rng nng cADN thu c rt cao, iu kin tin hnh phn ng PCR khuch i cỏc on gen mong mun Sau thc hin phn ng nhõn gen, chung tụi in di sn phm trờn gel 1,5 % kim tra mc biu hin ca cỏc gen ef1, mitf v tyrosinase vi cỏc cp mi c hiu Kt qu hỡnh nh ca cỏc bng in di c biu hin nh hỡnh 3.16a Cỏc bng c phõn tớch nh lng bng phn mm ImageJ v c trỡnh by nh hỡnh 3.16b a) 49 Lun Thc s Lờ Th Liờn b) Hỡnh 3.16 Kt qu in di v phõn tớch hỡnh nh in di Chỳ thớch: A Gen ef1 Mu i chng õm B Gen mitf C Gen tyrosinase Mu cỏ phi nhim mụi trng E3 Mu cỏ phi nhim mụi trng cha 0,75% methanol Mu cỏ phi nhim mụi trng cha 135 mg/l HTO/0,75% methanol Mu cỏ phi nhim mụi trng cha 225 mg/l HTO/0,75% methanol T nh in di thu c, ta thy rng cỏc bng ef1, mitf v tyrosinase lờn ung kớch thc (ef1: 202 bp, mitf: 176 bp, tyrosinase: 192 bp), iu ny chng t rng chung tụi ó khuch i thnh cụng cỏc on genquan tõm Trong thớ nghim ny, chỳng tụi s dng ef1, l mt gen qun gia, lm chun so sỏnh mc biu hin cỏc gen mitf v tyrosinase cỏc mu cỏ nga phi nhim vi mụi trng cú b sung v khụng b sung dch chit h th ụ Gen qun gia l gen biu hin mc nh mi t bo, mụ v c quan ti mi thi im Do ú, cú th da vo mc biu hin nh ca ef1 ỏnh giỏ s biu hin ca gen mitf v tyrosinase Nhỡn vo hỡnh nh in di, ta thy rng, sỏng ca cỏc bng ef1 cỏc mu l tng i bng (hỡnh 3.16a-A) Trong ú, vi lng mu tng ng, cỏc bng mitf cỏc ging cú sỏng khỏc (hỡnh 3.16a-B) ging 3, sỏng ca bng m hn cỏc ging cũn li Kt qu ny l phự hp ging v l mu cỏ nga c phi nhim mụi trng khụng b sung h th ụ, ging v 5, cỏ nga c phi nhim vi mụi trng cú cha dch chit h th ụ methanol vi nng tng 50 Lun Thc s Lờ Th Liờn dn Tng t nh vy, hỡnh 3.16a-C, ging v hu nh khụng lờn bng, cỏc ging v 5, bng lờn khỏ rừ rng iu ny cú th c gii thớch dch chit h th ụ methanol ó tỏc ng lm tng biu hin tyrosinase ng thi nh lng bng phn mm phõn tớch hỡnh nh bng in di, ging v cú hm lng ef1 khỏ ln (9,30; 11,57) v hm lng ny gim dn cỏc ging 4, (hỡnh 3.16b-A) thỡ vi gen mitf v tyrosinase, hm lng tng dn cỏc ging 4, so vi ging v ging (hỡnh 3.16b-B, hỡnh 3.16b-C) T nhng phõn tớch trờn õy, chung tụi kt lun rng, dch chit h th ụ methanol cú kh nng lm tng biu hin mitf v tyrosinase mc phiờn mó 51 Lun Thc s Lờ Th Liờn KT LUN T nhng kt qu thu c trờn õy, chung tụi rut mt s kt lun nh sau: ó chng minh c rng cao dch chit h th ụ methanol cú kh nng kớch thớch s tng sinh tng hp melanin ca cỏc t bo melanoma SKMEL-28 nng < 5000àg/ml thụng qua cú th bng ng MAPK/ MITF/ tyrosinase Dch chit h th ụ methanol cú kh nng gõy d dng phụi (u th) cỏ nga bn ngy tui (giỏ tr LC50 = 456 mg/l) Bc u nhn thy kh nng kớch thớch tng sinh tng hp melanin cỏ nga ca dch chit h th ụ methanol thụng qua s lm tng biu hin ca cỏc phõn t mitf v tyrosinase mc phiờn mó 52 Lun Thc s Lờ Th Liờn KIN NGH Vi nhng kt qu thu c, chung tụi xin a mt s hng nghiờn cu tip theo nh sau: Tỏch, tinh sch cỏc cht cú cao dch chit methanol ca h th ụ bng sc ký lng hiu nng cao (HPLC) Thc hin cỏc thớ nghim xỏc nh cỏc cht cú cao dch chit h th ụ cú nh hng trc tip n s tng hp melanin ca t bo SKMEL-28 v melanocyte Tip tc tỡm hiu sõu hn v c ch phõn t tỏc dng ca cao dch chit h th ụ lờn kh nng tng sinh tng hp melanin ca cỏc t bo sinh sc t Kho sỏt s nh hng ca cao dch chit h th ụ lờn s biu hin ca mt cú gen khỏc cng úng vai trũ quan trng cỏc ng iu hũa sinh tng hp melanin cỏ nga nh mc1r, dct, Nras, Erk, ỏnh giỏ s nh hng ca cao dch chit h th ụ lờn s biu hin mc dch mó (protein) ca cỏc phõn t mitf, tyrosinase, mc1r, dct, ỏnh giỏ tỏc dng ca cao dch chit h th ụ lờn kh nng tng sinh melanin trờn cỏc mụ hỡnh ng vt khỏc 53 Lun Thc s Lờ Th Liờn TI LIU THAM KHO Ting Vit Tt Li (2004), Nhng cõy thuc v ng vt lm thuc Vit Nam, NXB Y hc H Ni Ngụ Võn Thu, Trn Hựng (2011), Dc liu hc (Tp 1), NXB Y hc Phan Quc Kinh (2011), Giỏo trỡnh cỏc hp cht thiờn nhiờn cú hot tớnh sinh hc, NXB Giỏo dc Ting Anh Approache to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase, Journal of Investigative Dermatology, 127(4), pp.751-761 Andersson L (2003), "Melanocortin 1-receptor (MC1R) mutations are associated with plumage colour in chicken," Animal genetics, 34, pp 241-248 Beermann F., S J Orlow, R E Boissy, A Schmidt, Y L Boissy and M L Lamoreux (1995), Misrouting of tyrosinase with a truncated cytoplasmic tail as a result of the murine platinum (cp) mutation, Experimental eye research, 61(5), pp 599-607 Bellei B., E Flori, E Izzo, V Maresca and M Picardo (2008), GSK3 inhibition promotes melanogenesis in mouse B16 melanoma cells and normal human melanocytes, Cellular signalling, 20(10), pp 1750-1761 Bertolotto C., P Abbe, K Bille, E Aberdam, J P Ortonne and R Ballotti (1998), Different cis-acting elements are involved in the regulation of TRP1 and TRP2 promoter activities by cyclic AMP: pivotal role of M boxes (GTCATGTGCT) and of microphthalmia, Molecular and cellular biology, 18(2), pp 694-702 Bolognia J, Orlow S Regulation of Melanin Biosynthesis Bolognia: Dermatology (2nd Ed)Chapter 64 Melanocyte BiologySection Ten Pigmentary Disorders: Elsevier Inc; 2008 10 Brenner M, Hearing VJ Modifying skin pigmentation approaches through intrinsic biochemistry and exogenous agents Drug Discovery Today: Disease Mechanisms 2008;5(2):e189-e99 eng 54 Lun Thc s 11 Lờ Th Liờn Carlson JA, Linette GP, Aplin A, Ng B, Slominski A Melanocyte receptors: clinical implications and therapeutic relevance Dermatol Clin 2007 Oct;25(4):541-57, viii-ix PubMed PMID: 17903613 Pubmed Central PMCID: 2732336 eng 12 Cerenius L., B L Lee and K Sửderhọll (2008), The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity, Trends in immunology, 29(6), pp 263-271 13 Cộsarini JP, I.N.S.E.R.M Melanins and their possible roles through biological evolution Advances in Space Research 1996;18(12):35-40 14 Chang T S (2012), Natural melanogenesis inhibitors acting through the down-regulation of tyrosinase activity, Materials, 5(9), pp.1661- 1685 15 Dahm R., R Geisler and C NỹssleinVolhard (2005), Zebrafish (Danio rerio) genome and genetics, WileyVCH Verlag GmbH and Co KgaA 16 D'Orazio J., S Jarrett, A Amaro-Ortiz and T Scott (2013), UVRadiation and the Skin, International journal of molecular sciences, 14(6), pp 12222-12248 17 Eva Maria (2009), Studies of Proteins that Regulate Melanin Synthesis, Toronto., Kerje S., Lind J., Schutz K., Jensen P 18 Flinn L., S Bretaud, C Lo, P W Ingham and O Bandmann (2008), Zebrafish as a new animal model for movement disorders Journal of neurochemistry, 106(5), pp 1991-1997 19 Gillbro JM, Olsson MJ The melanogenesis and mechanisms of skinlightening agents-existing and new approaches Int J Cosmet Sci 2011 Jun;33(3):210-21 PubMed PMID: 21265866 20 Groves A K., Bronner-Fraser M (1998), Neural Crest Diversification, Current topics in developmental biology, 43, pp 221-258 21 Halaban R., R S Patton, E Cheng, S Svedine, E S Trombetta, M L Wahl, and D N Hebert (2002), Abnormal acidification of melanoma cells induces tyrosinase retention in the early secretory pathway, Journal of Biological Chemistry, 277(17), pp 14821-14828 22 Hawkes J W (1973), The structure of fish skin II The chromatophore unit, Cell and tissue research, 149(2), pp 159-172 55 Lun Thc s 23 Lờ Th Liờn Howe K., M D Clark, C F Torroja, J Torrance, C Berthelot, M Muffato, and B Plumb (2013), The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome, Nature, 496(7446), pp 498-503 24 Jiang Z., J Xu, M Long, Z Tu, G Yang and G He (2009), 2, 3, 5, 4tetrahydroxystilbene-2-O--d-glucoside (THSG) induces melanogenesis in B16 cells by MAP kinase activation and tyrosinase upregulation, Life sciences, 85(9), pp 345-350 25 Jimbow K., Sugiyama S (1998), Melanosomal translocation and transfer, The Pigmentary System: Physiology and Pathophysiology New York: Oxford University Press, pp 107-114 26 Johnson S L., D Africa, C Walker and J A Weston (1995), Genetic control of adult pigment stripe development in zebrafish, Developmental biology, 167(1), pp 27-33 27 Kerje S., Lind J., Schutz K., Jensen P and Andersson L (2003), "Melanocortin 1-receptor (MC1R) mutations are associated with plumage colour in chicken," Animal genetics, 34, pp 241-248 28 Kimmel C B., W W Ballard, S R Kimmel, B Ullmann and T F Schilling (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish, Developmental dynamics, 203(3), pp 253-310 29 Kwon B S., A K Haq, S H Pomerantz and R Halaban (1987), Isolation and sequence of a cDNA clone for human tyrosinase that maps at the mouse c-albino locus, Proceedings of the National Academy of Sciences, 84(21), pp 7473-7477 30 Lipsker D, Boeckler P Hyperpigmentation Dermatologie 2006;Tous droits rộservộs 31 Liu W S., Kuan Y D., Chiu K H., Wang W K., Chang F H., Liu C H., et al (2013), "The extract of Rhodobacter sphaeroides inhibits melanogenesis through the MEK/ERK signaling pathway," Marine drugs, 11, pp 1899-1908, 50 32 Melanocyte regeneration reveals mechanisms of adult stem cell regulation," Seminars in cell & developmental biology, 20, pp 117-124 56 Lun Thc s 33 Lờ Th Liờn Milos N., Dingle, A D (1978), Dynamics of pigment pattern formation in the zebrafish, Brachydanio rerio I Establishment and regulation of the lateral line melanophore stripe during the first eight days of development, Journal of Experimental Zoology, 205(2), pp 205- 216 34 Nakajima A, Funasaka Y, Kawana S Investigation by in vivo reflectance confocal microscopy: melanocytes at the edges of solar lentigines Experimental Dermatology 2012;21:18-21 35 Nordlund JJ, Boissy R, Hearing V The pigmentary system: physiology and pathophysiology, 2d ed Portland: Ringgold Inc; 2006 36 O'Reilly-Pol T and Johnson S L (2009), "Melanocyte regeneration reveals mechanisms of adult stem cell regulation," Seminars in cell & developmental biology, 20, pp 117-124 37 Orr-Urtreger A., A A R O N Avivi, I T Z H A K Zimmer, D A V I D Givol, Y O S E F Yarden and P E T E R Lonai (1990), Developmental expression of c-kit, a proto-oncogene encoded by the W locus, Development, 109(4), pp 911-923 38 Parichy D M., D G Ransom, B Paw, L I Zon and S L Johnson (2000), An orthologue of the kit-related gene fms is required for development of neural crest-derived xanthophores and a subpopulation of adult melanocytes in the zebrafish, Danio rerio, Development, 127(14), pp 3031-3044 39 Parichy D M., J F Rawls, S J Pratt, T T Whitfield and S L Johnson (1999), Zebrafish sparse corresponds to an orthologue of c-kit and is required for the morphogenesis of a subpopulation of melanocytes, but is not essential for hematopoiesis or primordial germ cell development, Development, 126(15), pp 3425-3436 40 Park H J., N Zhang and D K Park (2011), Topical application of Polygonum multiflorum extract induces hair growth of resting hair follicles through upregulating Shh and -catenin expression in C57BL/6 mice, Journal of ethnopharmacology, 135(2), pp 369-375 41 Parvez S., M Kang, H S Chung, C Cho, M C Hong, M K Shin and H Bae (2006), Survey and mechanism of skin depigmenting and lightening agents, Phytotherapy Research, 20(11), pp 921-934 57 Lun Thc s 42 Lờ Th Liờn Prota G., M DIschia and A Napolitano (1998), The chemistry of melanins and related metabolites, The pigmentary system, pp 307-332 43 Raible D W., A Wood, W Hodsdon, P D Henion, J A Weston and J S Eisen (1992), Segregation and early dispersal of neural crest cells in the embryonic zebrafish, Developmental dynamics, 195(1), pp.29-42 44 Rawls J F., E M Mellgren and S L Johnson (2001), How the zebrafish gets its stripes, Developmental biology, 240(2), pp 301-314 45 Reemann P., Reimann E., Ilmjarv S., Porosaar O., Silm H., Jaks V., et al (2014), "Melanocytes in the skin comparative whole transcriptome analysis of main skin cell types," PloS one, 9, e115717., 46 Schiaffino M V (2010), Signaling pathways in melanosome biogenesis and pathology, The international journal of biochemistry & cell biology, 42(7), pp 1094-1104 47 Speeckaert R, Van Gele M, Speeckaert MM, Lambert J, van Geel N The biology of hyperpigmentation syndromes Pigment cell & melanoma research 2014;27(4):512-24 Eng, 48 Steel K P., D R Davidson and I J Jackson (1992), TRP-2/DT, a new early melanoblast marker, shows that steel growth factor (c-kit ligand) is a survival factor Development, 115(4), pp 1111-1119 49 Sugimoto M., N Uchida and M Hatayama (2000), Apoptosis in skin pigment cells of the medaka, Oryzias latipes (Teleostei), during longterm chromatic adaptation: the role of sympathetic innervation, Cell and tissue research, 301(2), pp 205-216 50 Sun YN, Cui L, Li W, Yan XT, Yang SY, Kang JI, Kang HK, Kim YH (2013), Promotion effect of constituents from the root of Polygonum multiflorum on hair growth, Bioorg Med Chem Lett 23(17): pp 4801-4805 51 Tobin D J., R Paus (2001), Graying: gerontobiology of the hair follicle pigmentary unit, Experimental gerontology, 36(1),pp 29-54 52 Uyen L, Nguyen D, Kim E-K Mechanism of skin pigmentation Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008 2008/08/01;13(4):383-95 Eng, 58 Lun Thc s 53 Lờ Th Liờn Yee N S., Pack M (2005), Zebrafish as a model for pancreatic cancer research, Pancreatic Cancer, pp 273-298 Websise 54 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC175930 55 http://www.perfinity.com/) 59 ... dịch chiết hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) lên khả psinh tổng hợp melanin mức độ in vitro in vivo với mục đích: Phân tích ảnh hưởng dịch chiết hà thủ ô đỏ lên khả tăng sinh tổng hợp melanin. .. nghiên cứu 18 2.2.1 Tách chiết hà thủ ô 18 2.2.2 Khảo sát tác dụng dịch chiết lên khả sinh tổng hợp melanin mức độ in vitro 20 2.2.3 Khảo sát tác dụng dịch chiết lên. .. GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP MELANINE Ở MỨC ĐỘ IN- VITRO