Header Page of 133 ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC e******e Đề tài: ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN BẰNG KỸ THUẬT RAPD-PCR Sinh viên thực hiện: Lê Thanh Vương Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hải T.p Hồ Chí Minh, tháng 10 n Footer Page of 133 Header Page of 133 I Đặt vấn đề Sán gan lớn ký sinh trùng nguy hiểm người gia súc (cừu, bò, dê động vật nhai lại khác, lợn thỏ, hải ly, chó, mèo kangaroo.Hai lồi thường ký sinh người gia súc F hepatica F gigantica thuộc giống Fasciola Hai lồi giống nhiều đặc điểm hình thái, sinh thái, sinh học nên việc định loại chúng sở phân biệt hình thái dễ nhầm lẫn Bệnh nhân phát nhiễm sán gan lớn khơng thể kết luận tác nhân gây bệnh F hepatica hay F gigantica Điều gây hậu nghiêm trọng, F gigantica chưa thích nghi hồn tồn với đời sống ký sinh người số động vật khác, nên tỉ lệ sán phát triển đến trưởng thành thấp Hơn nữa, thời gian sán phát triển đến trưởng thành dài thời kỳ gây bệnh tích nặng cho chủ Vì phương pháp chẩn đốn bệnh sán gan lớn qua tìm trứng sán khơng thích hợp Phương pháp chẩn đốn bệnh sán gan lớn sở miễn dịch thích hợp Vấn đề quan trọng hàng đầu phải xác định xác lồi gây bệnh để có chẩn đốn miễn dịch đặc hiệu tạo sở khoa học cho nghiên cứu để phòng trị sán gan lớn cho người gia súc Phương pháp RAPD-PCR dựa sở phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên (kích thước khoảng 10 nucleotide) giúp định loại sán gan dựa vào đa hình đoạn DNA nhân II Tổng quan tài liệu Giới thiệu sán gan lớn Sán gan lớn hình lá, có kích thước 30 x 10-12mm trâu bò Sán ký sinh đường mật trâu bò, nhiều trường hợp, chúng ký sinh lạc chỗ bắp, da Trong thể ký chủ người ngựa, sán tìm thấy phổi, da hay nơi khác Footer Page of 133 Header Page of 133 Hình: Sán gan lớn Footer Page of 133 Header Page of 133 Sự phát triển vòng đời sán gan lớn Sán trưởng thành đẻ trứng theo phân ngồi Trứng sán gan lớn có kích thước 140 x 80 mm Trứng xuống nước, trứng sán gan lớn nở ấu trùng lơng ký sinh ốc, phát triển thành ấu trùng đi, rời khỏi ốc bám vào thực vật thủy sinh để tạo nang trùng bơi tự nước Người trâu bò ăn phải thực vật thủy sinh uống nước lã có ấu trùng bị nhiễm sán gan lớn Hình: Sơ đồ phát triển vòng đời sán gan Ấu trùng sán gan lớn chết nhiệt độ 60-700C ăn rau sống, ăn lẩu tái, trần tái chưa đủ nhiệt độ 40-50 độ C ấu trùng sán gan sống Đặc điểm bệnh sán gan lớn Khi người bị nhiễm ấu trùng sán gan vào phận tiêu hóa, ấu trùng theo máu di hành đến gan cư trú Nhưng số trường hợp, ấu trùng theo đường máu cư trú quan khác phổi, da chúng phát triển thành sán gan Sán gan lớn hấp thu chất dinh dưỡng người qua máu Đối với người, việc chẩn đốn bệnh sán Footer Page of 133 Header Page of 133 gan lớn phương pháp tìm trứng phân khó chúng thường cư trú thùy gan Tuy nhiên, 2-10% bệnh nhân tìm thấy dấu vết sán gan qua phân Còn trâu bò sán gan cư trú ống mật Do vậy, phương pháp tìm trứng phân dễ dàng Động vật nhai lại (trâu, bò, cừu ) bị nhiễm sán gan mãn tính Khi bị nhiễm, chúng có triệu chứng sốt mà biểu chủ yếu sút cân, gầy yếu Thơng thường, động vật mắc bệnh giai đoạn di hành ấu trùng sán gan lớn thường kéo theo vi khuẩn khí dẫn đến nguy tử vong cao Do lồi động vật thường ăn cỏ ngồi đồng, uống nước ao hồ nên tỷ lệ mắc sán gan cao Theo số điều tra Viện Thú y Quốc gia qua nhiều năm phương pháp tìm trứng phân, vùng núi cao, tỷ lệ động vật ăn cỏ bị nhiễm sán gan chiếm từ 40- 90% Số liệu cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh sán gan lớn động vật ăn cỏ cao Bệnh sán gan lớn gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng làm tổn thương gan giảm suất thịt, sữa Phòng tránh bệnh sán gan lớn Đối với người, để phòng tránh bệnh sán gan lớn, cần rửa loại rau thủy sinh (rau trồng nước), ăn chín, uống sơi Đối với trâu, bò, dê hàng năm cần phải cho tẩy giun sán Cần xử lý phân của lồi động vật trước sử dụng làm phân bón lót cách mang ủ trước bón trực tiếp cho đồng ruộng rau màu nhằm hạn chế ấu trùng Fasciola gigantica phát triển bám vào rau màu Giới thiệu kỹ thuật PCR PCR (Polymerase chain reaction) phản ứng nhân trình tự DNA quan tâm test tube (Nguyễn Thái Thủy, 2004) Footer Page of 133 Header Page of 133 Phản ứng PCR thực máy ln nhiệt, lập lại khoảng 30 – 50 chu kỳ Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ hình với thành phần phản ứng sau: • Taq polymerase • dNTP • Primer • DNA mẫu • Buffer Kết phản ứng đọc qua bảng điện di nhuộm với Ethidium bromide ADN đích Biến tính (94o C) 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 Kéo dài (72o C) n Hình 5: Các giai đoạn phản ứng PCR Giới thiệu kỹ thuật điện di gel agarose Sự di chuyển phân tử mang điện điện trường gọi điện di Điện di hay điện di gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dụng sinh học phân tử kĩ thuật để phân tích phân tử DNA, RNA hay protein dựa đặc điểm vật lý chúng kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) Kĩ thuật sử dụng dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện tạo điện trường đều, gel (thường agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò thể để phân tách phân tử, chất nhuộm khác (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát vị trí phân tử gel sau điện di Footer Page of 133 Header Page of 133 DNA hay RNA thường tích điện âm Trong điện di gel, mẫu cho vào giếng gần cực âm DNA hay RNA di chuyển phía cực dương di chuyển tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử, phân tử nhỏ di chuyển nhanh Điện di gel phương pháp hữu dụng phân tích sinh hố học Hình: gel Agarose: cấu tạo mạng lưới cấu trúc ba chiều, cầu nối hydrogen thành phần Là polysaccharide tự nhiên phân lập từ tảo biển, có kích thước lỗ gel lớn thích hợp cho phân tách phân tử có kích thước lớn điện di dựa độ tích điện Dùng để phân tách protein > 500 kDa DNA có kích thước lớn 2000 bp Footer Page of 133 Header Page of 133 Hình: Một số thiết bị điện di Kỹ thuật RAPD-PCR Các kỹ thuật phân tử PCR biến thể sử dụng cho việc chẩn đốn bệnh ký sinh nhận dạng ký sinh trùng, phát triển kháng ngun đặc hiệu cho xét nghiệm huyết học nghiên cứu phản ứng miễn dịch người bệnh RAPD viết tắt Random Amplification of Polymorphic DNA Kỹ thuật RAPD dựa kỹ thuật PCR, cách sử dụng pimer ngắn khoảng 10 cặp nucleotide biết trước trình tự khuếch đại DNA ngẫu nhiên Ngun tắc: hai cá thể hồn tồn giống nhau, sau thực phản ứng RAPD-PCR điều kiện tạo số lượng đoạn DNA chiều dài đoạn tương ứng Khi có đột biến làm thêm vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sản phẩm khuếch đại khác số lượng đoạn DNA chiều dài khác đoạn cá thể Do kỹ thuật RAPD phát đột biến Kỹ thuật giúp nhận diện thị phân tử trội Quy trình thực RAPD-PCR - Ly trích DNA - Lựa chọn mồi - Tối ưu hố mồi thực phản ứng PCR - Chọn primer khuếch đại ổn định - Điện di gel agarose - So sánh kết mẫu PCR thơng thường: Footer Page of 133 Header Page of 133 Hình: Phản ứng PCR biết trình tự đoạn gene cần khuếch đại Tuy nhiên, RAPD phân tích, trình tự mục tiêu (sẽ khuếch đại) chưa biết Mồi thiết kế với trình tự tùy ý, kích thước 10 nucleotide Sau thực phản ứng PCR chạy điện di gel agarose để đọc kết có phân đoạn DNA khuếch đại diện mồi tùy ý Trong hình mơ tả phản ứng RAPD, đoạn lớn DNA sử dụng làm mẫu phản ứng PCR có chứa nhiều mồi ngẫu nhiên Hình: phản ứng RAPD-PCR Trong ví dụ này, có sản phẩm: Footer Page of 133 Header Page 10 of 133 • Một sản phẩm tạo PCR khuếch đại trình tự DNA nằm cặp mồi • B sản phẩm tạo PCR khuếch đại trình tự DNA nằm cặp mồi • Khơng có sản phẩm PCR sản phẩm cặp mồi vị trí hai mồi q xa • Khơng có sản phẩm PCR tạo mồi vị trí vị trí cặp primer khơng định hướng thích hợp Tìm khác gene sử dụng kỹ thuật RAPD Nếu mẫu DNA (gen) thu nhận từ nguồn khác nhau, có khác biệt trình tự DNA hai mẫu Giả sử có thay đổi trình tự mồi bắt cặp vị trí số 2: Trong hình này, mồi khơng thể bắt cặp vị trí số 2, khơng tạo sản phẩm, có sản phẩm B tạo Khi chạy điện di sản phẩm phản ứng RAPD trên, gel agarose, kết sau: Footer Page 10 of 133 Header Page 11 of 133 Sự khác biệt số band điện di sản phẩm RAPD cho phép phân biệt hai cá thể khác nhau, giống khác III.Vật liệu phương pháp Phân lập ký sinh trùng Sán gan lớn Fasciola hepatica thu từ gan bò cừu, rửa nhiều lần với phosphate-buffered saline (PBS) pH 7,4 sau ủ hệ đệm tương tự 37 ° C để loại bỏ hết vật chất ký chủ Sau ký sinh trùng rửa với PBS nhiều lần Chiết tách DNA Việc khai thác DNA thực theo bước mơ tả trước KAPLAN et al., MC Manus Bowles; Vargas et al Phương pháp chỉnh sửa sau: Các mẫu ký sinh trùng đồng dung dịch phân giải (8% triton 100X, 0,25 M Sucroza, 50 mm EDTA, pH 7,4) Dung dịch đồng ly tâm 10000 vòng/ phút 10 phút, 4°C DNA gen tách SDS-proteinase K, enzym phá vỡ polypeptide thành đơn vị nhỏ hơn, sau dễ dàng tách phenol chloroform DNA phục hồi hòa tan 10 mM Tris-HCl, mM EDTA pH 7,6 (Tris-EDTA đệm) RNA loại bỏ cách ủ với RNAse 37 ° C 1h, sau kết tủa lần thứ hai phenol cloroform ethanol Dịch huyền phù bảo quản -20°C Lựa chọn mồi Để tối ưu hóa điều kiện PCR, ba mồi (5'-TCG TCG CATT -3 '(OSA09), 5'-AGC AGC AGGC -3' (OSA 10) 5'-GGG TAA CGCC -3 Footer Page 11 of 133 10 Header Page 12 of 133 '(OSA 11 )) lựa chọn ngẫu nhiên để khuyếch đại DNA Fasciola hepatica có nguồn gốc bò cừu Tối ưu hóa Sự cần thiết tối ưu hóa điều kiện để việc khuếch đại thu nhận đầy đủ tái nhiều band mẫu cho DNA gen ký sinh trùng (5ng) Nồng độ DNA xác định nhờ ultraviolet absorbance spectrophotometry bước sóng 260nm Lượng xạ tia tử ngoại hấp thu dung dịch DNA tỷ lệ thuận với lượng DNA mẫu Sự hấp thu tia tử ngoại sử dụng để kiểm tra độ tinh DNA mẫu Phản ứng thực thể tích 50 μL chứa 10X dung dịch đệm (500 mM KCI, 200 mM Tris-HCl pH 8,4), 2,0 mM MgCI, 20,4 μm dNTPs (Promega, Hoa Kỳ) Mỗi ống phản ứng có đơn vị Taq polymerase DNA khuếch đại 75 chu kỳ với bước biến tính 94oC giây, mồi bắt cặp lúc 36 ° C 30 giây, bước kéo dài 720C 10 giây Điện di sản phẩm PCR Điện di gel agarose 1,4% agarose gel nhuộm màu với bromua ethidium trước quan sát chụp ảnh Nó sử dụng thị trọng lượng phân tử thang 100 pb IV.Kết Kết nghiên cứu cho thấy mồi khác cho đoạn DNA khác (Bảng I) Những doạn khác đặc trưng cho lồi F hepatica có nguồn gốc từ bò cừu Các kích thước đoạn DNA F.hepatica từ bò cừu khuếch đại mồi OSA-09 tương ứng khoảng 700 bp bp 150 (Hình 1) Footer Page 12 of 133 11 Header Page 13 of 133 Sử dụng OSA-10 mồi, có doạn DNA (150 bp) từ F hepatica cừu phát hiện, khơng có đoạn khuếch đại F hepatica bò (Hình 2) Footer Page 13 of 133 12 Header Page 14 of 133 Cuối cùng, sau khuếch đại mồi OSA-11, đoạn ADN khoảng 200 400 bp thu từ F hepatica bò khơng có band DNA F hepatica cừu phát (hình 3) V Thảo luận Việc xác định lồi gần gũi dựa đặc điểm hình thái khó khăn Điều đặc biệt trường hợp cho lồi động vật thân mềm sán ký sinh Tuy nhiên, tiến gần sinh học phân tử, đặc biệt khuếch đại vùng ADN đặc trưng thơng qua phản ứng PCR cho phép để phân biệt có lồi quan hệ gần gũi cách so sánh DNA chúng DNA prode PCR primer dựa khu vực biến động chuỗi DNA ribosome phát triển để phát định loại lồi Fasciola Kỹ thuật RAPD-PCR cho phép khuếch đại khu vực ngắn gen sinh vật mà khơng có thơng tin trình tự trước, nên thuận tiện đối tượng mà gen chưa biết rõ Kỹ thuật có tiềm lớn phân biệt giống, phân biệt cá thể lập đồ di truyền Trong nghiên cứu này, mồi ngẫu nhiên cho đoạn DNA có kích thước khác theo nguồn gốc lồi ký chủ khác Phân biệt đoạn đặc trưng cho F hepatica có nguồn gốc từ bò cừu Với primer OSA-09, đoạn dài 150 bp DNA thu từ Footer Page 14 of 133 13 Header Page 15 of 133 F hepatica cừu, đoạn DNA độ dài 700 bp xác định từ F hepatica bò Các kết tương đồng với báo cáo trước Từ kết luận RAPD-PCR kỹ thuật chứg minh mối quan hệ di truyền Fasciola hepatica có nguồn gốc cừu để xác định cụ thể lồi giun sán ký sinh VI.Tài liệu tham khảo http://www.vfej.vn http://www.vietnamnet.vn http://www.impe-qn.org.vn http://www.remedvet.com http://www.avery.rutgers.edu Footer Page 15 of 133 14 ... bệnh sán gan lớn động vật ăn cỏ cao Bệnh sán gan lớn gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng làm tổn thương gan giảm suất thịt, sữa Phòng tránh bệnh sán gan lớn Đối với người, để phòng tránh bệnh sán gan. .. pháp RAPD-PCR dựa sở phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên (kích thước khoảng 10 nucleotide) giúp định loại sán gan dựa vào đa hình đoạn DNA nhân II Tổng quan tài liệu Giới thiệu sán gan lớn Sán gan lớn. .. trùng bị nhiễm sán gan lớn Hình: Sơ đồ phát triển vòng đời sán gan Ấu trùng sán gan lớn chết nhiệt độ 60-700C ăn rau sống, ăn lẩu tái, trần tái chưa đủ nhiệt độ 40-50 độ C ấu trùng sán gan sống Đặc