Header Page of 133 VIỆN NC DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN CÔNG NGHỆ NUÔI CÂY PHÔI DỪA SÁP MAKAPUNO (COCOS NUCIFERA L.) GIAI ĐOẠN PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ VƯỜN ƯƠM Cnđt : TRẦN THỊ NGỌC THẢO 8281 HÀ NỘI – 2010 Footer Page of 133 Header Page of 133 TÓM TẮT Bằng phương pháp nuôi cấy phôi hữu tính, dừa sáp nuôi cấy phôi cho tỷ lệ trái sáp đặc ruột ≥70% Qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp gồm nhiều giai đoạn, nhiên, với qui trình nuôi cấy phôi dừa trước đạt tỉ lệ thành công 19-20%, thời gian nuôi trồng khoảng 20 tháng Nguyên nhân tỷ lệ phôi phát triển thành ống nghiệm thích nghi vườn ươm thấp Đề tài tập trung nghiên cứu giải pháp kỹ thuật phòng thí nghiệm vườn ươm thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện chiếu sáng, hàm lượng đường, chế độ bón phân để làm tăng tỷ lệ nảy mầm, giúp phôi tăng trưởng tốt ống nghiệm thông qua việc cải thiện chồi, rễ làm tăng tỷ lệ sống vườn ươm Đề tài xây dựng qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm, đạt tỷ lệ 37%, thời gian nuôi trồng 15-16 tháng tạo 200 dừa Sáp nuôi cấy phôi vườn ươm MỞ ĐẦU Cơ sở pháp lý đề tài - Căn vào Quyết định số 6363/QĐ-BCT Bộ Trưởng Bộ Công Thương ký ngày 02/12/2008 việc đặt hàng thực nhiệm vụ khoa học công nghệ năm 2009 cho Viện nghiên cứu Dầu Cây có dầu - Căn vào Hợp đồng Nghiên Cứu Khoa học Phát Triển Công nghệ số: 193.RD/HĐ-KHCN ký ngày 16/03/2009 Vụ Khoa Học Công Nghệ, Bộ Công Thương Viện nghiên cứu Dầu Cây có dầu việc thực nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ có tên: Nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm - Căn vào Hợp đồng giao khoán nội số 08/HĐGK-VD ký ngày 07/04/2009 Viện Trưởng Viện nghiên cứu Dầu Cây có dầu với Chủ nhiệm đề tài việc giao khoán thực nhiệm vụ Nghiên cứu Khoa học Phát triển công nghệ Cấp Bộ năm 2009 có tên: Nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm Mục tiêu chung đề tài: Nâng cao tỷ lệ sống dừa Sáp phương pháp nuôi cấy phôi giai đoạn phòng thí nghiệm đến vườn ươm Dự kiến đạt 30- 35% Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm đạt tỷ lệ phôi nảy mầm phát triển thành phòng thí nghiệm dự kiến tăng 20-30% so với qui trình có Footer Page of 133 Header Page of 133 - Rút ngắn thời gian nuôi trồng phòng thí nghiệm - Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống dừa sáp nuôi cấy phôi giai đoạn vườn ươm thông qua việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, xác định nhiệt độ, độ ẩm vườn ươm lựa chọn tổ hợp phân bón phù hợp cho tăng trưởng dừa sáp nuôi cấy phôi - Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm, đạt tỷ lệ 30-35% - Đạt 200 dừa Sáp nuôi cấy phôi vườn ươm Đối tượng nghiên cứu: phôi dừa Sáp đặc ruột thu thập từ huyện Cầu kè, Tỉnh Trà Vinh Phạm vi: Đề tài giới hạn việc nghiên cứu qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp từ giai đoạn phòng thí nghiệm đến vườn ươm Nội dung nghiên cứu: nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm - Nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp (giai đọan phòng thí nghiệm): môi trường dinh dưỡng (nguồn carbon, nitơ, chất điều hòa sinh trưởng ) điều kiện ngoại cảnh (cường độ ánh sáng, phổ màu, cung cấp ôxy, nhiệt độ) để tăng tỷ lệ nảy mầm sống - Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho sinh trưởng non giai đoạn chuyển tiếp phòng thí nghiệm vườn ươm nhằm nâng cao tỷ lệ sống - Nghiên cứu nâng cao tỷ lệ sống dừa nuôi cấy phôi giai đoạn đầu thích nghi vườn ươm thông qua việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật - Nghiên cứu điều kiện nuôi trồng dừa sáp nuôi cấy phôi vườn ươm (giai đoạn thích nghi): nhiệt độ, độ ẩm - Nghiên cứu số tổ hợp phân bón cho dừa Sáp nuôi cấy phôi vườn ươm (bao gồm: phân bón NPK, chế phẩm sinh học, chất điều hòa tăng trưởng thực vật…) - Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm Footer Page of 133 Header Page of 133 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nuôi cấy phôi dừa nước Việc nuôi cấy in vitro phôi dừa hợp tử (zygotic) nhiều tác giả nghiên cứu thành công từ năm trước De Guzman Del Rosario (1974), Assy Bar (1986), Rillo Paloma (1992), Samosir cộng (1999) Các nghiên cứu nhằm mục đích cứu lấy phôi hữu tính phát triển bình thường từ dừa đột biến có giá trị cao dừa Sáp (makapuno) nội nhũ (cơm dừa) lại mềm, xốp chức (Rillo Paloma, 1992) để từ tạo giống cho tỷ lệ trái sáp cao Ngoài phương pháp áp dụng việc chọn lựa in vitro tính trạng trồng khác bảo quan gen dừa nhiệt độ thấp Từ nhiều năm nay, Mạng luới gen dừa quốc tế - Viện Quỹ gen thực vật Quốc tế (COGENT-IPGRI) tài trợ vốn thiết lập ngân hàng bảo tồn nguồn gen dừa quốc nhiều nơi (ICG) Mạng lưới điểm bảo tồn này, có nhiều nơi vào hoạt động nằm khu vực COGENT Đông Nam Á, Nam Á, Nam Thái Bình Dương, Châu Phi, Ấn Độ Dương, Châu Mỹ La Tinh vùng Caribe Mạng lưới ngân hàng gen dừa nơi lưu giữ phần lớn nguồn gen dừa giới bảo vệ chúng cho việc sử dụng tương lai ngành công nghiệp dừa Để hỗ trợ cho việc thành lập ngân hàng bảo tồn gen dừa, việc thu thập nguồn gen phôi mầm riêng biệt miếng nội nhũ nhỏ có chứa phôi di chuyển chúng trường hợp nuôi cấy phôi ống nghiệm (in vitro) trở thành biện pháp mang tính thực tế nhiều công đoạn vận chuyển gen dừa vừa gọn nhẹ, dễ dàng, vừa an toàn mặt kiểm dịch thực vật Cho đến nay, kỹ thuật nuôi cấy phôi dừa tiêu chuẩn quốc tế sử dụng để lập sưu tập nguồn gen dừa sản xuất giống chất lượng cao từ giống dừa đột biến dừa Sáp (makapuno) Phương pháp gọi “Kỹ thuật nuôi cấy phôi mầm lai” (Batugal, 2002), sử dụng để sản xuất giống dừa nơi phôi mầm gửi đến sau vụ trao đổi quốc tế Nhiều khía cạnh mặt sinh lý phát triển trình nuôi cấy in vitro chưa tối ưu điều cho nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thích nghi với điều kiện khí hậu bên phát triển sau đưa khỏi môi trường nuôi cấy Các đặc điểm sinh lý có khả chịu ảnh hưởng kỹ thuât, phát triển rễ, khả quang hợp tính mẫn cảm với bệnh Những nghiên cứu gần Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Quốc tế Úc (2008) với tham gia nhóm nhà khoa học đến từ nhiều quốc gia khác (Úc, Indonesia, Papue Newguinea, Philippines Việt Nam thời gian năm Một số cải tiến đáng kể quy trình sử dụng cho việc vận chuyển gen dừa, tái thiết lập sản xuất giống đột biến chất lượng cao dừa Sáp Makapuno Footer Page of 133 Header Page of 133 1.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa nước Ở Việt Nam, nuôi cấy phôi dừa có công trình từ 1993 ( Nguyễn Hữu Hổ cộng sự, 1993; Nguyễn Thị Hiền, 1996) thực với giống dừa địa phương có tỷ lệ nảy mầm tự nhiên cao, chưa có nghiên cứu thực cho giống dừa quý Viện nghiên cứu Dầu có dầu nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa từ năm 1996 nhận trợ giúp tài từ Chính phủ Việt Nam, IPGRICOGENT, gần thông qua Đại học Queensland (Australia) dự án ACIAR Nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo cộng (Viện nghiên cứu Dầu có dầu) nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa điều kiện in vitro từ năm 1999 giống dừa Ta xanh Lùn vàng Mã Lai Từ năm 2000 đến 2001, tài trợ IPGRI-COGENT, Nhóm tác giả nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa Sáp (Makapuno), dừa Ẻo điều kiện in vitro Đến năm 2003-2004, nhóm tác giả tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện, nâng cao qui trình nuôi cấy phôi phòng thí nghiệm thông qua việc tìm môi trường thích hợp cho nuôi cấy phôi dừa Sáp dừa Dứa, nghiên cứu ảnh hưởng thời gian trữ lạnh đến khả nảy mầm phôi dừa Sáp Bên cạnh đó, nhóm tác giả nghiên cứu ảnh hưởng giá thể trồng, chế độ tưới, chế độ ánh sáng, độ ẩm đến tỷ lệ sống dừa nuôi cấy phôi vườn ươm Từ cho thấy, việc tìm điều kiện nuôi trồng vườn ươm giúp dừa cấy phôi thích nghi với điều kiện ex-vitro vấn đề khó khăn lại thiết thực Song song đó, với tài trợ Trường Đại học Queensland (Australia) thông qua dự án ACIAR thực từ năm 2003-2005, nhóm tác giả nghiên cứu ảnh hưởng IBA NAA đến tạo rễ phôi dừa Dứa Xiêm, nghiên cứu ảnh hưởng việc cắt dây treo (haustorium) phôi trình nuôi cấy để hạn chế tỷ lệ chết dừa nuôi cấy phôi chuyển vườn ươm Và thông qua dự án Phát triển sản xuất giống Dừa (giai đoạn 2001-2005) Bộ Công Nghiệp, nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo cộng nghiên cứu nuôi trồng giống dừa quý Sáp Dứa, trồng đồng khoảng 5ha Tuy nhiên, tỷ lệ thành công chưa cao Từ phôi đưa vào nuôi cấy trưởng thành để trồng đồng 19-20% 1.3 Qui trình nuôi cấy phôi dừa có Viện Từ năm 2001-2005 viện Nghiên Cứu Dầu Cây Có Dầu bước đầu thực thành công việc nhân giống dừa sáp cách nuôi cấy phôi dừa điều kiện in vitro Dưới quy trình mô tả lại : Giai đoạn 1: Chọn trái giống Footer Page of 133 Header Page of 133 Dừa sáp lấy Cầu Kè Trà Vinh, chọn trái giống không bị hư, khoảng tháng tuổi Ở giai đoạn tỷ lệ trái sử dụng để lấy phôi bị hao hụt khoảng 80% Giai đoạn : Tách phôi khử trùng Cấy phôi nuôi phôi Phôi dừa sau lấy với lớp cơm dừa khử trùng với javen 100% 10-15 phút Rửa phôi nước vô trùng khoảng 4-5 lần Tách phôi Cấy phôi vô trùng vào ống nghiệm có chứa 50 ml môi trường chuẩn Y3 (chi tiết xem phụ lục) Các ống nghiệm chứa phôi mang nuôi cấy phòng sáng nhiệt độ 28 C ± 20C, ánh sáng 4.000 lux, thời gian chiếu sáng 9h/ngày Cấy chuyền phôi hàng tháng (10 lần/10tháng) Phôi dừa bắt đầu nảy mầm sau khoảng 3-4 tuần, khoảng 10-11 tháng hình thành đầy đủ phận thân, lá, rễ Trong khoảng thời gian cần định kỳ cấy chuyền tháng lần nhằm thay môi trường cũ cạn kiệt dinh dưỡng môi trường giàu dinh dưỡng hơn, tạo điều kiện cho phát triển khỏe mạnh cân đối Cây trưởng thành ống nghiệm chuẩn bị chuyển vườn ươm phải đạt kích thước chiều cao ≥ 15cm, có mở hoàn toàn có rễ thứ cấp Kết thúc giai đoạn nuôi cấy phôi phòng thí nghiệm, tỷ lệ phôi sống sót phát triển thành khoảng 40% Giai đoạn 3: Giai đoạn thích nghi phòng thí nghiệm Cây trưởng thành ống nghiệm chuẩn bị chuyển vườn ươm nên cần có giai đoạn thích nghi phòng thí nghiệm Các dừa cấy vào môi trường Y3 có nồng độ đường 4,5% đặt vào điều kiện phòng thí nghiệm có nhiệt độ 30oC, độ ẩm 60% cường độ chiếu sáng 5.000 lux Giai đoạn thích nghi phòng thí nghiệm thực khoảng 1-2 tháng Giai đoạn : làm thích nghi vườn ươm Cây dừa phòng thí nghiệm đem trồng túi PE 15 có pha cát, xơ dừa, phân chuồng theo tỷ lệ (1:1:1) Nuôi trồng dừa bịch PE khoảng tháng Cây sống sót từ giai đoạn đạt 60-70% Giai đoạn 5: Trồng vườn ươm Sau trồng thích nghi vườn ươm, chuyển sang giá thể trồng khác đất trồng túi PE 25 Cây sống sót giai đoạn đạt 80-90% Cây đạt tiêu chuẩn đưa vườn trồng có chiều cao ≥ 40cm, có xanh, chu vi gốc ≥ 10cm Footer Page of 133 Header Page of 133 Giai đoạn 6: Trồng đồng Sau trồng giai đoạn thích nghi dừa cứng cáp có khả chống chịu cao, đem trồng đồng, tăng lượng phân bón lên 1/3 so với khuyến cáo trồng dừa Tỷ lệ sống giai đoạn khoảng 95% -100% Như vậy, sau trình nuôi cấy phôi khoảng 12-13 tháng, tỷ lệ phôi phát triển thành xanh tốt vườn ươm đạt tiêu chuẩn trồng đồng 19-20% Nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ thành công thấp do: • Tỷ lệ phôi bị chìm hoàn toàn môi trường đưa vào nuôi cấy chiếm 10-15%, phôi hầu hết không phát triển chết • Tỷ lệ phôi phát triển bất thường cao chiếm khoảng 10-30% (các phôi phát triển bất thường phôi phát triển hay rễ, hay mở) • Tỉ lệ phôi phát triển thành hoàn chỉnh ống nghiệm đủ tiêu chuẩn đưa vườn ươm thấp (khoảng 40%) • Hệ thống rễ nghèo nàn (lá nhỏ, phát triển chậm, rễ có rễ thứ cấp) • Khả thích nghi vườn ươm thấp (Tỷ lệ sống sót vườn ươm khoảng 60-70%) Như vấn đề cần giải đề tài phải định hướng cho phôi phát triển đưa vào nuôi cấy cải tạo hệ thống chồi rễ để cao tỷ lệ nảy mầm phát triển thành hoàn chỉnh có đầy đủ rễ ống nghiệm Ngoài ra, đề tài cải thiện tỷ lệ sống dừa nuôi cấy phôi giai đoạn vườn ươm Footer Page of 133 Header Page of 133 Quy trình nuôi cấy phôi dừa sáp năm 2001-2005: Chọn trái giống, cấy phôi 80% 50ml môi trường Y3 + IBA 2mg/l ĐK : 28 ± 20C, 4000lux, 9h/ngày Cấy truyền tháng 40% Chọn trái tháng tuổi, không sâu bệnh Tách phôi khử trùng với javel 10 đến 15 phút 10 lần 50 ml Y3 + đường 6% + IBA 2mg/l, ĐK : 26 ± 20C, 4000lux, 9h/ngày.10-11 tháng Cây dừa phát triển đầy đủ lá, rễ ống nghiệm Tỷ lệ đạt 19,2% 60%-70% 50ml Y3 với đường 4,5%, tháng Làm thích nghi trồng giai đoạn 80-90% Túi PE 15, cát-bụi dừa-phân chuồng (1:1:1), 3-4 tháng Trồng giai đoạn vườn ươm 100% Túi PE 30, giá thể: đất, tháng Trồng đồng, phân bón tăng 1/3 so với giai đoạn Footer Page of 133 Header Page of 133 Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt phòng thí nghiệm có đủ điều kiện để đưa vườn ươm là: • Cây phát triển xanh tốt • Cây rễ phát triển cân đối • Cây có mở có rễ phụ Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt vườn ươm đủ tiêu chuẩn để đưa vườn trồng khi: • Cây phát triển xanh tốt, không sâu bệnh • Cây đạt chiều cao ≥ 40cm • Cây có 5-6 xanh • Đường kính gốc ≥ 30mm 1.4 Sơ lược đối tượng nghiên cứu: dừa Sáp (Cocos nucifera L.) 1.4.1 Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Bộ : Arecales Họ : Arecaceae Chi : Coconuts(cocos) Loài : Cocos nucifera 1.4.2 Đặc điểm hình thái trái dừa sáp Dừa sáp (Makapuno) giống dừa đột biến từ giống dừa cao Laguna, có nguồn gốc từ Philippines Dừa sáp gọi dừa đặc ruột, dừa kem, thuộc giống dừa cao Dừa sáp chất có đặc điểm sinh học giống loại dừa thường khác, có cơm dừa (nội nhũ) đặc biệt khác Dựa vào độ đặc ruột cơm dừa, dừa Sáp chia thành nhóm với kiểu đặc ruột kiểu A, B C với độ đặc ruột tương ứng tăng dần, với kiểu A đặc ít, khoảng 1/3 bán kính trái dừa, kiểu C gần nước dừa sáp có lớp cơm màu trắng dày (có choán hết phần ruột) giống sáp đèn cầy, chất lỏng sệt nước cơm chắt Không cơm dừa bình thường, non mềm ngọt, già cứng cạy Cơm dừa sáp mềm dẻo bột quánh lại, béo có mùi thơm đặc trưng Nước dừa sáp Thông thường quày dừa sáp có 12 trái, có khoảng 3-4 trái có sáp, chí trái nào, tùy theo nhiều yếu tố 1.4.3 Giá trị kinh tế dừa sáp Footer Page of 133 Header Page 10 of 133 Dừa Sáp Makapuno có giá trị kinh tế cao, phục vụ cho ngành du lịch, chế biến thực phẩm…, giá thành trái dừa sáp cao gấp 20-30 lần trái dừa thường Hiện nay, dừa sáp mệnh danh loại dừa mắc Việt Nam với giá dao động từ 100.000đ đến 120.000đ/trái Đây loại trái giải khát độc đáo Huyện Cầu Kè tỉnh Trà Vinh, không đâu sánh được, kể xứ sở tiếng dừa Bến Tre Tất phần dừa sáp từ thân, lá, trái, vỏ, xơ, gáo, nước… sử dụng phục vụ đời sống người Do vậy, với giá thành trái dừa sáp với hương vị thơm ngon trái dừa sáp phần giúp đỡ cho tiềm du lịch địa phương phát triển Bên cạnh giải công ăn việc làm, ổn định đời sống kinh tế cho người nông dân Hiện nay, Philippines quốc gia hàng đầu sản xuất dừa Sáp nuôi cấy phôi, với 10 phòng thí nghiệm chuyên sản xuất giống dừa chưa đủ giống cung cấp cho nhu cầu sản xuất giá dừa giống cao, số công ty tư nhân đủ khả đầu tư trồng dừa Sáp phải đặt mua giống trước 1-2 năm Bảng 1.1: Giá dừa Sáp nuôi cấy phôi nước khác Năm 2007 Quốc gia Philippines Indonesia Giá trái Sáp 30 Peso/trái (~0,65USD/trái) 2-3 USD/trái Giá dừa NCP 500 Peso/cây (~11 USD/cây) 30 USD/cây 2008 Philippines 600 Peso/cây (~14 USD/cây) 2009 Philippines 600 Peso/cây (~14 USD/cây) 2010 Philippines 60 Peso/trái (~1,35 900 Peso/cây (~21 USD/cây) USD/trái) Mặc dù giá dừa giống cấy phôi cao, người dân khó có khả tiếp cận, tiềm lợi nhuận lớn, dừa Sáp nuôi cấy phôi sau 3,5 năm trồng cho suất trái sáp 70% nên cần sau -2 đợt thu hoạch thu hồi vốn đầu tư thu hoạch 40-50 năm 1.4.4 Phương pháp nhân giống dừa Sáp Trồng dừa sáp theo phương pháp truyền thống: dùng trái không đặc dừa sáp để ươm làm giống cho tỷ lệ nảy mầm khoảng 60-70% Tuy nhiên Footer Page 10 of 133 Header Page 54 of 133 3.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi trồng dừa sáp nuôi cấy phôi vườn ươm (giai đoạn thích nghi): nhiệt độ, độ ẩm Bảng 3.5: Tỷ lệ sống gia tăng số tiêu nông sinh học dừa sáp nuôi cấy phôi nuôi trồng điều kiện nhiệt độ độ ẩm khác sau tuần nuôi trồng vườn ươm: Số Chiều rộng ĐK gốc Chiều Nghiệm Tỷ lệ sống Chiều cao mọc (cm) (cm) dài thức (%) (cm) thêm (cm) (lá) b ĐK1 65,00 6,10 6,00 0,50b 0,43b 0,50b ĐK2 77,50ab 6,80 6,20 0,80ab 1,00ab 0,90a ĐK3 87,50a 7,00 6,70 1,35a 0,90a 1,00a CV (%) 10,43 8,79 7,59 37,92 33,52 16,40 LSD0,05 13,83 0,58 0,45 0,23 P * * * ** ns ns Sau tuần trồng vườn ươm, kết cho thấy điều kiện ĐK3 nhiệt độ 30 ± 2oC với ẩm độ tương đối không khí 80-90% cho tỷ lệ sống cao 87,5%, tăng trưởng tốt thể qua gia tăng tiêu sinh trưởng chiều cao TB (6,80 cm), chiều dài TB(6,2 cm), số xanh mọc thêm TB(1 lá), chiều rộng TB (0,9 cm), đường kính gốc TB (1 cm) Các từ nuôi cấy in vitro có lớp sáp cutin bề mặt mỏng nhiều so với tương tự trồng nhà kính hay đồng Sự giảm lớp sáp cutin làm in vitro nước nhanh bình thường gây bất lợi cho in vitro chuyển vườn ươm Độ ẩm cao bình nuôi xem nguyên nhân làm giảm lớp sáp cutin Ánh sáng thấp góp phần giảm Một lý khác nước hoạt động không hiệu khí Để thích nghi dừa nuôi cấy phôi, cần trì độ ẩm tương đối cao thời gian đầu Cây thích nghi nhờ giảm dần độ ẩm tương đối khí Mặt khác, in vitro (độ ẩm 100%, nhiệt độ thấp) chuyển điều kiện ex vitro (có nhiệt độ cao, độ ẩm không khí thấp) cần phải có giai đoạn thích nghi điều kiện nhiệt độ 30 ± 2oC, độ ẩm không khí cao 80-90% (được tạo nhờ hệ thống phun sương) giúp thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, cải thiện tỷ lệ sống vườn ươm Footer Page 54 of 133 53 Header Page 55 of 133 3.6 Nghiên cứu số tổ hợp phân bón cho dừa Sáp nuôi cấy phôi vườn ươm (bao gồm: phân bón NPK, chế phẩm sinh học, chất điều hòa tăng trưởng thực vật…) Sau giai đoạn thích nghi, dừa sáp trồng giá thể gồm đất mặt, phân chuồng, tro trấu, bụi dừa tỷ lệ 2:1:1:1 bổ sung thêm số tổ hợp phân bón nhằm giúp tăng tưởng tốt Biểu đồ biểu diễn tăng trưởng chiều cao theo thời gian - thí nghiệm bón phân chiều cao (cm) 70.00 60.00 50.00 TH1 40.00 TH2 30.00 TH3 20.00 TH4 10.00 12 Thời gian (tuần) Bảng 3.6: Một số tiêu nông sinh học dừa sáp nuôi cấy phôi vườn ươm sau 12 tuần bón phân với tổ hợp phân bón khác nhau: Tổ hợp phân bón Chiều cao (cm) Chiều dài (cm) TH1 TH2 TH3 TH4 CV (%) LSD0,05 P 47,70b 60,37a 51,09b 48,39b 6,88 7,14 * 34,90b 39,68a 36,88b 35,78b 3,49 2,57 * Đường kính (cm) 7,76 10,70 9,31 8,13 20,88 ns Số xanh (lá) 6,87 7,40 7,21 6,92 16,27 ns Đường kính gốc (cm) 4,83b 5,90a 4,97b 5,13b 5,31 0,55 * Sau 12 tuần, dừa sáp nghiệm thức TH2 (phân bón NPK 30-10-10 liều lượng 2g/lít kết hợp với phân bón vi lượng, vitamin B1 kích thích tăng rễ NAA liều lượng ml/lít, ngày/lần) cho kết tốt nhất, chiều cao đạt 60,37cm; chiều dài 39,68cm; chiều rộng 10,70cm; số xanh trung bình 7,4 lá, đường kính gốc đạt 5,9cm Nghiệm thức có kết hợp đầy đủ Footer Page 55 of 133 54 Header Page 56 of 133 yếu tố đa lượng, vi lượng, vitamin đặc biệt có chất kích thích rễ NAA hấp thu qua giúp tăng cường dưỡng chất cho cây, mát kích thích rễ để hấp thu chất dinh dưỡng hữu từ hỗn hợp đất mặt- phân chuồng- tro trấu giá thể trồng Ảnh 3.6.1: Bố trí lô thí nghiệm bón phân Ảnh 3.6.2: Chăm sóc dừa nuôi cấy phôi Footer Page 56 of 133 55 Header Page 57 of 133 TH4 TH3 TH2 TH1 Ảnh 3.6.3: Cây dừa Sáp nuôi cấy phôi sau 12 tuần bón phân với tổ hợp phân bón khác 3.7 Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm: Kế thừa kết nghiên cứu qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Viện năm trước, đề tài cải tiến số vấn đề môi trường nuôi cấy, điều kiện thích nghi cho giai đoạn chuyển tiếp phòng thí nghiệm vườn ươm điều kiện nuôi trồng vườn ươm nhằm nâng cao tỷ lệ thành công qui trình Sau xin đề xuất qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm Footer Page 57 of 133 56 Header Page 58 of 133 Đề xuất qui trình nuôi cấy phôi dừa cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm 1- Giai đoạn chọn trái giống cấy phôi tháng 86,67% 2- Giai đoạn cấy truyền (cấy tháng) ½ tháng 64,33% 3- Giai đoạn thích tuần nghi (chuyển6tiếp PTN-vườn ươm) 86,67% tuần 4- Giai đoạn thích nghi vườn ươm 87,5% tháng 5- Giai đoạn trồng vườn ươm tháng 87,5% 6- Giai đoạn trồng bầu lớn 3-4 tháng 100% Chọn trái 10-11 tháng tuổi không sâu bệnh Cấy phôi vào môi trường Y3 cải tiến + đường 6% (Y3 có N tăng thêm ½ + IBA 2mg/l + BA 5mg/l) ĐK: 4.000lux, 9h/ngày Phôi chìm nuôi cấy lắc 25 ± 2oC Lần & 2: MT N2 + đường 6%: tháng Lần & 4: MT N2 + đường 4,5% : tháng Lần 5: MT N2 + đường 2% + ánh sáng đỏ 3.000lux, 9h/ngày: tuần Cấy truyền lần 6: MT N2 + tinh bột 2% Đặt ống nghiệm ánh sáng tự nhiên vườn ươm che lưới giảm nắng Cây lá, có rễ phụ Xử lý Alpine (Fosetyl-Aluminum 80%) 2g/l, phút Giá thể: cát-bụi dừa-phân chuồng (1:1:1) Nhiệt độ: 30 ± 2oC, độ ẩm: 80-90% Giá thể: đất mặt- phân chuồng-bụi dừa-tro trấu (2:1:1:1) Điều kiện tự nhiên nhà lưới Bón phân: NPK 30-10-10 (2g/l)+ HVP Vitamin B1 PLHK (1ml/l), ngày/lần Cây phát triển tốt, không sâu bệnh, chiều cao ≥40cm, đường kính gốc ≥3cm, có 7- Giai đoạn trồng đồng Như vậy, thời gian từ đưa phôi vào ống nghiệm đến xuất vườn trồng đồng 15-16 tháng, tỷ lệ thành công qui trình 37% Footer Page 58 of 133 57 Header Page 59 of 133 Qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp năm 2005 Qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp cải tiến năm 2010 Giai đoạn chọn trái giống cấy phôi Chọn trái: tháng tuổi Cấy vàomôi trường Y3 + IBA 2mg/l + đường 6% Ánh sáng trắng, 4.000lux, 9h/ngày Nhiệt độ: 26 ± 2oC, Thời gian: tháng Tỷ lệ đạt: 80% Chọn trái: 10-11 tháng tuổi Cấy vào môi trường Y3 cải tiến N2 + IBA 2mg/l + BA 5mg/l + đường 6% Ánh sáng trắng, 4.000lux, 9h/ngày,1 tháng Phôi chìm nuôi cấy lắc 25 ± 2oC Tỷ lệ đạt 86,67% Giai đoạn cấy chuyền Môi trường Y3 + IBA 2mg/l + đường 6% Ánh sáng trắng, 4.000lux, 9h/ngày Thời gian: 10 (cấy truyền 10 lần) Tỷ lệ đạt: 40% Lần & 2: MT N2 + đường 6%: tháng Lần & 4: MT N2 + đường 4,5% : tháng Từ lần 1-4: ánh sáng trắng 4.000lux, 9h/ngày Lần 5: MT N2 + đường 2% + ánh sáng đỏ 3.000lux, 9h/ngày: tuần Tỷ lệ đạt: 64,33% Giai đoạn thích nghi (chuyển tiếp PTN-vườn ươm) Cấy vào môi trường Y3 + IBA 2mg/l + đường 4,5%, đặt nhiệt độ PTN: 30oC Thời gian: 1-2 tháng Tỷ lệ đạt: 60-70% Cấy chuyền lần 6: MT N2 + tinh bột 2% Đặt ống mghiệm ánh sáng tự nhiên vườn ươm che lưới giảm sáng Thời gian: tuần Tỷ lệ đạt: 86,67% Giai đoạn thích nghi vườn ươm Cây lá, có rễ phụ, xử lý Alpine (Fosetyl-Aluminum 80%) 2g/l, phút Nhiệt độ: 30 ± 2oC, độ ẩm: 80-90% Giá thể: cát-bụi dừa-phân chuồng (1:1:1), tháng Tỷ lệ đạt: 87,5% Giai đoạn trồng vườn ươm Giá thể: cát-bụi dừa-phân chuồng (1:1:1), Thời gian: 3-4 tháng Tỷ lệ đạt: 80-90% Giá thể: đất mặt- phân chuồng-bụi dừa-tro trấu (2:1:1:1) Phân: NPK 30-10-10 (2g/l)+ HVP B1 PL-HK (1ml/l), ngày/lần Thời gian: tháng Tỷ lệ đạt: 87,5% Giai đoạn trồng bầu lớn Giá thể: đất, Thời gian: 3-4 tháng Tỷ lệ đạt: 100,00% Phân: NPK 30-10-10 (2g/l)+ HVP B1 PL-HK (1ml/l), Cây phát triển tốt, không sâu bệnh, chiều cao ≥40cm, đường kính gốc ≥3cm, có Thời gian: tháng Tỷ lệ đạt: 100,00% Giai đoạn trồng đồng Footer Page 59 of 133 58 Header Page 60 of 133 Những ưu điểm qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến so với qui trình trước − Qui trình cải tiến từ khâu chọn nguyên liệu nuôi cấy đến thành phần môi trường điều kiện ngoai cảnh phòng thí nghiệm giúp định hướng phát triển phôi, làm tăng tỷ lệ nảy mầm phát triển thành hoàn chỉnh phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn đưa vườn ươm (đặc biệt tỷ lệ thành công giai đoạn –giai đoạn cấy chuyền) Tỷ lệ tăng đáng kể so với qui trình trước 24,33% − Rút ngắn thời gian nuôi cấy phòng thí nghiệm trồng vườn ươm từ 20 tháng xuống 15-16 tháng Từ giảm chi phí điện nguyên liệu cần phải cung cấp cho trình nuôi trồng Bảng 3.7.1: Tổng chi phí sản xuất 1.000 dừa Sáp phương pháp nuôi cấy phôi (2 năm) TT Nội dung Tổng chi phí (đồng) Tổng chi phí sản xuất A 17.800.000 Nguyên vật liệu, bao bì 270.000.000 Trái giống, vận chuyển 10.000.000 Hóa chất 42.200.000 Điện, nước 120.000.000 Nhân công 22.600.000 Chi phí quản lý Chi phí gián tiếp khấu hao tài sản cố B 10.000.000 định Khấu hao thiết bị 20.000.000 Khấu hao nhà xưởng 5.000.000 Chi phí khác 30.000.000 C Thu hồi cơm dừa sáp Tổng chi phí sản xuất (A+B-C): 487.600.000 Giá thành giống 487.600 Giá bán đề xuất giống 600.000 Footer Page 60 of 133 59 Header Page 61 of 133 Bảng 3.7.2: Chí phí tạm tính để trồng dừa Sáp giống năm TT Chí phí trồng Cây giống Phân bón, thuốc BVTV Nhân công chăm sóc Tổng cộng Thành tiền (đồng) 600.000 100.000 200.000 900.000 Như sau khoảng 3,5 đến năm trồng, chi phí đầu tư giống 900.000 đồng năm thứ bắt đầu thu hoạch trái với suất 70% trái sáp, sau 1-2 đợt thu hoạch người trồng dừa thu hồi vốn đầu tư năm thứ bắt đầu thu lãi, thời gian thu họach kéo dài 40-50 năm Điều cho thấy tìm kinh tế dừa Sáp nuôi cấy phôi lớn Footer Page 61 of 133 60 Header Page 62 of 133 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: - Môi trường N2 (môi trường Y3 có hàm lượng nitơ tổng tăng thêm ½ ) làm tăng tỷ lệ nảy mầm phôi dừa Sáp giúp phôi tăng trưởng to khỏe - Sự kết hợp loại chất điều hòa tăng trưởng thực vật IBA 2mg/l BA 5mg/l môi trường N2 kích thích nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm đạt 86,67%, làm giảm tỷ lệ phôi phát triển bất thường, tăng tỷ lệ phôi phát triển thành hoàn chỉnh cân đối ống nghiệm, đạt 64,33% (tăng 24,33%) - Đối với phôi chìm giai đoạn đầu cấy vào môi trường sử dụng phương pháp nuôi cấy lắc nhiệt độ 25± 2oC giúp 63,33% phôi chìm nảy mầm 43,33% số phát triển thành - Ở lần cấy truyền 3-4 (cây dừa nuôi cấy phôi có lá), cần cấy môi trường N2 có nồng độ đường giảm 4,5% lần cấy truyền thứ nồng độ đường 2% để giảm stress cho giúp thích nghi dần với điều kiện vườn ươm - Trong điều kiện phổ ánh sáng đỏ đèn huỳnh quang tạo cường độ 3.000 lux, phát triển nhanh ánh sáng trắng, giúp rút ngắn thời gian nuôi cấy tiết kiệm lượng - Ngoài ra, để giúp thích nghi dễ dàng với điều kiện vườn ươm tiết kiệm lượng nuôi phôi phòng thí nghiệm, lần cấy truyền cuối (lần 6) sử dụng môi trường N2 có dùng tinh bột 20g/l thay cho đường mang dừa sáp nuôi cấy phôi ống nghiệm đặt điều kiện vườn ươm có lưới che giảm nắng Tỷ lệ sống dừa đưa vườn ươm sau giai đọan thích nghi 86,67% - Khi chuyển vườn ươm (giai đoạn thích nghi vườn ươm) cần xử lý với thuốc Alpine (hoạt chất Fosetyl-Aluminum 80%) 2g/l phút Nhiệt độ: 30 ± 2oC, độ ẩm: 80-90% - Phun phân bón NPK 30-10-10 (2g/l)+ HVP B1 PL-HK (1ml/l), ngày/lần giúp tăng tưởng nhanh khỏe - Đã xây dựng qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm có tỷ lệ thành công 37% - Đã nuôi trồng 200 dừa Sáp nuôi cấy phôi vườn ươm Kiến nghị: Đề nghị Hội đồng nghiệm thu qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm vườn ươm Footer Page 62 of 133 61 Header Page 63 of 133 Tuy đề tài cải thiện đáng kể tỷ lệ thành công qui trình, tồn số vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu như: nghiên cứu sâu môi trường dinh dưỡng đảm bảo đáp ứng nhu cầu sinh trưởng theo giai đoạn, cần có nghiên cứu thích nghi trước chuyển giai đoạn để làm tăng tỷ lệ sống Footer Page 63 of 133 62 Header Page 64 of 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Dương Công Kiên Nuôi Cấy Mô Thực Vật Nhà xuất Đại học quốc gia TP.HCM, 2002 Dương Công Kiên Nuôi Cấy Mô Thực Vật Nhà xuất Đại học quốc gia TP.HCM, 2003 Vũ thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo, Trương Thiện Trí, Nguyễn Tuấn Anh, Võ Phan Misa Công nghệ nuôi cấy phôi dừa Việt Nam Tuyển tập công trình khoa học nghiên cứu phát triển có dầu dầu thực vật Việt Nam Trang 159-167, 2005 Vũ thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo, Trương Thiện Trí, Nguyễn Tuấn Anh, Võ Phan Misa Kết công nghệ nuôi cấy phôi dừa Việt Nam Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn Số 23 Trang 135-138, 2005 Trần Văn Minh, Công Nghệ Sinh Học Thưc Vật (Plant Biotechnology) Trường Đại học Văn Lang TP.HCM, 2004 Dương Tấn Nhựt Một số kỹ thuật nhân giống vô tính lan hài (Paphiopedilum delenatii), Hội Thảo ứng dụng kỹ thuật nhân giống nuôi trồng hoa lan TP HCM, trang 13-21, 2007 Nguyễn Thị Quỳnh, Vũ Ngọc Phượng, Nguyễn Đình Sỹ, H H Đức Ảnh hưởng nồng độ đường điều kiện ánh sáng lên tăng trưởng lan Dendrobium nuôi cấy in vitro Tạp chí Khoa học & Công nghệ 44 (3), trang 100-106, 2006 Bùi Trang Việt Sinh lý thực vật đại cương Phần I: Dinh dưỡng Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, 348 trang, 2002 Tài liệu tiếng nước ngoài: Ambrosio Raul R Alfiler, Coconut embryo culture Specialized training course on Coconut research and development, 89 pgs , 2001 Chan J-L., L Saénz, C Talavera, R Hornung, M Robert, C Oropeza Reganeration of coconut (Cocos nucifera L.) from plumule explants through somatic embryogenesis Plant cell reports (1998) 17: 515-521, 1997 Elida P Rillo Coconut embryo culture Internatioal Symposium on Coconut Biotechnology, 1997 Footer Page 64 of 133 63 Header Page 65 of 133 Pablito M Magdalita et al., Effect of Physical, Chemical anh Lighr treatments on Germination anh Growth of Tissue cultured coconuts, Institute of Plant Breeding, Philippines, 2004 Pons A.Batugal, F Engelmann Coconut Embryo In Vitro culture, COGENT, IPGRI, 164 pages, 1997 Stephen W Adkins et al., Development of an embryo culture manual and an embryo transplantation technique for coconut germplasm movement and seedling production of elite coconut types Final Report – ACIAR Project FR2008-19a (Hort/1998/061) ACIAR, Australia, Page 01-30, 2008 Vu thi My Lien et al, Coconut embryo culture in Vietnam Coconut embryo in vitro culture: Part II IPGRI-COGENT Page 89-101,2002 Vu thi My Lien, Tran Thi Ngoc Thao, Truong Thien Tri, Nguyen Tuan Anh, Vo Phan Misa Coconut embryo culture in Vietnam Report Midterm Review Meeting Madang School of land and food sciences The University of Queensland Brisbane, Australia Page 72-78, 2004 Vu thi My Lien, Tran Thi Ngoc Thao, Truong Thien Tri, Nguyen Tuan Anh, Vo Phan Misa Coconut embryo culture in Vietnam Final Report – ACIAR Project (Hort/1998/061) The University of Queensland Brisbane Page 159-167,2005 Footer Page 65 of 133 64 Header Page 66 of 133 PHỤ LỤC Môi trường Y3 (Eeuwens 1976) Hóa chất NH4Cl 535 KNO3 2.020 MgSO4.7H2O 247 CaCl2.2H2O 294 KCl Footer Page 66 of 133 Khối lượng (mg/l) Các thành phần bổ sung 1.492 NaH2PO4.2H20 312 KI 8,3 H3BO3 3,1 MnSO4.H2O 8,63 ZnSO4.7H2O 7,2 CuSO4.5H2O 0,25 COCl2.6H20 0,24 NaMoO4.H2O 0,24 NiCl.6H2O 0,024 Fe2SO4.7H2O 13,9 Na2EDTA 37,3 Myo_inositol 100 Pyridoxine (B6 ) 0,05 Thyamine HCl (B1) 0,05 Nicotinic acid 0,05 Ca_D_Pantothenate 0,05 Biotin 0,05 - Đường: 60 g/l môi trường - Than hoạt tính: 1g/l môi trường - PH: 5,5 – 65 Header Page 67 of 133 Môi trường Y3 cải tiến hàm lượng N N0 (mg/l) N1 (mg/l) N2 (mg/l) NH4Cl 535 535 535 KNO3 2.020 2.020 2.020 MgSO4.7H2O 247 247 247 CaCl2.2H2O 294 294 294 1.492 1.492 1.492 312 312 312 400 600 KI 8,3 8,3 8,3 H3BO3 3,1 3,1 3,1 MnSO4.H2O 8,63 8,63 8,63 ZnSO4.7H2O 7,2 7,2 7,2 CuSO4.5H2O 0,25 0,25 0,25 COCl2.6H20 0,24 0,24 0,24 NaMoO4.H2O 0,24 0,24 0,24 NiCl.6H2O 0,024 0,024 0,024 Fe2SO4.7H2O 13,9 13,9 13,9 Na2EDTA 37,3 37,3 37,3 Myo_inositol 100 100 100 Pryridoxine (B6 ) 0,05 0,05 0,05 Thyamine HCl (B1) 0,05 0,05 0,05 Nicotinic acid 0,05 0,05 0,05 Ca_D_Pantothenate 0,05 0,05 0,05 Biotin 0,05 0,05 0,05 Hóa chất KCl NaH2PO4.2H20 NH4NO3 Footer Page 67 of 133 Các thành phần bổ sung - Đường: 60 g/l môi trường - Than hoạt tính: 1g/l môi trường - PH: 5,5 - 66 Header Page 68 of 133 Công thức tính hàm lượng Nitơ bổ sung Theo công thức môi trường Y3 chuẩn, Nitơ cung cấp dạng hợp chất: NH4Cl KNO3 chất khoáng đa lượng, N vi lượng không đáng kể ˜ Sử dụng 535 mg NH4Cl (M=53,5 g/mol),trong N (M=14) Theo công thức tam suất: Lượng N sử dung là: 535 × 14 =140 (mg) 53.5 (1) ˜ Sử dụng 2020 mg KNO3 (M=101g/mol), N (M=14) Theo công thức tam suất: Lượng N sử dụng là: 2020 × 14 =280 (mg) 101 (2) Theo (1) (2), hàm lượng Nitơ tổng sử dụng môi trường Y3 là: 140+280 = 420 (mg) a) Tăng hàm lượng Nitơ tổng lên 1/3 cách bổ sung NH4NO3 (M=80 g/mol) Trong 80g NH4NO3 có 28g N Suy hàm lượng NH4NO3 cần bổ sung là: 420 80 = 400 (mg) × 28 b) Tăng hàm lượng Nitơ tổng lên 1/2 cách bổ sung NH4NO3 (M=80 mg) Trong 80 mg NH4NO3 có 28 mg N Suy hàm lượng NH4NO3 cần bổ sung là: 420 80 × = 600 (mg) 28 Footer Page 68 of 133 67 ... việc nghiên cứu qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp từ giai đoạn phòng thí nghiệm đến vườn ươm Nội dung nghiên cứu: nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp giai đoạn phòng. .. nhiệm vụ Nghiên cứu Khoa học Phát triển công nghệ Cấp Bộ năm 2009 có tên: Nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai đoạn phòng thí nghiệm... Học Công Nghệ, Bộ Công Thương Viện nghiên cứu Dầu Cây có dầu việc thực nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ có tên: Nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos