Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hiện kỹ thuật cố định tế bào đề cập quan tâm nhiều đặc biệt lĩnh vực lên men sản xuất sản phẩm trao đổi chất Tế bào cố đọnh có nhiều ưu điểm tế bào tự như: Enzyme tế bào ổn định enzyme dạng tự tế bào gắn chất mang polymer tự nhiên, cố định tế bào vi sinh vật khơng đồi hỏi khâu tách chiết tinh sản phẩm Tế bào vi sinh vật cố định khơng bị lẫn vào sản phẩm chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn Có thể sử dụng nhiều lần theo chu kỳ liên tục Acid lactic sản phẩm q trình lên men lactic vi khuẩn lactic Có ứng dụng nhiều cơng nghiệp, thực phẩm, y dược Trong cơng nghiệp nhẹ, acid lactic dung mơi cho cơng nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm thuộc da…, cơng nghệ thực phẩm ứng dụng để làm chua quả, sản xuất dưa chua, sản phẩm lên men từ sữa,sản xuất loại sữa bột giàu canxi … Trong y học, người ta sử dụng vật liệu có tên purasorb ( hợp chất cao phân tử sản xuất từ acid lactic) Purasorb sử dụng đinh gim, gắn phần xương lại với Ngồi nhà khoa học nghiên cứu tạo vật liệu sinh học dùng y học copolyme acid lactic, chất dẻo thay cho chất dẻo cũ khó phân hủy… Tuy acid lactic ứng dụng nhiều chưa có nhiều phương nghiên cứu ứng dụng phương pháp khác vào q trình lên men nhằm làm tăng hiệu suất lên men thu nhận acid lactic Trên sở vấn đề đặt ra, việc áp dụng phương pháp cố định tế bào sản xuất lên men acid lactic hướng nghiên cứu việc tìm kiếm phương pháp lên men nhằm làm tăng hiệu suất lên men acid lactic 1.2 Mục tiêu đề tài Với mục tiêu đề tài sử dụng chế phẩm Lactobacillus delbrueckii cố định để lên men liên tục thu nhận acid lactic Đề tài tiến hành với thí nhiệm sau: _Khảo sát q trình ảnh hưởng đến lên men acid lactic ( lên men theo mẻ): Độ Brix, pH, thời gian lên men _ Xác định tốc độ pha lỗng tối ưu hệ thống lên men liên tục _Kiểm tra tính ổn định hệ thống lên men liên tục SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu lên men acid lactic 2.1.1 Đặc điểm acid lactic Acid lactic chất hữu khơng màu, mùi nhẹ, tan nước cồn Cơng thức hóa học acid lactic CH3CHOHCOOH Khối lượng phân tử acid lactic 98,08 Nhiệt độ sơi 122oC, điểm tan 17oC Acid lactic có tên gọi khác 1-hydroxyethanol cacboxylic hay acid 2hydroxypropanoic Trong cấu tạo phân tử chúng có cacbon bất đối xứng nên chúng có đồng phân quang học: D-acid lactic L-acid lactic Hai đồng phân quang học có tính chất hố lý giống nhau, khác khả làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng Do tính chất sinh học chúng hồn tồn khác Loại L-acid lactic dạng tinh thể, tan nước, cồn etylic, eter, khơng tan CHCl3 Nhiệt độ nóng chảy 28oC, góc quay cực 15oC 2,67 o Loại D-acid lactic dạng tinh thể, tan nước, cồn Nhiệt độ nóng chảy 28 oC, nhiệt độ sơi 103 oC, góc quay cực 15 oC -2,26 o Nếu D-acid lactic L-acid lactic có hỗn hợp theo tỷ lệ 50/50 người ta gọi hỗn hợp Raxemic Hỗn hợp ký hiệu D1 acid lactic Trong q trình lên men khơng có hỗn hợp có tỷ lệ lý tưởng mà có hỗn hợp tiến hành tổng hợp hữu DL-acid lactic dịch lỏng dạng siro, có khả tan nước, cồn, khơng tan CHCl3 Nhiệt độ nóng chảy chúng 16,7 oC, nhiệt độ sơi 122 oC [6] 2.1.2 Lên men lactic Lên men lactic q trình chuyển hố đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình vi khuẩn lactic Lên men lactic loại hình lên men phát triển thiên nhiên Lên men lactic q trình trao đổi lượng Các phân tử ATP hình thành q trình chuyển hố chất (lactose) vi khuẩn giữ lại tế bào để phục vụ cho q trình trao đổi sinh trưởng vi sinh vật Ngược lại sản phẩm acid lactic, ethanol, CO2 vi khuẩn thải vào mơi trường lên SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương men Kết hàm lượng acid lactic tích lũy mơi trường lên men ngày tăng, làm giảm pH mơi trường kéo theo biến đổi lý hố khác Trong q trình lên men lactic, ngồi sản phẩm acid lactic, acid acetic, ethanol, CO2 dịch lên men xuất trăm hợp chất hố học khác Chúng sản phẩm trung gian sản phẩm phụ q trình lên men Hàm lượng chúng dịch lên men thường thấp ( vài ppm ) Một số hợp chất nhóm dễ bay Chúng đóng vai trò quan trọng việc góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho sản phẩm lên men lactic Khi nồng độ acid lactic đạt – 3% ức chế hoạt động vi sinh vật khác, kể E.coli Chính nên lên men lactic ứng dụng để sản xuất nhiều sản phẩm khác như: sữa chua, bơ, dưa chua… Phương trình tóm tắt q trình lên men lactic: C6H12O6→2C3H6O3 + 136Kj (32,4 Kcal) Lên men lactic gồm có lên men đồng hình lên men dị hình Lên men đồng hình: Lượng acid lactic tạo thành chiếm 90%, lượng nhỏ pyruvat bị khử carbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2, acetoin Lượng sản phẩm phụ tạo phụ thuộc có mặt oxy Các chủng vi sinh vật sử dụng lên men đồng hình như: Lactobacterium casei, Lactobacterium cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium delbruckii… Phương trình tổng qt q trình lên men đồng hình: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2CH3CHOHCOOH + 2ATP Trong số trường hợp, Lên men đồng hình chuyển sang dạng dị hình điều kiện lên men thay đổi Lên men dị hình: Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngồi có sản phẩm phụ tương tác với tạo thành ester có mùi thơm Phương trình tổng qt q trình lên men dị hình: C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH Lượng sản phẩm phụ tạo thành hồn tồn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, mơi trường dinh dưỡng điều kiện ngoại cảnh Acid lactic thường chiếm 40% SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương lượng đường phân huỷ, acid suecinic 20%, rượu etylic 10%, acid acetic 10%, loại khí gần 20% [6] 2.1.3 Vi khuẩn lên men lactic 2.1.3.1 Đặc điểm chung Vi khuẩn lactic thuộc Lactobacilliaceae Acid lactic phát vào năm 1780 nhờ nhà hố học Sheele người Thụy Điển, sữa chua, acid lactic thừa nhận sản phẩm q trình lên men vào năm 1847 Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), khơng di động, khơng có khả tạo bào tử ( nhiên người ta tìm thấy số giống thuộc họ vi khuẩn lactic có khả tạo bào tử) Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, khơng chứa cytochrom enzyme catalase, có khả sinh tổng hợp enzyme peroxydase mạnh Chúng phân giải H2O2 để tạo H2O O2 để phát triển Theo khóa phân loại Bergay, họ Lactobacilliaceae chia làm họ: Streptococeae Lactobacieae Streptococeae lại chia Streptococcus Leuconostoc Lactobacileae có lồi Lactobacillus Vi khuẩn lactic có nhiều thiên nhiên Chúng tồn nhiều cỏ, cỏ khơ, thể người động vật, miệng, ruột Một số lồi họ vi khuẩn lactic Streptococcus có khả gây bệnh Nhóm vi khuẩn lactic đa dạng gồm nhiều giống khác nhau, tế bào chúng hình cầu, hình que Phân biệt chúng khả lên men đồng hình hay dị hình Khả tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sống vi khuẩn yếu.[7] Các lồi vi khuẩn lactic khác tạo thành acid lactic mơi trường sức chịu acid khác Đa số trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao ( khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn phát triển pH: 3.8 – 4, cầu khuẩn khơng thể phát triển mơi trường Hoạt lực lên men tốt vùng pH: 5.5 – 6.0 Đa số vi khuẩn lactic, đặc biệt trực khuẩn đồng hình kén chọn thành phần dinh dưỡng mơi trường phát triển mơi trường có tương đối đầy đủ acid amin hợp chất nitơ phức tạp Ngồi ta chúng nhu SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương cầu vitamin (B1, B2, B6, PP), acid pantotenic folic Bởi vậy, mơi trường ni vi khuẩn lactic có thành phần phức tạp [1] Vi khuẩn lactic chịu trạng thái khơ hạn, bền vững với CO2 cồn etylic, nhiều lồi sống mơi trường có 10 – 15% cồn cao hơn, số trực khuẩn bền với NaCl (tới – 10%) Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển nhiệt độ tương đối thấp (5 oC thấp hơn), lồi ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích 25 - 35 oC, lồi ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 45 oC Khi gia nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút Sự phát triển cần có có mặt peptone, acid amin hay muối amơn Chúng có u cầu đặc biệt chất dinh dưỡng giàu vitamin, acid amin khống chất Q trình lên men xảy tốt mơi trường acid pH từ 5.5 – 6, pH nhỏ 5.5 q trình lên men bị dừng lại Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân huỷ protein sữa thành peptid acid amin Hoạt tính lồi khác nhau, thường trực khuẩn cao Vi khuẩn lactic lên men đa số disacarit Chúng có khả lên men nhiều loại đường đơn đường đơi khơng có khả lên men loại glucid phức tạp tinh bột, có lồi L.delbrueckii đồng hố tinh bột Một số vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng pentoza acid citric Một số lồi có khả tạo thành màng nhầy Một số khác có khả đối kháng với thể hoại sinh vi sinh vật gây bệnh làm thối rửa thực phẩm Như vậy, ngồi khả tạo thành acid lactic, lồi có khả sinh hợp chất có hoạt tính kháng sinh ( người ta gọi hợp chất bacteriocin) Những chất kháng sinh khơng dùng y học mà dùng bảo quản thực phẩm có hiệu khả quan Các vi khuẩn lactic ngồi việc tạo thành acid có số lồi tạo chất thơm ( diacetyl, acetoin, acid bay ) Streptococcus diacetylactic Vi khuẩn Lactobacillus làm giảm hội chứng nhạy cảm đường ruột Các vi khuẩn có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hố hết ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hocmon chất dinh dưỡng quan trọng khác, sinh khí NH3, CO2, H2S SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương 2.1.3.2 Các chủng vi sinh vật sử dụng lên men lactic Lactobacillus Lactobacillus tên giống vi khuẩn, giống có nhiều lồi Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus kefir Trong đường ruột ln có nhiều loại vi khuẩn ký sinh, có loại có ích có hại cho sức khỏe người Sự tồn vi khuẩn lactic tạo thành cân vi khuẩn đường ruột Vi khuẩn Lactobacillus làm giảm hội chứng nhạy cảm đường ruột.[6] Các vi khuẩn có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hố hết ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hocmon chất dinh dưỡng quan trọng khác Nó sinh khí NH3, CO2, H2S Q trình biến đổi gọi chung q trình lên men, mà nhờ nó, thức ăn tiêu hố hồn tồn Trong mơi trường hoạt động đại tràng, vi khuẩn có ích có khả lấn áp, đè bẹp tiêu diệt nhiều loại vi trùng gây bệnh Lactobacillus giúp tiêu hố đường lactose sữa cách dễ dàng Loại vi khuẩn có ích đem lại hiệu cao cho người bị đau bụng tiêu chảy loạn khuẩn đường ruột hậu việc dùng q nhiều kháng sinh khiến vi khuẩn có ích bị tiêu diệt Một nghiên cứu gần cho thấy, vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng chữa bệnh chàm trẻ em Một số chủng Lactobacillus thường dùng lên men lactic như: Lactobacillus bulgaricus: Lên men đồng hình, trực khuẩn tròn, đơi dạng hạt, thường kết thành chuỗi dài, Gram (+), khơng có khả di động.Chúng có khả lên men loại đường glucose, lactose, galactose, khơng lên men sacaroza, xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin Chúng khơng có khả tạo nitrit từ nitrate Đây giống ưa nhiệt, nhiệt độ tối thích cho phát triển 40 – 45 oC, tối thiểu 15 – 20 oC SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương Hình 2.1 : Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus [10] Lactobacillus casei: Lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+), thường gặp dạng chuỗi dài ngắn, tích tụ tới 1,5% acid Chúng khơng có khả chuyển động Có khả lên men loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, salicin Trong q trình lên men chúng tạo D-acid lactic Nhiệt độ tối thích cho phát triển 38 – 40 oC, nhờ có hoạt tính proteaza nên phân hủy protein sữa thành acid amin Hình 2.2 : Vi khuẩn Lactobacillus casei [10] Lactobacillus lycopersici: lên men lactic dị hình, trực khuẩn Gram (+), sinh hơi, thiên nhiên chúng tồn thành đơi một, có khả tạo bào tử Trong q trình lên men đường, chúng tạo cồn, acid lactic, acid acetic CO2 Ngày chúng coi biến chủng Lactobacillus brevis.[6] Lactobacillus pasteurianus: trực khuẩn Gram (+), có kích thước rộng: 0.5 – 1.0µm, dài: 7.0 - 35µm Trong thiên nhiên chúng tồn riêng lẻ, khơng di động Chúng có khả lên men arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose, SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương tạo loạt sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic Nhiệt độ thích hợp từ 29 – 33 oC Lactobacillus bifidus: trực khuẩn nhỏ, thuộc loại Gram (+) Chúng khơng có khả di động, có khả lên men loại đường glucose, fructose, galactose, saccharose, inulin, dextrin Nhiệt độ phát triển tốt vi khuẩn 37 oC Lactobacillus causaciccus: Trực khuẩn Gram (+) ngắn, khơng có khả chuyển động, có khả lên men loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, mannitol Nhiệt độ phát triển tối ưu 48 – 50 oC Latobacillus brevis: lên men lactic dị hình, loại trực khuẩn Gram (+), khơng có khả di động, có kích thước rộng: 0.7 – 1.0µm, dài: 2.0 – 4.0µm, tìm thấy chủ yếu muối chua bắp cải Trong thiên nhiên chúng thường lêi kết với thành chuỗi Trong q trình phát triển chúng sử dụng lactate canxi nguồn cung cấp carbon Chúng có khả lên men loại đường arbinose, xylose, gluxose, fructose, galactose, maltose Trong lên men ngồi acid lactic (1,2%), tạo thành acid acetic, rượu etylic (2,4%), CO2, tạo hương làm cho sản phẩm có hương vị dễ chịu Nhiệt độ phát triển tối đa 30 oC, vi khuẩn có nhiều sữa, kefia, dưa chua… Hình 2.3 Vi khuẩn Latobacillus brevis [10] Lactobacillus leichmannii: trực khuẩn Gram (+) Trong tự nhiên chúng có khả tạo thành chuỗi ngắn, kích thước tế bào từ 0.6 – 2.0µm Chúng có khả lên men glucose, fructose, maltose, saccharose, trehalose khơng có khả lên men lactose, galactose, raffinose, arabinose, rhamnose, dextrin, inulin Trong q trình lên SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương men, chúng tạo L-acid lactic, khơng có khả tạo nitrit từ nitrat Nhiệt độ phát triển tối ưu 36 oC Lactobacillus helveticcus: trực khuẩn, có kích thước rộng: 0.7 – 0.9µm, dài: 2.0 – 6.0µm Trong thiên nhiên chúng tồn riêng lẻ tế bào, tạo thành chuỗi tế bào Chúng có khả lên men loại đường glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose Nhiệt độ phát triển từ 40 – 42 oC Vi khuẩn sử dụng nhiều sản xuất sữa chua phomai cứng Lactobacillus thermophilus: trực khuẩn Gram (+), kích thước tế bào 0.5 – 3.0µm, khơng có khả di động Nhiệt độ phát triển tối ưu 30 oC, chịu nhiệt độ 65 – 75 oC Vi khuẩn sử dụng nhiều sản xuất sữa chua phomai Lactobacillus plantarum: trực khuẩn Gram (+), kích thước tế bào rộng: 0.7 – 1µm, dài – 8µm Nhiệt độ phát triển tối ưu 30 oC, có khả chịu nồng độ NaCl 5,5% Vi khuẩn dùng nhiều chế biến sữa.[6] Hình 2.4 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum [9] Leuconostoc Leuconostoc gồm liên cầu khuẩn lên men lactic đồng dạng, lên men đường sinh acid lactic lượng lớn acid acetic, cồn etylic, khí CO2 Khả lồi Leuconostoc dextranicium Leuconostoc citrovorum lên men acid citric sữa với sản sinh chất có mùi thơm diacetyl khả kích thích liên cầu khuẩn lactic làm cho chúng đem dùng vào giai đoạn đầu chế biến bơ phomai Một số đặc trưng giống Leuconostoc cho vị trí quan trọng thực phẩm như: Sản sinh diacetyl, chịu đựng nồng độ muối cao làm cho SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page of 133 Header Page 10 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương Leuconostoc mesenteriodes đem dùng giai đoạn đầu lên men lactic Sự chịu đựng nồng độ đường cao đến 55 – 60% (đối với Leuconostoc mesenteriodes) làm cho vi khuẩn phát triển xiro bán lỏng kem đá… sản sinh nhiều thán khí từ đường làm hư hỏng số loại phomai, xiro Hình 2.5 Vi sinh vật thuộc nhóm Leuconostoc [9] Streptococcus Streptococcus cầu khuẩn trực khuẩn ngắn, chủ yếu lên men lactic đồng hình, kết song đơi thành chuỗi ngắn Giống ưa ấm, nhiệt độ phát triển tối thiểu 10 oC, tối đa 40 – 45 oC phát triển tốt 30 – 35 oC Trong mơi trường tích tụ 0.8 – 1% acid Một số chủng tạo thành bacteriocin Một số dạng Streptococcus thường dùng để lên men lactic như: Streptococcus lactis: liên cầu khuẩn Gram (+) Nhiệt độ phát triển từ 10 – 45 oC, chịu nồng độ NaCl 4% Khi lên men đường glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharose, trehalose, monnitol, tạo acid lactic, CO2, acid acetic, diacetyl Chúng có khả lên men raffinose, inulin, glycerol, sorbitol Chúng sử dụng rộng rãi chế biến sản phẩm sữa chua, cream – bơ chua, phomai Streptococcus lactic có khả lên men 30 oC sữa, đường glucose, mantose, lactose, galactose SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 10 of 133 10 Header Page 42 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương  Bước : Mẫu tế bào cần đo tiến hành đem pha lỗng mẫu theo dãy thập phân 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 Hút 1ml tương ứng độ pha lỗng vào đĩa ( chúng tơi tiến hành lặp lại lần độ pha lỗng) đổ mơi trường dinh dưỡng agar tương ứng vào đĩa (mơi trường khử trùng 1210C, 1at, 20 phút; để nguội khoảng 400C)  Bước 2: Đem ủ 450C, 24h Lưu ý :Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25- 300 khuẩn lạc /đĩa, đánh dấu đếm, lấy giá trị trung bình đĩa độ pha lỗng  Bước : Tính kết quả: Mi (cfu/ ml) = Ai x Di / V Ai : số khuẩn lạc trung bình / đĩa Di : độ pha lỗng V : dung tích huyền phù tế bào cho vào đĩa (ml) Mật độ tế bào trung bình MI mẫu ban đầu trung bình cộng Mi nồng độ pha lỗng khác SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 42 of 133 42 Header Page 43 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Một số khảo sát đặc điểm Lactobacillus delbrueckii Giống Lactobacillus delbrueckii chủng phòng thí nghiệm trường Đại học Bách Khoa TP.HCM cung cấp 4.1.1 Quan sát đại thể, vi thể Thực phương pháp cấy ria giống Lactobacillus delbrueckii mơi trường thạch MRS Những đĩa mơi trường ủ 37oC 48h Sau quan sát thấy khuẩn lạc Lactobacillus delbrueckii có hình tròn,kích thước nhỏ vừa, đều, bề mặt lồi, màu trắng đục Hình 4.1 Hình ảnh đại thể Lactobacillus delbrueckii Hình 4.2 Hình ảnh khuẩn lạc Lactobacillus delbrueckii SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 43 of 133 43 Header Page 44 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương Sau giống Lactobacillus delbrueckii tăng sinh mơi trường MSR lỏng, tơi tiến hành kiểm tra đặc điểm hình thái vi sinh vật phương pháp nhuộm Gram Kết Lactobacillus delbrueckii bắt màu tím qua phương pháp nhuộm Gram có lớp peptidoglycan dày, điều xác định Lactobacillus delbrueckii vi khuẩn Gram (+) Hình 4.3 Hình ảnh vi thể Lactobacillus delbrueckii 4.1.2 Kết khảo sát khả tạo thành acid lactic Sau ni cấy vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii mơi trường MRS có pH ban đầu 6.50 nhiệt độ 37 oC Sau thời gian 24h pH dịch ni cấy 3.53 Vậy Lactobacillus delbruckii có khả sinh acid mạnh Và pH < ức chế phát triển Lactobacillus delbrueckii 4.1.3 Kết khảo sát đường cong sinh trường Lactobacillus delbrueckii mơi trường MRS rỉ đường Cả hai mơi trường tỷ lệ cấy giống ban đầu 3% Mơi trường MRS vốn mơi trường đặc trưng cho vi khuẩn lactic nên Lactobacillus delbrueckii phát triển nhanh Tại thứ sinh khối vi khuẩn mơi trường MRS cao sinh khối vi khuẩn mơi trường rỉ đường Cả hai mơi trường pha lag trãi qua khoảng 6h So với mơi trường MRS mơi trường rỉ đường vi khuẩn phát triển chậm hơn, mơi trường hồn tồn khác với mơi trường nhân giống Lactobacillus delbrueckii Sau 6h vi khuẩn mơi trường chuyển sang pha log Trong mơi trường MRS vi khuẩn đạt cực đại thời điểm 14h, mơi trường rỉ đường vi khuẩn đạt cực đại thời điểm 16h Trong q trình SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 44 of 133 44 Header Page 45 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương lên men tùy theo mục đích thu sản phẩm mà người ta chọn thời gian thu hồi sinh khối thích hợp Chẳng hạn để thu acid lactic, người ta chọn cuối pha cân suốt pha cân bằngvi khuẩn tiếp tục sinh acid lactic 11 Mật độ tế bào *10 tế bào/ml 10 0 14 16 18 20 Thời gian Đồ thị 4.1 Đường cong sinh trưởng Lactobacillus delbrueckii mơi Mật độ tế bào *1011 tế bào/ml trường MRS 2 16 18 20 22 24 Thời gian Đồ thị 4.2 Đường cong sinh trường Lactobacillus delbrueckii mơi trường rỉ đường SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 45 of 133 45 Header Page 46 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương 4.1.4 Kết xác định đường chuẩn mối quan hệ OD mật độ tế bào Xây dựng đồ thị chuẩn biểu diễn mối tương quan mật độ tế bào (số tế bào/ml) độ hấp thu (OD) 20 16 14 12 11 Mật tế bào *10 tế bào/ml 18 10 0 0.1 0.2 y = 23.982x - 1.3195 R2 = 0.9956 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 OD Đồ thị 4.3 Biểu diễn mối quan hệ OD mật độ tế bào vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii mơi trường rỉ đường y: mật độ tế bào (tế bào/ml) x: OD R2: hệ số tương quan 4.2.Kết khảo sát số điều kiện lên men acid lactic lên men theo mẽ mơi trường rỉ đường 4.2.1 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chất khơ biểu kiến theo trọng lượng Khảo sát nhằm tìm nồng độ chất khơ biểu kiến định phù hợp cho q trình lên men tạo acid lactic SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 46 of 133 46 Header Page 47 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ chất khơ biểu kiến đến mật độ tế bào, pH, Hàm lượng acid lactic (%) Hàm lượng chất khơ Mật độ tế bào biểu kiến theo trọng (*1011 tế bào/ml) pH Brix Hàm lượng acid lactic (%) lượng 6% 10.02 3.6 6% 7.2 8% 10.62 3.58 8% 7.92 10% 9.22 3.67 9.6% 6.48 12% 8.67 3.76 12% 6.2 Hàm lượng acid lactic (%) 6% 8% 10% 12% Nồng độ chất khơ biểu kiến Đồ thị 4.4 Tương quan hàm lượng chất khơ biểu kiến theo trọng lượng acid lactic tạo thành Ứng với nồng độ 6% đến 12% pH tăng từ 3.58 đến 3.76, độ Brix có thay đổi nồng độ 10% sau lên men giảm xuống 9.6% Mật độ tế bào khoảng 8.67*1011 đến 10.62*1011 tế bào/ml Hàm lượng acid lactic từ 6.2 – 7.9% Ta thấy nồng độ 8%, acid sinh nhiều nên làm giảm pH mơi trường lên men, đồng thời nồng độ acid lactic sinh cao SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 47 of 133 47 Header Page 48 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương 4.2.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH mơi trường lên men q trình lên men Chọn nồng độ chất khơ biểu kiến 8% Tơi tiến hành thí nghiệm nhằm mục đích tìm mức pH thích hợp cho q trình lên men lactic Bảng 4.2 Ảnh hưởng pH lên mật độ tế bào, Hàm lượng acid lactic(%) pH ban đầu Mật độ tế bào pH sau lên men Brix (*1011 tế bào/ml) Hàm lượng acid lactic (%) 5.5 5.97 3.64 8% 6.48 6.89 3.6 8% 7.38 6.5 7.78 3.6 8% 7.3 7.49 3.9 8% 7.3 Hàm lượng acid lactic (%) 7.6 7.4 7.2 6.8 6.6 6.4 6.2 5.5 6.5 pH Đồ thị 4.5 Tương quan pH mơi trường lên men acid lactic tạo thành Ứng với pH thay đổi từ 5.5 đến mật độ tế bào vi khuẩn sau lên men thay đổi từ 5.97*1011 đến 7.78*1011 Brix 8% pH sau lên men thay đổi từ 3.6 đến 3.9, Hàm lượng acid lactic tăng từ 6.48 đến 7.38% Ta thấy pH 6, khả lên men sinh acid lactic nhiều so với pH khác SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 48 of 133 48 Header Page 49 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương 4.2.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men q trình lên men Chọn nồng độ chất khơ biểu kiến 8% pH Tơi tiến hành lên men theo dõi thời gian lên men, nhằm mục đích chọn thời gian thích hợp để thụ nhận acid lactic Bảng 4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men lên mật độ tế bào,pH, Hàm lượng acid lactic(%) Thời gian Mật độ tế bào Brix pH *1011 Hàm lượng acid lactic (%) 20h 7.20 8% 3.66 6.5 22h 7.29 8% 3.63 7.2 24h 7.46 8% 3.53 7.4 26h 7.83 8% 3.53 7.5 20h 24h Hàm lượng acid lactic (%) 7.6 7.4 7.2 6.8 6.6 6.4 6.2 18h 26h Thời gian (h) Đồ thị 4.5 Tương quan thời gian lên men hàm lượng acid lactic tạo thành Ta thấy điều kiện lên men, khoảng thời gian khác nhau, từ 20h đến 26h, hàm lượng acid lactic tăng từ 6.2 đến 7.5% pH thay đổi từ 3.66 đến 3.53, Brix 8% Dựa kết ta thu được, chọn thời gian 26h để thu nhận acid lactic SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 49 of 133 49 Header Page 50 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương Tuy nhiên cần phải khảo sát thêm thời gian lên men nhằm khảng định cách xác thời gian tối ưu cho q lên men acid lactic Tổng kết phần khảo sát điều kiện lên men acid lactic mơi trường rỉ đường Nồng độ chất khơ biểu kiến là: 8% pH thích hợp :6 Thời gian lên men thích hợp : 26h 4.3 Kết tiến hành lên men thu nhận acid lactic hệ thống lên men liên tục Lb delbrueckii cố định phức chất mang BC Hình 4.4 Mơ hình hệ thống lên men liên tục phòng thí nghiệm Bộ mơn sinh học trường Đại Học Bách Khoa tp.HCM Bảng 4.4 Lượng chế phẩm bình lên men hệ thống lên men liên tục Bình ( Chất lượng giống 2,8.108 tế bào/g chế phẩm) 2.15 2.10 2.00 2.20 2.12 Trung bình 2.114 SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 50 of 133 Lượng chế phẩm (g) 50 Header Page 51 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương 4.3.1 Xác định tốc độ pha lỗng tối ưu cho q trình lên men Nhằm mục đích tìm tốc độ pha lỗng thích hợp cho hệ thống lên men liên tục Bảng 4.5 Biến động pH q trình lên men liên tục Thời Tốc độ pha Thời gian theo dõi (sau thời gian lưu) gian lưu lỗng Ngày Ngày Ngày Ngày (giờ) (ml/h) 24 150 2.50 2.51 2.49 2.46 2.45 2.45 2.46 36 100 2.51 2.51 2.48 2.45 2.46 2.45 2.45 48 75 2.50 2.55 2.48 2.45 2.45 2.46 2.46 Ngày Ngày Ngày 2.56 150 100 75 2.54 2.52 pH 2.5 2.48 2.46 2.44 2.42 2.4 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Thời gian theo dõi (Ngày) Đồ thị 4.6 Biến động pH theo thời gian lên men liên tục cấp độ pha lỗng 150, 100, 75ml/h SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 51 of 133 51 Header Page 52 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương Bảng 4.6 Biến động acid lactic (%) q trình lên men liên tục Thời Tốc độ cấp Thời gian theo dõi (sau thời gian lưu) gian lưu mơi trường Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày (giờ) (ml/h) 24 150 6.50 6.75 6.78 6.83 6.85 6.88 6.85 36 100 7.31 7.41 7.50 7.48 7.50 7.55 7.50 48 75 7.30 7.36 7.47 7.42 7.40 7.45 7.45 Hàm lượng acid lactic (%) 7.8 7.6 7.4 7.2 6.8 150 100 6.6 75 6.4 6.2 5.8 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Thời gian theo dõi (Ngày) Đồ thị 4.7 Biến động hàm lượng acid lactic (%), theo thời gian lên men liên tục cấp độ pha lỗng 150, 100, 75ml/h Dựa vào bảng 4.5, 4.6 đồ thị 4.6, 4.7 Ta thấy Sau thời gian lưu, pH tốc độ pha lỗng giao động khoảng 2.45 – 2.55 Biến thiên khoảng 0.1.Giữa ngày có biến động lớn từ ngày thứ đến ngày thứ ổn định từ ngày thứ trở đi.pH trung bình tốc độ pha lỗng 100ml/h 2.472 thấp so với cấp độ pha lỗng 150ml/h 2.474, 75ml/h 2.478 Hàm lượng acid lactic độ pha lỗng có chênh lệch Hàm lượng acid lactic trung bình độ pha lỗng 150ml/h 6.777% thấp nhất, độ pha lỗng SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 52 of 133 52 Header Page 53 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương 150ml/ h 7.407% 100ml/h 7.464% cao Ở nồng độ pha lỗng, hàm lượng acid lactic biến động theo ngày khơng đáng kể Vì ta chọn tốc độ pha lỗng 100ml/h cho hệ thống lên men liên tục 4.3.2 Kiểm tra tính ổn định hệ thống Ta cho hệ thống hoạt động với tốc độ pha lỗng 100ml/h, sau ngày ổn định Bảng 4.7 Bảng theo dõi pH, hàm lượng acid lactic (%) hệ thống Ngày theo dõi pH 2.50 2.51 2.48 2.45 2.45 2.46 2.45 2.45 Acid lactic (%) 7.31 7.41 7.50 7.48 7.50 7.55 7.50 7.50 pH % acid lactic 2.5 1.5 pH Acid lactic (%) 0.5 0 Thời gian theo dõ5i (Ngày) Đồ thị 4.8 Biến động hàm lượng acid lactic (%),pH theo thời gian hệ thống lên men liên tục Dựa vào bảng 4.7 đồ thị 4.8 ta nhận thấy pH hệ thống lên men giao động khoảng 2.45 – 2.51, pH trung bình 2.468 Độ chênh lệch pH ngày vào khoảng 0.01 – 0.03 Như pH suốt q trình hoạt động hệ thống lên men khơng có biến động lớn SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 53 of 133 53 Header Page 54 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương Hàm lượng acid lactic thu suốt q trình lên men giao động khoảng 7.31 – 7.55%, Trung bình là: 7.468%, hàm lượng acid lactic chênh lệch ngày vào khoảng – 0.1%.Sự chênh lệch khơng đáng kể Như hệ thống lên men liên tục thu nhận acid lactic chế phẩm L.delbrueckii cố định phức chất mang BC hoạt động ổn định SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 54 of 133 54 Header Page 55 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau tiến hành thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men acid lactic, xác định tốc độ pha lỗng tối ưu, tính ổn định hệ thống lên men liên tục L.delbrueckii cố định phức chất mang BC Chúng tơi rút kết sau: _Nồng độ chất khơ biểu kiến ban đầu là: 8% _pH ban đầu thích hợp cho q trình lên men : _Thời gian lên men tối ưu : 26h _Tốc độ pha lỗng tối ưu hệ thống lên men liên tục là: 100ml/h _Nhận xét tính ổn định hệ thống: hệ thống hoạt động ổn định 5.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu ngắn, thiết bị phương tiện thí nghiệm nhiều hạn chế nên nội dung thí nghiệm chưa thể khảo sát hết yếu tố liên quan đến đề tài Dựa vào thơng số kết tìm tơi kiến nghị tiếp tục bố trí thí nghiệm nghiên cứu thêm: _Ảnh hưởng nhiệt độ q trình lên men _Tỉ lệ giống cấy vào _Tiếp tục khảo sát thời gian lên men _Tiếp tục theo dõi tính ổn định chế phẩm vi sinh vật cố định qua tỷ lệ tế bào bị rửa trơi tính ổn định hệ thống lên men liên tục SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 55 of 133 55 Header Page 56 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]Kiều Hữu Ánh, “ Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp”, NXB Khoa Học – Kỹ Thuật [2] Nguyễn Thị Hiền, Rỉ đường mía ứng dụng cơng nghiệp lên men nước ta Lương thực thực phẩm (LTTP) số 4/1979/ trang 23-26 [ 3] Nguyễn Thị Hiền,Thành phần rỉ đường mía Việt Nam ứng dụng ngành cơng nghiệp lên men Lương thực thực phẩm (LTTP) số 9/1979/ trang 30-34 [4] Nguyễn Thị Hiền,Cơng Nghệ Sản Xuất Mì Chính Và Sản Phẩm Lên Men Cổ Truyền, NXB Khoa học Kỹ thuật [5] Nguyễn Thúy Hương (2006) Tuyển chọn cải thiện chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất ứng dụng quy mơ pilot Luận án Tiến sỹ Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM [6] Nguyễn Đức Lượng cộng (1996), Vi sinh vật cơng nghiệp – tập 2, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM [7] Nguyễn Đức Lượng, “ Cơng nghệ vi sinh” tập “Vi sinh vật cơng nghiệp”, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM,2002 [8] Gokhale D cộng ( 2008), Utilization of Molasses Sugar for Lactic Acid Production by Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii Mutant Uc-3 in Batch Fermentation, Applied and environmental microbiology, Jan 2008, p 333–335 [9] www.bacferm.com.au/silac/micro/m cro.html [10] http://bioweb.usu.edu/microscopy/reseach.htm [11] http://vietsciences.free.fr/ [12] http://en.wikipedia.org/wiki/Acidophilus_milk [13] http://www.healthinajiffy.co.uk/health-plus-first-probiotic-90-vcapsules-p224.html [14] http://www.holisticprimarycare.net/app/27_104.jsp SVTH: Trần Thị Thu Giang Footer Page 56 of 133 56 ... dưa chua… Phương trình tóm tắt trình lên men lactic: C6H12O6→2C3H6O3 + 136Kj (32,4 Kcal) Lên men lactic gồm có lên men đồng hình lên men dị hình Lên men đồng hình: Lượng acid lactic tạo thành... trường lên men  Thay đổi phương pháp thu nhận acid lactic Giống môi trường lên men: Giống dùng trình lên men Lactobacillus acidophilus Lượng giống cho vào để lên men 5% so với dung dịch lên men. .. đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình vi khuẩn lactic Lên men lactic loại hình lên men phát triển thiên nhiên Lên men lactic trình trao đổi lượng Các phân tử ATP hình thành trình chuyển