Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái niệm chung hợp chất tự nhiên 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Phân loại 2.2 Khái niệm chung Thin layer chromatography (TLC) .15 2.2.1 Tổng quát TLC 15 2.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 25 2.3.1 Khái niệm 25 2.3.2 Sự tích lũy hợp chất thứ cấp tế bào thực vật 26 2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất hoạt chất sinh học 29 2.4 Giới thiệu chung Kim ngân hoa 37 2.4.1 Mô tả 37 2.4.2 Phân bố, thu hái chế biến 37 2.4.3 Thành phần hóa học 38 2.4.4 Tác dụng dược lý 39 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 41 3.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 41 3.2 Vật liệu .41 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 41 3.2.2 Trang thiết bị dụng cụ 41 3.2.3 Các loại hóa chất sử dụng 41 3.3 Phương pháp thí nghiệm 42 3.3.1 Thí nghiệm 1:cảm ứng tạo mô sẹo 42 3.3.1.1.Khử trùng mẫu 42 i Footer Page of 133 Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 3.3.1.2.Cảm ứng tạo mô sẹo 42 3.3.2 Chuẩn bị mẫu 43 3.3.3 Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid saponin triterpenoid Kim ngân phương pháp thử nghiệm sinh hóa 43 3.3.4 Thí nghiệm 3: khảo sát thành phần flavonoid saponin triterpenoid phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 44 3.3.5 Thí nghiệm 4: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Kim ngân 45 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 4.1 Thí nghiệm 1: cảm ứng mô sẹo 49 4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid sapoin triterpenoid phương pháp trắc nghiệm sinh hóa .51 4.2.1 Khảo sát diện flavonoid 51 4.2.2 Khảo sát diện triterpenoid saponin 57 4.3 Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid saponin triterpenoid phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) .59 4.3.1 Khảo sát diện flavonoid 59 4.3.2 Khảo sát diện triterpenoid 62 4.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Kim ngân 65 4.4.1 Khảo sát khả kháng khuẩn dịch chiết Kim ngân phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc 65 4.4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 67 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 5.1 Kết luận 71 5.2 Kiến nghị 72 CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 ii Footer Page of 133 Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp tạo bước tiến xa khoa học thực vật Việc phát triển sử dụng công cụ di truyền hiểu biết ngày sâu sắc chất tế bào phương thức điều hòa trình chuyển hóa trao đổi chất sở cho việc sản xuất chúng quy mô thương mại Do nhu cầu sử dụng sản phẩm tự nhiên y dược ngày tăng sản lượng chúng trồng tự nhiên lại thấp thúc đẩy phát triển không ngừng công nghệ nuôi cấy tế bào quy mô lớn Tuy nhiên, đường sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp mong muốn thực vật nuôi cấy tế bào quy mô lớn phức tạp Vì vậy, thông tin mức độ tế bào phân tử trình chuyển hóa cần thiết cho phát triển sản xuất công nghiệp Nhiều nghiên cứu thực điều kiện khác để giải thích tượng xuất trình sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy in vitro Các kết cho thấy hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm lớn cho việc khai thác thương mại chất trao đổi thứ cấp 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích Bước đầu khảo sát vài hợp chất có hoạt tính sinh học có mẫu mô sẹo, hoa, cành Kim ngân hoa thử hoạt tính chúng lên hai chủng vi khuẩn E.coli Samonella Từ tạo tiền đề cho nghiên cứu tách chiết phân lập chất có giá trị dược lý mô sẹo, hoa, cành Kim ngân làm nguyên liệu phục vụ cho nghành công nghiệp dược Footer Page of 133 Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học biết nhiều Kim ngân hoa saponin triterpenoid flavonoid hai phương pháp: trắc nghiệm sinh hóa sắc ký lớp mỏng (TLC) Thử hoạt tính dịch chiết mô sẹo, hoa hai chủng vi khuẩn E.coli Samonella Footer Page of 133 Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái niệm chung hợp chất tự nhiên 2.1.1 Khái niệm Hợp chất tự nhiên, chất biến dưỡng thứ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, tạo thể sinh vật Chất biến dưỡng thứ cấp cần thiết nhiều không cần thiết cho sống sinh vật, điều khác với hợp chất đại phân tử protein, acid nucleic, polysacchride hợp chất cần thiết sống sinh vật (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh) 2.1.2 Phân loại Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất xếp thành nhóm khác Việc phân loại hợp chất thành nhóm thường định nghĩa nhất, ranh giới nhóm thường không rõ ràng 2.1.2.1 Alkaloid Alkaloid hợp chất có tính base yếu, có mặt nguyên tử nitơ Tính base alkaloid khác tùy theo diện nhóm R (mang nhóm chức khác nhau) gắn nguyên tử nito Các alkaloid chia thành ba loại:  Alkaloid thật: hợp chất có hoạt tính sinh học, có tính base, thường sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn thực vật diện dạng muối acid hữu  Protoalkaloid xem amin có hoạt tính sinh học kể mescalin N, N–dimetyltryptamin Chúng amin đơn giản, tổng hợp từ amino acid, nguyên tử nitơ không vòng dị hoàn  Giả alkaloid hợp chất không bắt nguồn từ amino acid, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn alkaloid steroid alkaloid terpenoid Footer Page of 133 Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp 2.1.2.2 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Flavonoid  Khái niệm Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật Hơn rau thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid thành phần hay gặp dược liệu có nguồn gốc từ thực vật Cho đến có khoảng 4.000 chất xác định cấu trúc Chỉ riêng nhóm flavon flavonol với nhóm -OH / -OCH3 theo lý thuyết gặp 38.627 chất Phần lớn chất flavonoid có màu vàng (flavonoid từ flavus có nghĩa màu vàng) Tuy nhiên số có màu xanh, tím, đỏ, số khác lại màu thuộc nhóm flavonoid Trong thực vật có số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid lại có màu vàng carotenoid, anthranoid, xanthon  Cấu trúc hóa học Người ta xếp vào nhóm flavonoid chất có cấu tạo khung theo kiểu C6– C3–C6 hay nói cách khác khung gồm vòng benzen A B nối với qua mạch carbon Hình 2.1: khung flavonoid Người ta xem cấu trúc gồm hai phần (được theo dõi chất đồng vị): + C6 – C3 (tức vòng B + 3C) phần xuất phát từ acid shikimic dẫn đến dẫn chất phenylpropanoid Footer Page of 133 Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Hình 2.2: sơ đồ hình thành phenylpropanoid + C6 (vòng A) xuất phát từ đơn vị acetat dẫn đến acid triacetic Sau phần ghép lại tạo thành chalcone Hình 2.3: cấu tạo chalcone Phần lớn flavonoid xem dẫn chất có gốc phenyl nhân Đánh số thứ tự dị vòng, số từ dị tố oxy tiếp đến vòng A, vòng B đánh số phụ Trường hợp vòng C (nghĩa mạch 3C hở) ví dụ trường hợp chalcon đánh số vòng B, vòng A đánh số phụ Footer Page of 133 Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Hình 2.4: cấu tạo flavan  Phân loại flavonoid Sự phân loại flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) mức độ oxy hóa mạch 3C Người ta chia ra: Euflavonoid flavonoid có gốc aryl vị trí C – 2, isoflavonoid có gốc aryl vị trí C – 3, neoflavonoid có gốc ary vị trí C – Người ta phân biệt biflavanoid flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo monomer flavonoid, flavolignan flavonoid mà phân tử có phần cấu trúc ligan  Euflavonoid: bao gồm nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3–ol flavan 4– ol, 3,4–diol, flavanon, 3–hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron  Isoflavonoid: bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3–ene, isoflavan – –ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3– arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon, homoisoflavon Isoflavonoid thường gặp họ Đậu – Fabaceac  Neoflavonoid có giới hạn số loài thực vật, bao gồm: 4– arylchrroman, 4–arylcoumarin, dalbergion  Biflavonoid triflavonoid: flavonoid dimer trimer Những hợp chất gọi proanthocyanidin Ở biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol–chalcon, dihydro chalcon, auron, isoflavon Footer Page of 133 Header PageĐồ of án133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo  Sự phân bố flavnoid thực vật Trong thực vật bậc thấp flavonoid gặp Trong ngành rêu phát chất Trong dương xỉ số lượng flavonoid có mặt nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavnoid không nhiều đủ nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon Nét đặc trưng nghành hạt trần có khác thực vật bậc thấp ngành hạt kín chỗ diện nhiều dẫn chất biflavonoid Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín lớp mầm Có nhiều họ chứa flavonoid đủ loại flavonoid Tuy nhiên có vài nét đặc trưng cho số họ ví dụ họ Asteraceae họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có nhiều dẫn xuất thuộc nhóm khác Tuy nhiên, số chi có nét đặc trưng riêng nó, ví dụ chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia hay gặp dẫn chất chalcon auron Chi Gymnosperma, Ageratum gặp dẫn chất flavon flavonol có nhiều nhóm có oxy (có thể đến nhóm) Họ Fabaceae hay gặp chất thuộc nhóm isoflavonoid Họ Rutaceae thường gặp flavon flavonol có nhiều nhóm methoxy Họ Theaceae hay gặp flavan–3–ol Họ Ranunculaceae Paeoniaceae hay gặp dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid Họ Rosaceae chi Rubrus Prunus hay gặp anthocyanin có mạch đường phân nhánh Họ Polygonaceae chi Hydropiper hay gặp flavon flavonol sulfat Lớp mầm có 53 họ khoảng 10 họ tìm thấy có flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Oridaceae, Poaceae Hàm lượng thành phần flavonoid phụ thuộc vào nơi mọc Cây mọc vùng nhiệt đới núi cao hàm lượng cao nơi thiếu ánh sáng Footer Page of 133 Header PageĐồ 10 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Hình 2.5: sơ đồ sinh tổng hợp flavonoid  Tính chất Các dẫn chất flavon có màu vàng nhạt có màu (trường hợp nhóm OH methyl hóa), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon auron vàng đậm, đến đỏ cam Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco–anthocyanidin, flavan–3–ol nối đôi liên hiệp vòng B với nhóm carbonyl nên không màu Các dẫn chất anthocyanidin màu thay đổi tùy theo pH môi trường Tuy nhiên flavonoid phận phụ thuộc vào hỗn hợp với sắc tố khác Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid flavonoid sulfat hợp chất phân cực nên không tan tan dung môi hữu cơ, tan nước tốt cồn Các aglycon flavonoid tan dung môi hữu cơ, không tan nước Các dẫn chất flavnoid có nhóm 7–hydroxy thường đễ tan dung dịch kiềm loãng Footer Page 10 of 133 Header PageĐồ 66 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Bảng 4.10: kết thí nghiệm khảo sát hợp chất saponin triterpenoid phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Vết màu tím đen Cành tự nhiên (M2) Vết màu tím đen Mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) M1 M2 M3 Vết màu tím đen Có vết màu không rõ ràng M4 Hình 4.9 sắc ký sau sấy  M1: mẫu hoa sấy khô  M2: mẫu cành sấy khô  M3: mẫu mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4D, mg/l BA  M4: mẫu mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA 64 Footer Page 66 of 133 Header PageĐồ 67 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Nhận xét: hệ dung mô khảo sát phù hợp hệ cho vết diện khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài triển khái mỏng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) ghi nhận hợp chất thuộc nhóm saponin triterpenoid hay dẫn xuất terpen có vết màu tím sắc ký với thuốc thử đặc trưng H2SO4 10% Do từ kết bảng 4.9, bảng 4.10 kết luận sơ bộ: + Dịch chiết hoa, cành tự nhiên, dịch chiết mô sẹo môi trường MS bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, mg/l BA có diện nhóm hợp chất sapoin triterpenoid + Còn dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA diện nhóm hợp chất saponin triterpenoid 4.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Kim ngân 4.4.1 Khảo sát khả kháng khuẩn dịch chiết Kim ngân phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc T0 d0 T3 T1 d2 T2 Hình 4.10 kết ức chế E.coli sau ủ 24h, 37oC  T0 kháng sinh cefadroxil  T1 dịch chiết hoa Kim ngân 65 Footer Page 67 of 133 Header PageĐồ 68 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo  T2 dịch chiết mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, mg/l BA  T3 dịch chiết mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA Kết thí nghiệm thu nhận trình bày bảng 4.11: Bảng 4.11 kết thử nghiệm hoạt tính sơ dịch chiết E.coli Mẫu Đường kính vòng kháng (d) Kháng sinh cefadroxil (T0) 27 mm Dịch chiết hoa (T1) 19 mm Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (T2) mm Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA mm (T3) Kết luận sơ bộ: - Với nồng độ pha loãng nước sắc Kim ngân hoa 1/160 có tác dụng ứng chế phát triển E.coli (Đỗ Tất Lợi, 2004) Mặc dù chưa thể xác định nồng độ xác dịch chiết mẫu với kết thu nhận bảng 4.11 ta có có dịch chiết hoa xuất vòng kháng, với đường kính vòng kháng khuẩn 19mm nhỏ so với đường kính vòng kháng kháng sinh 40mm Bên cạnh ví trí đặt giấy thấm dịch chiết hoa phía vòng kháng khuẩn có diện E.coli mật độ thấp dạng khuẩn lạc riêng rẻ Vì dịch chiết hoa thành phần kháng khuẩn chủ yếu flavonoid không dạng tinh khiết nên khả kháng khuẩn dịch chiết yếu có khuẩn lạc phát triển nồng độ dịch chiết hoa chưa đủ để kháng hoàn toàn E.coli - Còn dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA không xuất vòng kháng có mật độ E.coli thấp 66 Footer Page 68 of 133 Header PageĐồ 69 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo không rõ ràng nồng độ sử dụng chưa thích hợp đủ để ức chế Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA hoàn toàn tính kháng khuẩn 4.4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Phương pháp có ưu điểm phương pháp khuếch tán qua giấy lọc giúp dịch chiết khuễch tán từ lòng giếng thạch lên tới bề mặt thạch, phương pháp khuếch tán qua giấy lọc giúp dịch khuếch tán bề mặt thạch 4.4.2.1 Đối với E.coli T4 T2 d0 T0 T1 d1 Hình 4.11 kết ức chế E.coli sau 24h 37oC  T0 kháng sinh cefadroxil  T1 dịch chiết hoa Kim ngân  T2 dịch chiết mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, mg/l BA  T3 dịch chiết mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA 67 Footer Page 69 of 133 Header PageĐồ 70 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Kết thí nghiệm thu nhận trình bày bảng 4.12: Bảng 4.12 kết thử nghiệm hoạt tính sơ dịch chiết E.coli Mẫu Đường kính vòng kháng (d) Kháng sinh cefadroxil (T0) 40 cm Dịch chiết hoa (T1) 19 cm Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (T2) cm Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA cm (T3) - Cũng kết thí nghiệm qua phương pháp khuếch tán qua giấy lọc dựa vào bảng kết 12 dịch chiết hoa xuất vòng kháng khuẩn có đường kính 19 mm nhỏ đường kính kháng khuẩn kháng sinh 40mm Và có tính kháng khuẩn yếu khuẩn lạc phát triển bên vòng kháng dịch chiết chưa tinh khiết nồng độ dịch chưa đủ ức chế - Trong thí nghiệm dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA không thấy rõ vòng kháng, mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA xuất vòng kháng khuẩn 68 Footer Page 70 of 133 Header PageĐồ 71 án of 133 tốt nghiệp 4.4.2.2 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Đối với Samonela d0 T3 T0 T2 T1 d1 Hình 4.12 kết ức chế Samonell sau 24h, ủ 37oC  T0 kháng sinh cefadroxil  T1 dịch chiết hoa Kim ngân  T2 dịch chiết mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, mg/l BA  T3 dịch chiết mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA Kết thí nghiệm thu nhận trình bày bảng 4.13: Bảng 4.13 kết thử nghiệm hoạt tính sơ dịch chiết Samonella Mẫu Đường kính vòng kháng (d) Kháng sinh cefadroxil (T0) 40 mm Dịch chiết hoa (T1) 24 mm Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (T2) Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (T3) 69 Footer Page 71 of 133 cm cm Header PageĐồ 72 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Với nồng độ nước sắc Kim ngân 1/320 có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn Samonella (Đỗ Tất Lợi, 2004) Mặc dù chưa xác định nồng độ xác dịch chiết mẫu qua bảng kết 4.13, dịch chiết hoa có xuất vòng kháng khuẩn với đường kính 24 mm nhỏ so với vòng kháng khuẩn kháng sinh cefadroxil 40 mm Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA chưa xuất vòng kháng rõ ràng nồng độ dịch chiết chưa phù hợp để ức chế phát triển vi khuẩn Samonella Dịch chiết mô sẹo môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA không thấy xuất vòng kháng khuẩn 70 Footer Page 72 of 133 Header PageĐồ 73 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trắc nghiệm hóa sinh, TLC ta kết luận rằng: + Mẫu hoa, cành tự nhiên, mô sẹo hình thành từ Kim ngân tự nhiên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, mg/l BA có diện hợp chất thuộc nhóm flavonoid saponin triterpenoid với mức độ khác + Còn mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA diện hợp chất nhóm flavonoid hay saponin triterpenoid chứa nhóm hợp chất khác Qua thí nghiệm khảo sát hoạt tính sơ dịch chiết hoa, hai dịch mô sẹo đối chứng kháng sinh cefadroxil ta kết luận: + Dịch chiết hoa có khả ức chế phát triển vi khuẩn E.coli Samonella Đỗ Tất Lợi (2004) ghi nhận với nồng độ nước sắc Kim ngân 1/160 có khả ức chế phát triển E.coli nồng độ nước sắc Kim ngân 1/320 có khả ức chế phát triển Samonella + Dịch chiết mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4D, mg/l BA chưa thể rõ ràng hoạt tính kháng khuẩn qua trắc nghiệm hóa sinh TLC cho kết dương tính với nhóm hoạt chất flavonoid saponin triterpenoid Có thể nồng độ dịch chiết chưa đủ để ức chế E.coli Samonella + Dịch chiết mô sẹo nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA hoàn toàn khả kháng khuẩn phù hợp với kết thí nghiệm trắc nghiệm hóa sinh, TLC cho kết âm tính với hợp chất saponin triterpenoid flavonoid hợp chất thuộc nhóm khả kháng khuẩn mạnh 71 Footer Page 73 of 133 Header PageĐồ 74 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 5.2 Kiến nghị Do điều kiện phòng thí ngiệm, thời gian có hạn nên xin đưa số kiến nghị để nghiên cứu hoàn thiện hơn: + Khảo sát thêm mô sẹo phát sinh từ Kim Ngân hai hợp chất có thêm hoạt chất không + Khảo sát thử phương pháp nuôi cấy khác nuôi cấy huyền phù, lỏng, lắc,… trình nuôi cấy bổ sung tiền chất, elicitor,…để xem khả sinh tổng hợp hợp chấp thứ cấp + Khảo sát khả kháng khuẩn xác định nồng độ cụ thể loài vi khuẩn gây bệnh khác từ dịch chiết hoa hay dịch chiết mô sẹo 72 Footer Page 74 of 133 Header PageĐồ 75 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, phần – Phát triển Nxb Quốc gia TP.HCM Diệp Quỳnh Như, Đỗ Thị Tuyến, Nguyễn Thị Như Quỳnh (2008), Tài liệu hướng dẫn thực tập môn sinh phẩm chứa hoạt chất thứ cấp, NXB Viện sinh học nhiệt đới, Hồ Chí Minh Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Xuân Thắng(2005), Tác dụng chống viêm flavonoid Kim ngân (Lonicera japonica Thunb Caprifoliaceae) kết hợp với -amylase, Tạp chí Dược học, Hà Nội Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Thị Hồng Nhiên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Viết Thân, Nguyễn Xuân Thắng (2007), Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn saponin flavonoid Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)”, Tạp chí Dược học, Hà Nội Nguyễn Kim Bích cộng (2007), Phân tích xác định đặc điểm hóa học đặc trưng dươc liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa,Viện dược liệu Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia thành phố HCM, Hồ Chí Minh Nguyễn Thái Quỳnh Quyên (2009), Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với NAA 2, 4–D lên mẫu Kim ngân, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Kỹ thuật công nghệ thành phố HCM, Hồ Chí Minh Phan Minh Giang, Nguyễn Tuấn Minh, Nguyễn Thị Minh Hằng, Phan Tống Sơn (2005), Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ câyKim ngân (Lonicera japonica Thunb Caprifoliaceae), Tuyển tập công trình hội nghị khoa học công nghệ hóa hữu toàn quốc lần thứ 10 Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (2002), Bài giảng dược liệu (I, II), NXB Y học, Hà Nội 73 Footer Page 75 of 133 Header PageĐồ 76 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 11 Quách Diễm Phương, Bùi Văn Lệ (2007), Nhân giống in vitro bắt ruồi Drosera Burmanni Vahl để thu nhận hợp chất Quinone có hoạt tính sinh học, Tạp chí phát triển KH&CN, tập 10, số 04, Hồ Chí Minh Tiếng Anh 12 Berlin J, Sasse F (1985) Selection and screening techniques for plant cell cultures Advanced Biochemistry and Engineering 31: 99-132 13 Bruneton J (1995) Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants Intercept UK, 522 14 Choi KT, Ahn IO, Park JC (1994) Production of ginseng saponin in tissue culture of ginseng (Panax ginseng C.A Mayer) Russian Journal of Plant Physiology 41: 784-788 15 Chueh FS, Chen CC, Sagare AP, and Tsay HS (2000) Quantitative determination of secoiridoid glucoside in in vitro propagated plants of Gentiana davidii var formosana by high performance liquid chromatography Planta Medica 67: 70-73 16 Cragg GM, Schepartz SA, Suffuess M, Grever MR (1993) The taxol supply crisis New NCI policies for handling the large-scale production of novel natural product anticancer and anti-HIV agents, Journal of Natural Products 56: 1657-1668 17 Dicosmo F and Tower GHN (1984) Stress and secondary metabolism in ciltured plant cells In: Recent Adv Phytochem 18 (eds) Timmerman SC and Loewus FA Plenum Press, NewYork: 97-175 18 Dicosmo F, Misawa M (1995) Plant cell and tissue culture: Alternatives for metabolite production, Biotechnology Advance 13 (3): 425-453 19 Dixon RA (1999) Plant natural products: the molecular genetic basis of biosynthetic diversity Current Opinion in Biotechnology 10: 192-197 20 Fett-Neto AG, Stewart JM, Nicholson SA, Pennington JJ, and DiCosmo F (1994) Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and and amino acid feeding to cell cultures of T cuspidata Biotechnology Bioengineering 44: 967-971 74 Footer Page 76 of 133 Header PageĐồ 77 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 21 Fischer R, Liao YC, Hoffmann K, Schillberg S, Emans N (1999) Molecular farming of recombinant antibodies in plants Biological Chemistry 380: 825839 22 Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973) Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng Chem Pharm Bull 21(1): 98-101 23 Goleniowski M, Trippi VS (1999) Effect of growth medium composition on psilostachyinolides and altamisine production Plant Cell Tissue and Organ Culture 56: 215-218 24 13 Hu ZB and Alfermann AW (1993) Diterpenoid production in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza Phytochemistry 32: 699-703 25 Issell BF, Rudolph AR, and Louie AC (1984) Etoposide (VP-16-213): An overview In BF Issell, FM Muggia, and SK Carter (eds.), Etoposide (VP-16213)-Current status and new developments Academic Press Inc, Orlando 26 Kadkade PG (1981) Formation of podophyllotoxin by Podophyllum peltatum tissue cultures Naturwiss 68: 481-482 27 Kadkade PG (1982) Growth and podophyllotoxin production in callus tissues of Podophyllum peltatum Plant Sci Lett 25: 107-115 28 Lee JM (2001) Biochemical Engineering Prentice Hall, Inc USA 29 Lee CY, Lin FL, Yang CT, Wang LH, Wei HL, and Tsay HS (1995) Taxol production by cell cultures of Taxus mairei Proc Symp on Development and Utilization of Resources of Medicinal Plants in Taiwan, Taiwan Agricultural Research Institute, Taiwan TARI Special Publication 48: 137-148 30 Lee CWT, Shuler ML (2000) The effect of inoculum density and conditioned medium on the production of ajmalcine and catharanthine from immobilizes Catharanthus roseus cells Biotechnology Bioengineering 67: 61-71 31 Merkli A, Christen P, and Kapetanidis I (1997) Production of diosgenin by hairy root cultures of Trigonella foenum-graecum L Plant Cell Reports 16(9): 632-636 75 Footer Page 77 of 133 Header PageĐồ 78 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 32 Misawa M (1994), “Plant tissue culture: An alternative for production of useful metabolite”, FAO Agricultural services bulletin, 108 33 Miyasaka H, Nasu M, and Yoneda K (1989) Salvia miltiorrhiza: In vitro production of cryptotanshinone and feruginol In: Biotechnology in agriculture and forestry 7, Medicinal and Aromatic Plants II ed By Bajaj YPS Springer-Verlag Berlin, Heidelberg: 417- 430 34 Moreno PRH, Heijden R, Verpoorte R (1993) Effect of terpenoid precusor feeding and elicitation on formation of indole alkaloids in cell suspension cultures of Catharanthus roseus Plant Cell Reports, 12: 702-705 35 Mulbagal V, Tsay HS (2004) Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites International Journal of Applied Science and Engineering 2(1): 29-48 36 Rao SR (2000) Biotechnological production of phyto-pharmaceuticals Journal of Biochemistry Molecular Biology Biophysics 4: 73-102 37 26 Shimomura K, Kitazawa T, Okamura N, and Yagi A (1991) Tanshinone production in adventitious roots and regenerates of Salvia miltiorrhiza Journal of Natural Products 54: 1583 38 Skrzypczak L, Wesolowska M, and Skrzypczak E (1993) Gentiana species XII: In vitro culture, regeneration, and production of secoirridoid glucosides In Y.P.S Bajaj (ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol 21, Medicinal and Aromatic Plants IV Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 172186 39 Slichenmyer WJ, Von Horf DD (1991) Taxol: a new and effective anticancer drug Anti-Cancer Drugs 2: 519-530 40 Smollny T, Wichers H, De Rijk T, Van Zwam A, Shasavari A, and Alfermann AW (1992) Formation of lignans in suspension cultures of Linum album Planta Med Suppl 58: A622 41 Song Jin Lee and et (năm), Loniceroside C , an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica Thunb., SK Chemicals Ltd., Suwon, Korea 76 Footer Page 78 of 133 Header PageĐồ 79 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 42 Srinivasan V, Pestchanker L, Hirasuma MT, Taticek RA, and Shuler ML (1995) Taxol production in bioreactors; kinetics of biomass accumulation, nutrient uptake, and taxol production by cell suspensions of Taxus baccata Biotechnol Bioeng 47: 666-676 43 Silvestrini A, Pasqua S, Botta B, Monacelli B, Heijden R, Verpoorte R (2002) Effect of alkaloid precusor feeding on a Camptotheca acuminata cell line Plant Physiology and Biochemistry 40: 749-753 44 Tabata M, Yamamoto H, and Hiraoka N (1972) Les Cultures de Tissus de Plantes Colloques internationaux de CNRS No 193 45 Tsay HS, Chang WD, Chen CC, and Chang YS (1994) The production of imperatorin from Angelica dahurica var formosana by cell suspesion culture J Agric Assoc China 168: 32-48 46 Tsay HS (1999) Tissue culture technology of medicinal herbs and its application of medicinal herbs and its application in Taiwan In: CH Chou, GR Waller, and C Reinhardt (eds.), Biodiversity and Allelopathy: from Organisms to Ecosystems in the Pacific Academia Sinica, Taipei, Taiwan 137-144 47 Verpoorte R (1998) Exploration of nature’s chemodiversity: the role of secondary metabolites as leads in drug development Drug Discovery Today 3: 232-238 48 Yamada Y, and Sato F (1981) Production of berberine in cultured cells of Coptis japonica Phytochemistry 20: 545-547 49 Yamamoto Y, Mizuguchi R, Yamada Y (1982) Selection of a high and stable pigment-producing strain in cultured Euphorbia millii cells Theoretical and Applied Genetics 61: 113-116 50 Yeh FT, Huang WW, Cheng CC, Na C, and Tsay HS (1994) Tissue culture of Dioscorea doryophora Hance II Estabilshment of suspension culture and the measurement of diosgenin content Chinese Agronomy Journal 4: 257-268 77 Footer Page 79 of 133 Header PageĐồ 80 án of 133 tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 51 Wang HQ, Yu JT and Zhong JJ (1999) Significant improvement of taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose feeding strategy Process Biochemistry 35: 479-483 52 Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, and McPhail AT (1971) Plant antitumor agents VI The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia Journal of American Chemical Society 93: 2325-2327 53 Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus cultures: Intiation, growth optimization, characterization and taxol production Plant Cell Tissue and Organ Culture 35: 181-193 54 Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1994) Taxus cell suspension cultures: optimizing growth and production of taxol Journal of Plant Physiology 144: 183-188 55 Woerdenbag HJ, Van Uden W, Frijlink HW, Lerk CF, Pras N, and Malingre ThM (1990) Increased podophyllotoxin production in Podophyllum hexandrum cell suspension cultures after feeding coniferyl alcohol as a βcyclodextrin complex Plant Cell Rep 9: 97-100 56 Wu CT, Vanisree M, Satish MN, Chen CL, Yang TF, and Tsay HS (2003) Isolation and quantitative analysis of cryptotanshinone, an active quinoid diterpene formed in the callus of Salvia miltiorrhiza Bunge Biological and Pharmaceutical Bulletin 26(6): 845-848 57 Zheng HZ, Dong ZH, and She J (1997) Longdan In: Modern Study of Traditional Chinese Medicine 2: 1398-1408 Beijing Xue Yuan Press, Beijing, China 58 Wie-Jong Kwak, Yong-Baik Cho, Chang-Kyun Han, Hee Jae Shin, Keun Ho Ryu, Hunseung Yoo, Hae In Rhe, (năm), Extraction and purification method of active constituents form stem of lonicera japonica thunb., its usage for anti – inflammatory and analgesic drug 78 Footer Page 80 of 133 ... ký phân chia Tính chất Dung dịch Dung dịch Dung dịch Khí Mẫu có hợp chất mẫu có tính mẫu có tính mẫu có tính tính bay đem bay bay bay hợp chất có nhiều tính bay hay phân tích phù hợp Khả Đạt Trung... đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học biết nhiều Kim ngân hoa saponin triterpenoid flavonoid hai phương pháp: trắc nghiệm sinh hóa sắc ký lớp mỏng (TLC) Thử hoạt tính dịch chiết mô sẹo, ... Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích Bước đầu khảo sát vài hợp chất có hoạt tính sinh học có mẫu mô sẹo, hoa, cành Kim ngân hoa thử hoạt tính chúng lên hai chủng vi khuẩn E.coli Samonella