Header Page of 133 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Sinh viên thực ĐẶNG THỊ THU THẢO MSSV: 0753040084 LỚP: ĐH NTTS K2 Cần Thơ, 2011 Footer Page of 133 Header Page of 133 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Cán hướng dẫn Sinh viên thực PGs.Ts NGUYỄN VĂN BÁ ThS NGUYỄN THÀNH TÂM ĐẶNG THỊ THU THẢO 2011 Footer Page of 133 Header Page of 133 XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Luận văn kèm theo với tựa đề: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả kháng khuẩn từ sản phẩm thủy sản lên men” Do sinh viên Đặng Thị Thu Thảo thực báo cáo Hội đồng chấm luận văn thông qua Ủy viên Phản biện Cần Thơ, ngày 13 tháng 07 năm 2011 Chủ tịch hội đồng Footer Page of 133 Header Page of 133 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Tây Đô tạo điều kiện tốt cho học tập sinh hoạt Cảm ơn quý Thầy Cô Khoa Sinh Học Ứng Dụng nhiệt tình giảng dạy truyền đạt cho kiến thức quý báu sở ngành chuyên ngành từ ngày đầu bước chân vào trường đến Đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả kháng khuẩn từ sản phẩm thủy sản lên men” kết thúc thành công Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ Thầy Nguyễn Văn Bá hỗ trợ môi trường nuôi cấy dụng cụ đặc trưng cho thí nghiệm, Thầy Nguyễn Thành Tâm theo sát hướng dẫn đề tài cung cấp số tài liệu liên quan Cảm ơn Cô Trần Ngọc Huyền – cán phòng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi để đề tài kết thúc thời hạn xin cảm ơn anh Lê Văn Toàn (lớp ĐH NTTS K2) hai em Nguyễn Thị Thùy Trang Dương Thị Bé Ba (lớp ĐH NTTS K3) đồng hành giúp đỡ suốt trình thực Cảm ơn Thầy cố vấn học tập Tạ Văn Phương , Thầy Nguyễn Lê Hoài Phương (Khoa bản) thành viên lớp ĐH NTTS K2 sát cánh suốt trình học tập trường Chân thành cảm ơn! Đặng Thị Thu Thảo Footer Page of 133 Header Page of 133 TÓM TẮT Vi khuẩn lactic có ý nghĩa quan trọng trình lên men thực phẩm Chúng sinh nhiều chất để bảo vệ thực phẩm như: axít lactic, H2O2 chất kháng khuẩn Do đó, việc tìm chất kháng khuẩn sinh từ vi khuẩn lactic nhằm bổ sung cho nghiên cứu chất kháng khuẩn ứng dụng chất kháng khuẩn vào nuôi trồng thủy sản Nghiên cứu sử dụng môi trường MRS để phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp trực tiếp để kiểm tra kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus Kết cho thấy có tổng số 83 dòng vi khuẩn lactic phân lập từ 37 mẫu mắm nước mắm (thu ngẫu nhiên chợ thuộc vùng nước nước lợ mặn) có 19 dòng cho vòng kháng khuẩn dòng thị Độ dày vòng kháng khuẩn từ 0,1 – 0,85 cm, có dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng kháng khuẩn lớn (hơn 0,6 cm), dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn 0,1 cm nhỏ Như vậy, sử dụng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men thủy sản để kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Chất kháng khuẩn, Phương pháp trực tiếp, Pediococcus pentosakeus Footer Page of 133 Header Page of 133 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC .iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Một số quy trình lên men thủy sản 2.2 Vi khuẩn lactic 2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn lên men axit lactic 2.2.2 Cơ chế trinh lên men axit lactic 2.3 Mối quan hệ giữ axit lactic với cá sản phẩm từ cá 2.4 Chất kháng khuẩn 2.5 Dòng thị Pediococcus pentosakeus 12 2.6 Những nghiên cứu nước 13 2.6.1 Những nghiên cứu nước 13 2.6.2 Những nghiên cứu nước 14 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Địa điểm thời gian thực 15 3.1.1 Địa điểm 15 3.1.2 Thời gian thực 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Phương pháp thu bảo quản mẫu 17 3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm 18 3.4 Phân tích xử lý số liệu 20 3.4.1 Phân tích VKL 20 3.4.2 Phân tích khả kháng khuẩn 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 21 4.1 Phân lập số dòng VKL từ sản phẩm thủy sản lên men 21 4.1.1 Thu mẫu 21 4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 21 4.1.3 Cấy ria đĩa pêtri 23 Footer Page of 133 Header Page of 133 4.1.4 Thử catalase nhuộm Gram 25 4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 26 4.1.6 Lưu trữ mẫu 26 4.2 Kiểm tra khả sinh CKK từ dòng VKL thu 26 4.2.1 Tối ưu hóa quy trình 26 4.2.2 Thử khả sinh CKK từ dòng VKL thu 27 CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ ĐỀ XUẤT 31 5.1 Kết 31 5.2 Đề xuất 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC A A PHỤ LỤC B .B PHỤ LỤC C C PHỤ LỤC D D1 PHỤ LỤC E .E PHỤ LỤC F F1 PHỤ LỤC G G Footer Page of 133 Header Page of 133 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Các đặc tính CKK VKL 10 Bảng 3.1: Tên địa điểm thu mẫu 17 Bảng 4.1: Địa điểm số lượng mẫu thu 21 Bảng 4.2: Kết tăng sinh lần 22 Bảng 4.3: Kết cấy ria VKL đĩa thạch 23 Bảng 4.4: Kết thử khả sinh chất kháng khuẩn 28 Bảng 4.5: Kết thử với Pediococcus pentosakeus 30 Bảng A1: Thành phần môi trường MRS_broth A Bảng A2: Thành phần môi trường MRS_agar A Bảng D1: Bảng mã mẫu D1 Bảng D2: Kết thử khả sinh CKK VKL phân lập D3 Bảng F1: Quan sát khuẩn lạc F1 Footer Page of 133 Header Page of 133 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm Hình 2.6: Pediococcus 12 Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm 19 Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình 19 Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp 20 Hình 4.1: Cách xác định phát triển VKL 21 Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả phân giải CaCO3 25 Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) mẫu thử catalase âm tính 25 Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn mẫu 27 Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh từ VKL 30 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VKL: Vi khuẩn lactic CKK: Chất kháng khuẩn Footer Page of 133 Header Page 10 of 133 CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngày chiếm vị trí quan trọng kinh tế Trong năm gần đây, nhằm nâng cao suất thủy sản phục vụ nhu cầu xuất nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày cao Bệnh tôm, cá loài thủy đặc sản khác xuất ngày nhiều Bệnh gây nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản Sản phẩm làm không tiêu thụ chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng xuất Do đó, công tác phòng trị bệnh nuôi trồng thủy sản đòi hỏi cấp bách (Bùi Quang Tề, 2008) Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản dần tác dụng với loại mầm bệnh quen thuộc việc sử dụng thuốc mức không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc loại mầm bệnh ngày gia tăng Việc sử dụng dòng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh trọng, đặc biệt nhóm vi khuẩn lactic (VKL) VKL tên gọi nhóm vi khuẩn sinh axit lactic sản phẩm trình chuyển hoá chất bột đường chúng xếp vào họ Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương csv., 2009) VKL có ứng dụng rộng rãi thực tiễn với axit lactic nguyên liệu cần thiết nhiều ngành công nghiệp Đặc biệt, công nghiệp chế biến bảo quản thực phẩm sữa chua, loại dưa từ rau củ, loại sản phẩm thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004) Trong trình lên men, VKL sinh axit hữu cơ, chúng tạo môi trường không thích hợp cho phát triển vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức bảo vệ chức dinh dưỡng màng tế bào, ức chế trình vận chuyển chủ động màng tế bào Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào tự oxi hoá, làm dừng trình trao đổi chất, gây chết tế bào nhạy cảm với (Lê Văn Nhương csv., 2009) Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dòng VKL có khả sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản nay, đề tài “Phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn lactic từ sản phẩm thủy sản lên men có khả kháng khuẩn ” thực Footer Page 10 of 133 10 Header Page 26 of 133 Môi trường nuôi cấy Môi trường MRS_broth (Lactobacillus MRS Broth, MERCH – Đức) Môi trường MRS_agar (Lactobacillus MRS Agar, MERCH – Đức) Các loại hoá chất Calcium carbonate (CaCO3), Sodium chloride (NaCl) Glycerol 30% Nước cất, nước muối sinh lý 9‰ Cồn 70% cồn 96% Hoá chất nhuộm Gram Hoá chất thử catalase Nguồn mẫu thị Pediococcus pentosakeus từ Khoa Nông Nghiệp – Trường Đại học Kyushu, Nhật Bản 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu bảo quản mẫu Mẫu mắm thu ngẫu nhiên chợ Châu Đốc, Trung tâm thương mại Tp Cần Thơ (đặc trưng vùng nước ngọt), chợ Bạc Liêu, chợ Sóc Trăng (đặc trưng vùng nước lợ mặn) Mẫu giữ riêng biệt loại hộp nhựa nhỏ đặt phòng thí nghiệm với nhiệt độ phòng Bảng 3.1: Tên địa điểm thu mẫu STT Tên mẫu Footer Page 26 of 133 Điểm thu Châu Đốc Mắm linh Mắm sặc Mắm lóc Mắm chốt Mắm rô Mắm trèn Mắm rô lớn Mè vinh Mắm rô phi 10 Mắm ruốc Bà Tiền Giang 11 Mắm linh Cần Thơ 12 Mắm sặc 13 Nước mắm Quốc Hải 26 Header Page 27 of 133 14 Nước mắm Hồng Đài 15 Nước mắm Kabin 16 Nước mắm Nam Ngư 17 Nước mắm Thanh Liêm 18 Nước mắm Nam Ngư chua 19 Mắm ruốc Trí Hải 20 Mắm ruốc Huế 21 Mắm tép 22 Mắm tôm 23 Mắm lóc 24 Mắm trèn 25 Mắm sặc A 26 Mắm sặc B 27 Mắm ruốc 28 Mắm ba khía 29 Mắm cá cơm 30 Mắm cá biển A 31 Mắm cá biển B 32 Mắm rô 33 Mắm cá đối, cá cơm 34 Mắm prohoc A nhiễn 35 Mắm prohoc B to 36 Mắm sặc 37 Mắm nêm pha sẵn Bạc Liêu Sóc Trăng 3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm Theo De Man et al., (1960) (được trích dẫn Gyu Sung Cho Hyung Ky Do, 2006) VKL phân lập môi trường MRS_agar sau ủ 30 oC 48 – 72h để khuẩn lạc phát triển Khuẩn lạc chọn cách ngẫu nhiên làm phương pháp cấy truyền (Leisner et al., 1997 trích dẫn Gyu Sung Cho Hyung Ky Do, 2006) Những dòng VKL tăng sinh môi trường MRS_broth (pH 6,5) ủ 30 oC 24h Tất dòng trữ môi trường MRS_broth có chứa glycerol 20% ủ lạnh âm 70 oC (Gyu Sung Cho Hyung Ky Do, 2006) Quy trình phân lập mẫu mắm thực tương tự theo Penson Jumriangrit (2004) Footer Page 27 of 133 27 Header Page 28 of 133 Mẫu mắm Nuôi tăng sinh môi trường MRS_broth, nước cất, muối sinh lý Trữ ml mẫu ống fancol, giữ lạnh ủ 24h to 30 oC VKL phân lập Cấy lên đĩa thạch MRS_agar ml thử phương pháp kiểm tra khả sinh chất kháng khuẩn từ mẫu phân lập ủ 24h to 30 oC ủ 24h to 30 oC Lấy khuẩn lạc riêng lẽ nuôi tăng sinh ống nghiệm MRS_broth ml Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm Để kiểm tra thời gian tăng sinh mẫu cho khả kháng khuẩn tốt với Pediococcus pentosakeus phù hợp với điều kiện thực nghiệm, VKL phân lập tối ưu hóa theo sơ đồ Hình 3.2 VKL tăng sinh 24h ủ 30 oC Tán đĩa MRS agar 24h 36h 36h 48h 48h 72h 72h Tán đĩa MRS agar 24h Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình Footer Page 28 of 133 28 Thử dòng thị quan sát (24h, 36h, 48h, 72h) Header Page 29 of 133 Sau tối ưu, chọn thời gian tăng sinh tốt để tiến hành thử khả sinh CKK dòng phân lập với dòng thị Pediococcus pentosakeus phương pháp trực tiếp (Coventry et al., 1997 trích dẫn Penson Jumriangrit, 2004) theo sơ đồ Hình 3.3 Đổ ống MRS_agar chứa Pediococcus pentosakeus lên đĩa ủ Ủ 24h 30 oC VKL tăng sinh cấy điểm lên đĩa MRS_agar Xuất khuẩn lạc VKL Quan sát vòng kháng khuẩn Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp 3.4 Phân tích xử lý số liệu 3.4.1 Phân tích VKL • Quan sát hình dạng khuẩn lạc • Đo kích thước khuẩn lạc • Quan sát phân giải CaCO3 3.4.2 Phân tích khả kháng khuẩn • Đo kích thước vòng kháng khuẩn • Quan sát hình dạng vòng kháng khuẩn Số liệu tổng hợp phân tích phần mềm Microsoft Excel Footer Page 29 of 133 29 Ủ 24h 30 oC Header Page 30 of 133 CHƯƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập số dòng VKL từ sản phẩm thủy sản lên men 4.1.1 Thu mẫu Mẫu thu ngẫu nhiên chợ trung tâm thương mại Kết thể qua Bảng 4.1 Có tổng số 37 mẫu thu vùng nước lợ mặn Cụ thể vùng nước Châu Đốc (An Giang), Cần Thơ, Tiền Giang vùng nước lợ mặn Sóc Trăng, Bạc Liêu Bảng 4.1:Địa điểm số lượng mẫu thu Vùng thu Tên tỉnh Nước Châu Đốc (An Giang) Tiền Giang Cần Thơ Nước lợ mặn Bạc Liêu Sóc Trăng Số lượng mẫu 12 11 Qua Bảng 4.1 cho thấy, có 22 mẫu mắm nước mắm thu vùng nước 15 mẫu thu vùng nước lợ mặn 4.1.2 Tăng sinh mẫu lần Mẫu mắm sau thu tiến hành tăng sinh lần 30 oC, thời gian 24h loại môi trường khác MRS_broth, nước cất nước muối sinh lý trùng (phụ lục C) A B Hình 4.1: Cách xác định phát triển VKL Ghi chú: A – mẫu chưa tăng sinh; B – mẫu sau tăng sinh Footer Page 30 of 133 30 Header Page 31 of 133 Bảng 4.1: Kết tăng sinh lần STT Tên mẫu Điểm thu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Mắm linh Mắm sặc Mắm lóc Mắm chốt Mắm rô Mắm trèn Mắm rô lớn Mè vinh Mắm rô phi Mắm ruốc Bà Mắm linh Mắm sặc Nước mắm Quốc Hải Nước mắm Hồng Đài Nước mắm Kabin Nước mắm Nam Ngư Nước mắm Thanh Liêm Nước mắm Nam Ngư chua Mắm ruốc Trí Hải Mắm ruốc Huế Mắm tép Mắm tôm Mắm lóc Mắm trèn Mắm sặc A Mắm sặc B Mắm ruốc Mắm ba khía Mắm cá cơm Mắm cá biển A Mắm cá biển B Mắm rô Mắm cá đối, cá cơm Mắm prohoc A nhiễn Mắm prohoc B to Mắm sặc Mắm nêm pha sẵn Châu Đốc Tiền Giang Cần Thơ Bạc Liêu Sóc Trăng Môi trường nuôi nước muối MRS cất sinh lý broth + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Ghi chú: + mẫu tăng sinh có lên vi khuẩn; - mẫu tăng sinh không lên vi khuẩn Footer Page 31 of 133 31 Header Page 32 of 133 Tăng sinh mẫu lần có 36 dòng phát triển môi trường nước cất, 30 dòng phát triển môi trường nước muối sinh lý 9‰, 32 dòng phát triển môi trường MRS_broth Sự khác số lượng vi khuẩn có xuất môi trường không cao Vì VKL có khả phát triển điều kiện môi trường khắc nghiệt (Lương Đức Phẩm, 2004) Trong đó, có 27 mẫu có phát triển môi trường Mẫu nước mắm Nam Ngư chua có chứa tỏi ớt (đây chất diệt khuẩn) nên vi khuẩn không phát triển, tăng sinh mẫu không lên Các mẫu mắm thu vùng nước lợ mặn vi khuẩn lên tốt môi trường nuôi so với mẫu thu vùng nước Có thể nguồn mẫu thu từ vùng nước có hàm lượng dinh dưỡng không cao nên cân mẫu cho vào nuôi tăng sinh không đủ dinh dưỡng cho phát triển vi khuẩn 4.1.3 Cấy ria đĩa petri Những mẫu mắm tăng sinh lần có vi khuẩn phát triển mang cấy ria tiếp tục lên môi trường MRS_agar có bổ sung CaCO3 0,6% Đĩa sau cấy quấn giấy parafim xung quanh cho vào tủ ủ ấm 30 oC sau 24h quan sát, kết thể Bảng 4.3 Bảng 4.3: Kết cấy ria vi khuẩn đĩa thạch Tên mẫu Mắm linh Mắm sặc Mắm lóc Mắm chốt Mắm rô đồng Mắm trèn Mắm rô lớn Mắm mè vinh Mắm rô phi Mắm ruốc Bà Mắm linh Mắm sặc Nước mắm Quốc Hải Nước mắm Hồng Đài Nước mắm Kabin Nước mắm Nam Ngư Nước mắm Thanh Liêm Footer Page 32 of 133 Nước cất Điểm thu Kết Tăng sinh cấy lần ria Châu Đốc + + + + + + + + + + + + + + + Tiền Giang + + Cần Thơ + + + + + + + + + + + + + + 32 Nước muối sinh lý Kết Tăng cấy sinh ria lần + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + MRS_broth Kết Tăng sinh cấy lần ria + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - Header Page 33 of 133 Mắm ruốc Trí Hải Mắm ruốc Huế Mắm tép Mắm tôm Mắm lóc Mắm trèn Mắm sặc A Mắm sặc B Mắm ruốc Mắm ba khía Mắm cá cơm Mắm cá biển A Mắm cá biển B Mắm rô Mắm cá đối, cá cơm Mắm prohoc A nhiễn Mắm prohoc B to Sặc Mắm nêm pha sẵn Bạc Liêu Sóc Trăng + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Ghi chú: - không lên khuẩn lạc + có lên khuẩn lạc Kết cấy ria có 82 đĩa pêtri xuất phát triển khuẩn lạc Trong đó, có 15 đĩa mẫu bị nhiễm nấm, 67 đĩa mẫu không nhiễm nấm 57 mẫu có khả phân giải CaCO3 Qua trình quan sát khuẩn lạc nhận thấy đa số khuẩn lạc phân lập có dạng hình tròn, số có hình dạng tròn không rìa dợn sóng Bề mặt khuẩn lạc lồi, nhẵn bóng, số khác bề mặt gồ ghề, lõm Khuẩn lạc sau thời gian phát triển đặc tính nhày Màu sắc khuẩn lạc thường có màu trắng sữa, trắng màu trắng đục, để thời gian chuyển sang màu vàng kem Đặc biệt, khuẩn lạc tỏa mùi chua axit Trong trình phát triển VKL tạo chất biến dưỡng với sản phẩm trao đổi chất, mà cụ thể axit lactic Axit lactic tác dụng với CaCO3 bổ sung vào môi trường trình nuôi cấy, lượng CaCO3 xung quanh khuẩn lạc bị chuyển hóa thành muối canxi, CO2 H2O, nhờ mà trì pH mức 5.5 – (Lương Đức Phẩm, 2004) trả lại vùng môi trường xung quanh khuẩn lạc ban đầu Bề dày vòng biểu thị lượng axit sinh nhiều hay Footer Page 33 of 133 33 Header Page 34 of 133 Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả phân giải CaCO3 4.1.4 Thử catalase nhuộm Gram Tiến hành thử catalase nhuộm Gram cho đĩa có phát triển khuẩn lạc (phụ lục E) Qua kết nhuộm Gram cho thấy dòng vi khuẩn vi khuẩn Gram dương bắt màu tím sen với thuốc nhuộm có dạng hình que, sống đơn, đôi kết thành chuỗi ngắn, số dòng gom thành cụm Qua phép thử catalase toàn dòng phân lập âm tính với catalase Những thông tin phù hợp với mô tả nghiên cứu trước (Pongtep Wilaipun et al., 2002; Penson Jumriangrit, 2004; Nguyễn Võ Mỹ Ngân, 2010) Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) mẫu thử catalase âm tính Các dòng vi khuẩn phân lập có đặc tính giống nghiên cứu công bố VKL như: hình que ngắn, không sinh enzyme catalase, gram dương, tạo vòng môi trường có bổ sung CaCO3 điều quan trọng môi trường dùng cho công tác phân lập tách ròng MRS, môi trường đặc hiệu cho loài Lactobacillus Như vậy, tất dòng vi khuẩn phân lập chứng thực nhóm VKL Footer Page 34 of 133 34 Header Page 35 of 133 4.1.5 Tăng sinh mẫu lần Tiến hành tăng sinh lần cho đĩa chứa mẫu sau xác định VKL Tăng sinh mẫu 30 oC ống nghiệm chứa môi trường MRS_broth có bổ sung NaCl 0,6% (cho mẫu mắm thu vùng nước lợ mặn) (Komkhae Pilasombut et al., 2005) Theo Pongtep Wilaipun et al (2002), dòng VKL tăng sinh môi trường MRS_broth nhiệt độ 30 oC sinh CKK tốt khả chất kháng khuẩn giảm tăng nhiệt độ Kết tăng sinh lần tất 56 đĩa lên khuẩn lạc phát triển tốt môi trường MRS_broth Có 26 mẫu không phát triển bị nhiễm nấm trình thao tác, phòng thí nghiệm sử dụng chung cho hoạt động khác khu vực cách ly so với môi trường bên nên khả nhiễm nấm tạp khuẩn cao Tiến hành lập mẫu trữ dòng vi khuẩn phân lập 4.1.6 Lưu trữ mẫu Mẫu trữ dạng • Lỏng: rút ml mẫu tăng sinh cho vào falcon ml chứa ml dung dịch glycerol 30% trùng, lắc máy vortex quấn kín giấy parafim Mẫu trữ lạnh âm 80 oC • Khuẩn lạc: cấy mẫu tăng sinh lên mặt phẳng nghiêng môi trường MRS_agar ống effendoft 1,5 ml, mẫu cấy vào ống, đem ủ ấm 30 oC đến xuất khuẩn lạc rõ (48h) Mẫu giữ ngăn mát tủ lạnh 4.2 Kiểm tra khả sinh CKK từ dòng VKL thu 4.2.1 Tối ưu hóa quy trình Chọn ngẫu nhiên mẫu 78, 80 83 tiến hành tối ưu hóa theo quy trình Hình 3.2, nhằm xác định thời điểm sinh chất kháng khuẩn nhiều điều kiện thí nghiệm dòng vi khuẩn phân lập, với dòng thị Pediococcus pentosakeus Kết tối ưu hoá thể Hình 4.4 cho thấy mẫu nuôi tăng sinh 30 oC, thời gian 48h cho kết tốt (C) với vòng kháng khuẩn rõ, đường kính vòng 1,3 cm Footer Page 35 of 133 35 Header Page 36 of 133 A B 1,05 cm 1,2 cm C D 1,3 cm 1,2 cm Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn mẫu 4.2.2 Thử khả sinh CKK từ dòng VKL thu Chuẩn bị ống nghiệm chứa 5ml môi trường MRS agar dòng vi khuẩn phân lập nuôi tăng sinh 30 oC, thời gian 48h Tiến hành thử khả sinh CKK với dòng thị Pediococcus pentosakeus phương pháp trực tiếp Qua Bảng 4.4 cho thấy VKL có khả sinh CKK, kết phù hợp với kết Penson Jumriangrit (2004) nghiên cứu khả sinh CKK từ sản phẩm thủy sản lên men Thái Lan Khả sinh CKK dòng VKL khác nhau, phụ thuộc vào: dòng vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy, giai đoạn phát triển, thời gian nuôi cấy Đa số dòng vi khuẩn lactic sau 8h bắt đầu sinh CKK, vòng kháng khuẩn rõ sau 12 đạt bề dày lớn sau 18h – 24h, sang 48h vòng kháng khuẩn mờ dần đến 72h gần không thấy, kết tương tự Mai Đàm Linh csv (2007) Có 21 mẫu không cho vòng kháng khuẩn lần thử 19 mẫu nghi ngờ có vòng kháng khuẩn vòng mờ, khó đo độ dày vòng kháng khuẩn Trong đó, có mẫu cho vòng kháng khuẩn tốt qua lần thử, mẫu cho vòng kháng lần thử mẫu cho vòng kháng khuẩn lần Footer Page 36 of 133 36 Header Page 37 of 133 Bảng 4.4: Kết thử khả sinh chất kháng khuẩn Kết thử STT Mã mẫu lần lần 0 45 0 11 ? 13 ? 28 ? ? 36 ? 58 ? ? 60 ? ? ? ? 10 ? ? 11 16 ? ? 12 21 ? ? 13 23 ? ? 14 30 ? ? 15 31 ? ? 16 35 ? ? 17 48 ? ? 18 81 ? ? 19 82 ? ? 20 ? + 21 26 ? + 22 57 ? ? 23 ? + 24 34 ? + 25 63 + + 26 79 + ? 27 80 + + 28 + + 29 10 + + 30 40 + + 31 41 + + 32 43 + + 33 71 + + 34 78 + + 35 83 + + Ghi chú: 0: vòng kháng khuẩn ?: nghi ngờ có vòng kháng khuẩn +: có vòng kháng khuẩn Footer Page 37 of 133 37 lần ? ? ? ? ? 0 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? + + + ? + ? + + + + + + + + Header Page 38 of 133 Những mẫu nghi ngờ có khả kháng khuẩn mẫu cho vòng kháng khuẩn tốt đem thử tiếp với dòng thị Pediococcus pentosakeus thời gian nuôi khuẩn lạc mẫu 48h (gấp đôi lần thử trước) Kết cho thấy đường kính vòng kháng khuẩn rõ to mẫu cho vòng kháng khuẩn tốt lần thử đầu, mẫu nghi ngờ nhiều cho vòng kháng khuẩn rõ to mẫu 16, 81, 82 Mẫu ủ 48h khuẩn lạc phát triển lớn mà khả sinh chất kháng khuẩn nhiều khuẩn lạc nhỏ ủ 24h (De Man et al., 1960 trích dẫn Gyu Sung Cho Hyung Ky Do, 2006) Kết thể Bảng 4.5 A B Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh từ VKL Ghi chú: A – mẫu nuôi 24h; B – mẫu nuôi 48h Footer Page 38 of 133 38 Header Page 39 of 133 Bảng 4.5: Kết thử với Pediococcus pentosakeus Mã Khuẩn lạc nuôi 24h Khuẩn lạc (cm) nuôi 48h STT mẫu lần lần lần (cm) 1 ? 0,1 0,1 0,2 0,3 0,2 0,5 0,5 ? ? ? 0,15 10 0,4 0,4 0,4 0,5 11 ? ? ? 0,1 16 ? ? ? 0,65 34 ? 0,15 0,1 0,85 36 ? ? ? 0,2 40 0,15 0,1 0,1 0,3 10 41 0,3 0,3 0,3 0,7 11 43 0,15 0,1 0,15 0,5 12 63 0,3 0,2 ? 0,7 13 71 0,1 0,2 0,1 0,35 14 78 0,15 0,1 0,15 0,7 15 79 0,3 ? 0,3 0,4 16 80 0,25 0,1 ? 0,65 17 81 ? ? ? 0,65 18 82 ? ? ? 0,7 19 83 0,4 0,3 0,4 0,7 Tên mẫu Linh MRS CĐ Linh muối CĐ Mắm ruốc Bà MRS TG Nước mắm Quốc Hải MRS CT Nước mắm Hồng Đài nước CT Nước mắm Hồng Đài nước CT Sặc A MRS BL Lóc nước BL Mắm ruốc MRS BL Sặc MRS ST Lóc muối BL Lóc MRS BL Biển B muối BL Rô MRS BL Cá đối muối BL Rô lớn MRS CĐ Rô nước BL Cá đối MRS BL Rô muối BL Qua Bảng 4.5 cho thấy mẫu có độ dày nhỏ 0,1 cm lớn 0.85 cm Trong đó, có dòng cho vòng kháng khuẩn với độ dày 0,1 – 0.3 cm, có dòng cho độ dày vòng khoảng lớn 0,3 – 0,6 có dòng có độ dày vòng kháng khuẩn 0,6 cm Footer Page 39 of 133 39 Header Page 40 of 133 CHƯƠNG KẾT LUẬN ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận • Trong sản phẩm thủy sản lên men loại mắm, nước mắm, mắm ruốc có chứa vi khuẩn lactic Đã phân lập 83 dòng vi khuẩn lactic từ 37 mẫu mắm nước mắm • Qua trình khảo sát xác định 19 dòng vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn Trong đó, có 12 dòng VKL phân lập từ loại mắm vùng nước lợ mặn, dòng VKL phân lập từ mẫu vùng mắm nước dòng từ sản phẩm nước mắm đóng chai • Độ dày vòng kháng khuẩn với vi khuẩn Pediococcus pentosakeus từ 0,1 – 0,85 cm Trong có dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng kháng khuẩn lớn (hơn 0,6 cm), dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn 0,1 cm nhỏ 5.2 Đề xuất Để đưa kết khảo sát vào thực tiễn, cần tiến hành thêm khảo sát thử khả diệt mầm bệnh động vật thủy sản, đặc biệt bệnh vi khuẩn Gram âm Gram dương gây Cần định danh dòng vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn mạnh để phục vụ nghiên cứu sâu nhóm vi khuẩn Footer Page 40 of 133 40 ... dòng VKL có khả sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản nay, đề tài Phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn lactic từ sản phẩm thủy sản lên men có khả kháng khuẩn ” thực... HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Cán hướng dẫn Sinh vi n thực PGs.Ts NGUYỄN VĂN... dòng VKL có khả sinh chất kháng khuẩn từ sản phẩm thủy sản lên men 1.3 Nội dung nghiên cứu • Phân lập số dòng VKL sản phẩm mắm nước mắm • Kiểm tra khả sinh chất kháng khuẩn từ nhóm VKL phân lập Footer