Header Page of 146 Bộ y tế Viện dinh dỡng ^\[] báo cáo kết đề tài nghiên cứu khcn Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A flavus định lợng độc tố Aflatoxin kỹ thuật ELISA số thực phẩm Hà Nội Chủ nhiệm đề tài : BS Nguyễn Lan Phơng Đơn vị chủ trì : Khoa Thực phẩm & VSATTP Cơ quan chủ quản : Viện Dinh Dỡng Thời gian thực hiên : Năm 2006 6543 20/9/2007 Hà Nội 2007 Footer Page of 146 Header Page of 146 Phiếu đăng ký giao nộp kết nghiên cứu khcn 1.Tên đề tài : Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A flavus định lợng độc tố Aflatoxin kỹ thuật ELISA số thực phẩm Hà Nội Mã số đề tài: Thuộc chơng trình : Cấp đề tài: Đề tài cấp sở Cơ quan chủ trì: Labo Vi sinh Khoa Thực phẩm &VSTP Địa : 48BTăng Bạt Hổ - Hà Nội Điện thoại: 04 8211413 Cơ quan cấp trực tiếp: Viện Dinh Dỡng Quốc gia Địa chỉ: 48B Tăng Bạt Hổ - Hà Nội Điện thoại: 049717090 Bộ, địa phơng chủ quản: Bộ Y Tế Địa chỉ:138A Giảng Võ - Ba Đình - Hà Nội Điện thoại: Tổng kinh phí: 30.000.000,00đ (Ba mơi triệu đồng) Trong đó, từ ngân sách Nhà nuwớc: 30.000.000,00đ (Ba mơi triệu đồng) Thời gian thực hiện: Bắt đầu tháng 7/2006 Kết thúc tháng 12/2006 Chủ nhiệm đề tài : Nguyễn Lan Phơng Bác sỹ CK Vi sinh Địa liên hệ : Labo vi sinh Khoa Thực phẩm &VSATTP Điện thọai: 049716294 10 Danh sách cá nhân tham gia nghiên cứu Họ tên Học hàm /học vị Hà Thị Anh Đào PGS -TS, Dợc sỹ Nguyễn Lan Phơng Bác sỹ Phạm Thanh Yến Bác sỹ Bùi Thị Mai Hơng Thạc sỹ, Bác sỹ Nguyễn ánh Tuyết Cử nhân Footer Page of 146 Header Page of 146 11 Bảo mật thông tin A Phổ biến rộng rãi B Phổ biến hạn chế C Không phổ biến 12 Tóm tắt kết nghiên cứu Một nghiên cứu cắt ngang, khảo sát ô nhiễm nấm mốc A flavus định lợng độc tố aflatoxin kỹ thuật ELISA 129 mẫu (ngô, lạc, gạo mỳ) số cửa hàng bán lẻ địa bàn Hà Nội Kết cho thấy số mẫu có nấm mốc A flavus 53 chiếm tỉ lệ 41% Nhóm lạc nhiễm A flavus cao 22/ 43 mẫu chiếm tỉ lệ 51%, nhóm ngô có 16/ 43 chiếm tỉ lệ 38% nhóm gạo mỳ có 15/ 43 mẫu tỉ lệ 35% Trong 53 mẫu nhiễm nấm mốc A flavus có 22 mẫu có độc tố Aflatoxin nồng độ từ 0.23 - 420 ppb Nhóm lạc mẫu có Aflatoxin nồng độ từ 0.23 - 1.08 ppb; Nhóm ngô 16 mẫu có Aflatoxin nồng độ từ 3.5 420 ppb 10 mẫu có nồng độ vợt giới hạn cho phép; Nhóm gạo, mỳ mẫu tìm thấy Aflatoxin 13 Kiến nghị áp dụng KQNC - Các loại sản phẩm có nguy cao nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin nh loại nông sản, ngũ cốc phải bắt buộc kiểm nghiệm trớc đa vào dây truyền sản xuất, chế biến kể thực phẩm cho ngời thức ăn gia súc - Cần có biện pháp tuyên truyền giáo dục hớng dẫn nguy hại nấm mốc với sức khoẻ ngời sản xuất, chế biến, kinh doanh, ngời tiêu dùng sản phẩm từ loại hạt có dầu - Để đảm bảo chủ động đề phòng ô nhiễm độc tố vi nấm thực phẩm cần mở rộng tăng cờng hệ thống kiểm tra, giám sát phát ô nhiễm Aflatoxin trung tâm kiểm nghiệm thực phẩm Hà Nội ngày 20 tháng năm 2007 15 Cơ quan chủ trì đề tài 14 Chủ nhiệm đề tài Footer Page of 146 Header Page of 146 Bộ ytế Viện dinh dỡng ^\[] báo cáo Đề tài Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A flavus định lợng độc tố Aflatoxin kỹ thuật ELISA số thực phẩm Hà Nội Chủ nhiệm đề tài : BS Nguyễn Lan Phơng Đơn vị chủ trì : Khoa Thực phẩm & VSATTP Cơ quan chủ quản : Viện Dinh Dỡng Cán phối hợp : Ths Bùi Thị Mai Hơng Bs Phạm Thanh Yến Cn Nguyễn ánh Tuyết PGS Ts Hà Thị Anh Đào Kinh phí : 30 triệu đồng, nguồn NCKH Hà Nội 2007 Footer Page of 146 Header Page of 146 Mục lục Trang Đặt vấn đề Tổng quan tình hình nghiên cứu 10 2.1.Vai trò nấm mốc 10 2.2 Độc tố vi nấm 11 2.3 Nguy ô nhiễm thực phẩm độc tố vi nấm 13 2.4 Độc tính Aflatoxin 14 2.4.1 Nghiên cứu giới 14 2.4.2 Nghiên cứu nớc 17 Đối tợng phơng pháp nghiên cứu .20 3.1 Đối tợng nghiên cứu 20 31.1 Địa điểm nghiên cứu 20 3.1.2 Thời gian nghiên cứu 20 3.1.3 Đối tợng nghiên cứu 20 4.2 Phơng pháp nghiên cứu 20 3.2.1 Thiết kế phơng pháp nghiên cứu 20 3.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 20 3.2.3 Cách thu thập mẫu 20 3.2.4 Phơng pháp phân tích 21 3.2.4.1 Phơng pháp xác định A flavus ngũ cốc 21 3.2.4.2 Phơng pháp định lợng aflatoxin ELISA kít phát độc tố Veratox- HS 22 3.3 Đánh giá kết .24 3.4 Xử lý số liệu .24 Kết nghiên cứu 26 4.1 Kết khảo sát ô nhiễm nấm mốc A f lavus 26 4.1.1 Thực trạng nhiễm nấm mốc chung mẫu phân tích 26 4.1.2 Một số loại nấm mốc nhiễm nhóm hạt ngũ cốc 26 4.1.3 ô nhiễm mốc ngô, lạc, gạo địa bàn quận 26 4.2 Kết định lợng Aflatoxin máy ELISA 27 4.2.1 Xác định khoảng tuyến tính đờng chuẩn 27 4.2.2 Giới hạn định lợng phạm vi định lợng 28 Footer Page of 146 Header Page of 146 4.2.3 Độ thu hồi kỹ thuật 29 4.2.4 Kết định lợng Aflatoxin mẫu ELISA 29 bàn luận 32 Kết luận 34 Kiến nghị 35 khuyến nghị 35 Tài liệu tham khảo Footer Page of 146 Header Page of 146 Những chữ viết tắt CDC Centers for disease control and prevention(Trung tâm kiểm soát phòng chống bệnh dịch) FAO ASEAN Food Agriculture Organization (Tổ chức thực phẩm nông nghiệp Liên hợp quốc) Association of Southeast Asian(Hiệp hội quốc gia Đông Nam á) QĐ-BYT Quết định Bộ y tế ELISA Enzyme Linked Immuno- Sorbent - Assay HS High Sensitivity HPLC High Performance Liquid Chromatography(Sắc khí lng cao áp) TLC Thin Layer Chromatography(sắc ký lớp mỏng) TCN Tiêu chuẩn ngành TQTP Thờng qui thực phẩm VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm VSTP Vệ sinh thực phẩm VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) TTYTDP Trung tâm Y tế dự phòng ppb Microgam/kilogam Afla.(TS) Aflatoxin(tổng số) A flavus Aspergillus flavus Tp HCM Thành phố Hồ Chí Minh OD Optical Density(Mật độ quang) tsbtNm Tổng số bào tử nấm mốc ADN Acid desoxyribonucleic Afla aflatoxin Afla.b1 AflatoxinB1 Afla.M1 AflatoxinM1 Footer Page of 146 Header Page of 146 Đặt vấn Đề Khí hậu nóng ẩm, thời gian ma kéo dài bão lụt thờng xảy ra, điều kiện tốt cho nấm mốc phát triển nhanh gây ô nhiễm tới lơng thực, thực phẩm Các loại nông sản thực phẩm thờng thu hoạch thời vụ dễ gặp ma dài ngày, mối nguy lớn cho vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm Trong trình thu hoạch, bảo quản, dự trữ lơng thực thực phẩm nấm mốc xâm nhập, phát triển, gây độc vào giai đoạn Nhiều loài nấm mốc có ý nghĩa công nghiệp, đợc dùng sản xuất chất kháng sinh, vitamin, số dạng tơng Ngợc lại có nhiều chủng nấm mốc gây h hại làm độc thực phẩm, gây bệnh cho ngời, động vật thực vật Nấm mốc gây ô nhiễm khắp nơi độc tố thờng đợc phát thực phẩm bị ô nhiễm sản xuất, bảo quản kho hàm lợng nớc chúng mức cao Nấm mốc Aspergillus flavus loại a phát triển loại hạt có dầu nh ngô, lạc, đậu, cà phê, lúa mạch sinh độc tố Có nhiều loại độc tố vi nấm nhng Aflatoxin độc tố đáng sợ nấm Aspergillus flavus loài cung cấp lợng Aflatoxin chủ yếu Aflatoxin nhiễm vào nông sản, thức ăn gia súc, ngời gia súc ăn phải thức ăn nhiễm Aflatoxin, độc tố tích lũy số quan thể gây nhiễm độc gan, thận, xuất huyết đờng tiêu hoá, ung th gan Các điều tra cho thấy có tơng quan hàm lợng Aflatoxin thực phẩm số bệnh nhân ung th gan nhiều nứơc nh Thái Lan, Uganda, Kenya, malaysia, Nhật Bản, Philippin[1] Tại ấn Độ nhiều nớc Châu Phi ngời ta nhận thấy trẻ em đợc nuôi dỡng thờng đễ bị nhiễm tích luỹ Aflatoxin cao gan ăn nhiều bột lạc, ngô, đậu, hạt có dầu, thực phẩm lên men bị nhiễm nấm mốc[2] Việt nam bệnh truyền nhiễm bớc đợc đẩy lùi bệnh ăn phải loại thực phẩm có độc nói chung độc vi nấm nói riêng lại có chiều gia tăng Hiện cha có thống kê nói lên số ngời bị ngộ độc vi nấm nhng liên quan Aflatoxin với đời sống sức khoẻ cộng đồng đợc đề cập đến Các nhà khoa học khuyến cáo phải đặc biệt ý đến tới lạc, ngô, gạo sản phẩm chế biến từ chúng dễ bị ô nhiễm nấm mốc độc tố Aflatoxin Nông sản, thực phẩm không sử dụng cho tiêu dùng nội địa mà cho xuất Một số thị trờng nớc thờng xuyên giám định lô hàng loại bỏ chuyến hàng có hàm lợng độc tố vi nấm cao 2-10ppb Vì nên nhu cầu kiểm tra lợng Aflatoxin sản phẩm ngày cao Để xác định hàm lợng độc tố Aflatoxin thực phẩm cần thiết phải lựa chọn phơng pháp phù hợp điều kiện kiểm tra nhanh, xác sở, labo Khá nhiều nớc chọn phơng pháp Sắc ký lỏng cao áp (HPLC), Footer Page of 146 Header Page of 146 phơng pháp thức đợc chấp nhận toàn cầu[3] Ngoài phơng pháp Sắc ký lớp mỏng (TLC) đợc lựa chọn phòng thí nghiệm không đợc trang bị HPLC, phơng pháp thờng đợc dùng phần lớn phòng phân tích nớc phát triển[3] Hiện phơng pháp có độ phát rộng, xác, đợc a dùng Tuy nhiên quy trình phân tích Aflatoxin phơng pháp HPLC hay TLC mẫu thực phẩm phải qua nhiều công đoạn từ khâu chiết tách, làm mẫu sử dụng dung môi siêu tinh khiết nên tốn kém, nhiều thời gian Quá trình tách triết sử dụng nhiều dung môi độc nên có nguy gây ô nhiễm môi trờng độc hại cho kiểm nghiệm viên Sử dụng phơng pháp định lợng độc tố Aflatoxin máy ELISA kít phát độc tố Veratox - HS phần khắc phục đợc nhợc điểm Veratox - HS định lợng Aflatoxin thử nghiệm ELISA, cho phép thu đợc chất kết tủa xác đến phần tỷ (ppb) Phơng pháp đơn giản, dễ làm, đáp ứng đợc nhu cầu muốn kiểm tra lợng độc tố Aflatoxin thấp Vì năm gần xu hớng giảm mức giới hạn độc tố vi nấm thực phẩm số nớc giới ngày gia tăng (trứơc giới hạn AflatoxinB1 thức ăn đa số nuớc lấy mức dới 10 mcg/kg, nhng gần có tới 29 quốc gia để mức mcg/kg) Hơn kỹ thuật lại phù hợp cho nhiều Trung tâm y tế dự phòng số sở kiểm nghiệm cha có điều kiện trang bị HPLC, TLC Hà Nội nơi sản xuất loại nông sản nh ngô, lạc, gạo, mỳ mà lợng thực phẩm nguồn chuyển đến từ vùng giáp gianh Tuy nhiên tất chợ số tuyến phố thấy mặt loại nông sản thực phẩm Tình trạng ô nhiễm nấm mốc A flavus độc tố Aflatoxin ngũ cốc Hà Nội đề tài đề cập đến Vì chọn đề tài: Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A flavus định lợng độc tố Aflatoxin kỹ thuật ELISA số thực phẩm Hà Nội Mục tiêu nghiên cứu Xác định mức nhiễm nấm mốc A flavus số mẫu thực phẩm Hà Nội Định lợng độc tố Aflatoxin(tổng số) mẫu nhiễm nấm mốc A flavus kỹ thuật ELISA Footer Page of 146 Header Page 10 of 146 Tổng quan tình hình nghiên cứu 2.1.Vai trò nấm mốc Trong giới nấm có nhiều loài nấm lớn nấm nhỏ(vi nấm) Những nấm ăn đợc nguồn dinh dỡng quý hơng vị đặc trng có nấm có Chúng có nhiều ý nghĩa kinh tế nh lĩnh vực làm thức ăn Nấm mọc hoang dã nuôi trồng có hàm lợng protein, vitamin chất khoáng cao Nhng có loài sinh độc tố gây nỗi kinh hoàng cho ngời Nấm mốc thuộc vi nấm loài thực vật chất diệp lục, nên chúng sống đợc nhờ có hệ sợi bám vào chất hữu Hệ sợi nấm mốc có số ăn sâu vào chất gọi khuẩn ti dinh dỡng, số mọc bề mặt chất gọi khuẩn ti khí sinh Một số sợi khuẩn ti khí sinh phát triển thành quan sinh sản đặc biệt mang bào tử Màu sắc bào tử đặc trng cho màu nấm mốc già Nấm mốc phổ biến rộng tự nhiên, nhóm lớn, ngời ta thờng xếp vào loại vi sinh vật Chúng mọc chất dinh dỡng tạo thàng lớp lông mợt có màu sắc khác Nhiều loài nấm mốc có ý nghĩa công nghiệp, ngợc lại nhiều nấm mốc làm hỏng thực phẩm hàng công nghiệp, làm thay đổi nhiều thành phần hoá học chất thải sản phẩm trao đổi chất Sản phẩm trao đổi chất mốc chất độc (Mycotoxin) ngời nh động vật Một họ nấm mốc thờng gặp họ nấm Aspergillus, chúng có tới 200 loài Trong khoảng chục năm gần đây, ngời ta ý nhiều đến nấm mốc Aspergillus flavus mọc chất bột có chất béo nh bột lạc, bột ngô, bột đậu tơng, lúa mỳ, mạch, cà phê, ca cao, cùi dừa Mốc giống mốc Apergillus oryzae - nấm mốc có màu vàng hoa cau sử dụng nghề làm tơng, sinh loại độc tố gọi Aflatoxin Hai loại nấm mốc nơi sản xuất độc tố Aflatoxin nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus Những loại nấm hầu nh đợc tìm thấy khắp nơi giới Chúng đợc sinh từ đất trồng nhng lại a phát triển loại hạt giàu dinh dỡng, độc tố chúng đợc sản sinh trớc thu hoạch cánh đồng sau thu hoạch nơi bảo quản Trong hai trờng hợp h hại côn trùng gây ra, vận chuyển bảo quản sai quy cách, tác động môi trờng cho phép nấm mốc xâm nhập vào hạt Footer Page 10 of 146 10 Header Page 23 of 146 Nguyên lý phản ứng dựa nguyên tắc phản ứng ELISA + Conjugate Samples (C.H men) (KN) Antibody (KT) Substrate Red stop (cơ chất ) (chất dừng) - Mẫu đợc trộn với chất cộng hợp men giéng trộn màu đỏ, độc tố Aflatoxin(tổng số) tự có mẫu đảm bảo đợc gắn enzym tạo phức men - Phức hợp gắn men đợc chuyển sang giếng gắn kháng thể đặc hiệu Tại phản ứng kháng nguyên, kháng thể xảy ra, sau bớc rửa chất phản ứng có màu xanh da trời Màu xanh đậm có nghĩa độc tố Aflatoxin - Kết định lợng đợc đọc máy đọc ELISA: Mật độ quang nồng độ chuẩn hình thành đờng cong chuẩn Từ mật độ quang mẫu tính xác lợng độc tố Aflaioxin(tổng số) mẫu Thành phần kít Phần hoá chất 48 giếng nhỏ có gắn kháng thể 48 giếng trộn đợc đánh dấu màu đỏ lọ loại 1,5ml dán nhãn màu vàng từ 0, 1, 2, ppb Aflatoxin lọ loại 7ml dung dịch cộng hợp men Aflatoxin-HRP nhãn xanh da trời lọ loại 24ml dung dịch chất K-Blue nhãn xanh lọ, 32ml dung dịch dừng phản ứng nhãn đỏ Methanol Grade ACS Nớc cất nớc không bị ion hoá Phần dụng cụ Xy lanh chia độ 250 m Bình đựng dung tích 125ml Giấy lọc Whatman # 1, ống tiêm lọc, phễu lọc, ống tuýp để chứa mẫu Máy trộn tốc độ cao Waring kèm bình loại 1lít Máy nghiền Cân với trọng lợng cân từ -25gram Thiết bị đọc, kèm đọc 650nm Footer Page 23 of 146 23 Header Page 24 of 146 Pipet man 12kênh, Pipet man 100 àl đầu côn Khăn giấy giấy thấm 10 Thiết bị hẹn giờ, bút kính, chai rửa dạng bóp nhựa loại 250ml 11 Đĩa hình thuyền để đựng thuốc thử phản ứng Chuẩn bị mẫu chiết xuất Mẫu kiểm tra lấy theo kỹ thuật lấy mẫu đợc chấp nhận Mẫu đợc tán nhỏ trộn trớc tiến hành Giữ mẫu nhiệt độ từ 2- 80C phân tích Chuẩn bị lợng dung dịch Methanol 70% việc trộn phần methanol Grrade ACS với phần nớc cất Lấy mẫu đại diện, nghiền toàn mẫu 75% nguyên liệu đợc tán nhỏ lọt qua đợc lới lọc 20, cỡ khoảng bột cà phê tan Trộn 25g mẫu nghiền với 125 ml methanol 70%/ dung dịch khoảng phút thiết bị trộn tốc độ cao Lọc triết xuất cách đổ ml qua lọc Whatman # 1(hoặc ống tiêm lọc) thu phần nớc lọc làm mẫu Các bớc tiến hành Để tất thuốc thử phản ứng nhiệt độ phòng từ 18-300C trớc sử dụng Lắc chai thuốc thử trứơc dùng Cho 100 àl chất cộng hợp men vào giếng đánh dấu màu đỏ Cho100àl chất đối chứng mẫu vào giếng đánh dấu màu đỏ theo sau S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Dải1 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 Dải2 Chuyển 100 àl sang giếng đă gắn kháng thể, ủ 10 phút nhiệt độ phòng Rửa giếng (5 lần) nớc cất úp ngợc giếng xuống khăn giấy thấm hết nớc đọng Cho 100àl chất vào giếng, lắc 10-20 giây, ủ 10 phút Cho100àl dung dịch dừng phản ứng vào giếng lắc Lau phía giếng vải khô đọc máy đọc ELISA bớc sóng 650nm Sử dụng phần mềm Log/Logit Neogen để tính kết Cách tính kết Các kết phải đợc đọc vòng 20 phút sau kết thúc việc kiểm tra phản ứng giếng trộn tạo màu xanh da trời Màu xanh đậm có nghĩa độc tố Aflatoxin Mật độ quang học mẫu chứng hình thành đờng cong chuẩn Từ mật độ quang mẫu tính xác lợng độc tố Aflatoxin(tổng số) Một số đặc điểm chất lợng kỹ thuật kít Footer Page 24 of 146 24 Header Page 25 of 146 - Giới hạn phát hiện: 0.5 ppb (đợc xác định bình quân 10 mẫu không chứa độc tố Aflatoxin, cộng với độ lệch chuẩn) - Giới hạn định lợng: 1ppb điểm thấp đờng cong biểu đồ - Phạm vi định lợng: 1- ppb(với mẫu định lợng 8ppb phải pha loãng truớc kiểm tra) - Phạm vi áp dụng: Ngũ cốc, sản phẩm ngũ cốc, milo, lạc tơi, lạc chiên bơ, bột lạc, bỏng ngô, gạo loại hạt lúa mì 3.3 Đánh giá kết Đánh giá kết mẫu kiểm tra có đạt tiêu chuẩn vệ sinh hay không vào tiêu danh mục tiêu chuẩn vệ sinh lơng thực, thực phẩm theo QĐ số 867 Bộ Y tế ban hành ngày 4/4/1998[19] Giới hạn cho phép theo QĐ 867 nhóm ngũ cốc, đậu đỗ[19]: TT Số khẩn lạc cho phép Thực phẩm Chỉ tiêu trong1g hay 1ml Lạc TSBTNM-M 103 Gạo, mỳ TSBTNM-M 103 Ngô TSBTNM-M 103 Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm thực phẩm[19]: TT Tên độc tố vi nấm Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối đa cho phép mcg/kg(ppb) Aflatoxin tổng số B1 Thức ăn 10 Aflatoxin M1 Sữa Các độc tố vi nấmkhác Thức ăn 0,5 35 Khi kết vợt giới hạn cho phép theo bảng thực phẩm đợc xác định không đạt tiêu chuẩn vệ sinh (bị ô nhiễm) 3.4 Xử lý số liệu Lu giữ xử lý số liệu theo phơng pháp thống kê y sinh học thông thờng, sử dụng phần mềm EXCEL, phần mềm Microplate Manager 5.1 Footer Page 25 of 146 25 Header Page 26 of 146 Kết nghiên cứu 4.1 Kết ô nhiễm nấm mốc A flavus mẫu nghiên cứu 4.1.1 Thực trạng nhiễm nấm mốc chung mẫu phân tích Trong điều kiện khí hậu nóng ẩm nớc ta, nấm mốc dễ phát triển, xâm nhiễm vào lơng thực, thực phẩm Một loại lơng thực, thực phẩm nhiễm loại nấm mốc nhng có mẫu lại có nhiều loại nấm mốc, tổng số bào tử nấm men, nấm mốc vợt giới hạn cho phép nguy hiểm cho ngời tiêu dùng Khảo sát 129 mẫu bột, hạt ngô, lạc, gạo, mỳ địa bàn Hà Nội kết thể qua bảng1 Bảng 1: Tỉ lệ mẫu nhiễm loại nấm mốc Mẫu phân tích Mẫu không đạt (>103 CFU/1g TP) tsbtNm 129 68 53 a flavus (link) 129 45 35 A parasiticus 129 6.2 a niger 129 21 16.5 Penicillium 129 7.0 Ch tiêu Tỉ lệ % Qua bảng cho thấy 68 mẫu không đạt TSBTNM-M(53%), 45 mẫu nhiễm A.flavus (35%), có mẫu nhiễm A.parasiticus chiếm 6.2%, 21 mẫu nhiễm A niger (16,5%) mẫu có Penicillium (7.0%) 4.1.2 Kết nhiễm nấm mốc a flavus nhóm thực phẩm Ngô, gạo mỳ, lạc vừa lơng thực vừa thực phẩm, thức ăn thiếu đợc đời sống ngời dân Việt Nam Vì sản phảm cần thiét cho đời sống nên cung phải đáp ứng cầu Từ nông thôn chuyển thành phố để bán vùng nông thôn miền núi tích chữ để ăn dần năm Trong khâu từ sản xuất đến tiêu dùng tất có nguy ô nhiễm nấm mốc số loại nấm mốc độc Tình hình ô nhiễm nấm mốc a flavus nhóm nghiên cứu đợc tổng hợp bảng Bảng 2: Kết nhiễm nấm mốc a flavus loại Footer Page 26 of 146 26 Header Page 27 of 146 Số mẫu Tên mẫu a flavus Tsbtnm-m kiểm tra (>103CfU/g) Số nhiễm Tỉ lệ % Lạc 43 25 22 51 Ngô 43 23 16 38 Gạo, mỳ 43 20 15 35 Kết bảng cho thấy nhóm, mức nhiễm nấm mốc nói chung gần tơng đơng (25, 23, 20 mẫu), ta thấy nấm mốc A flavus có tần số xuất (22, 16, 15 mẫu) nhóm lạc bị nhiễm A flavus nhiều 51% so với ngô 38% gạo mỳ 35% Tuy nhiên số liệu thấp so với số liệu Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch: Cũng sản phẩm tơng tự nhng số mẫu nhiễm nấm mốc a flavus đạt tới 82%(212/261) số mẫu kiểm tra Bảng 3: Tỉ lệ nhiễm nấm mốc thực phẩm quận Quận Số kiểmtra TSBTNM-M Không đạt Tỉ lệ% A flavus A para siticus Cầu Giấy 26 11 41 Đống Đa 26 13 50 10 Ba Đình 28 16 55 11 Hoàn Kiếm 25 16 65 Hai Bà Trng 24 17 72 11 Qua bảng thấy đợc số mẫu kiểm tra quận Hà Nội: Quận Cầu Giấy số mẫu có TSBTNM-M vợt giới hạn cho phép 11/26 mẫu chiếm 41%, quận Đống Đa 13/26 chiếm 50%, quận Ba Đình 16/28 mẫu chiếm 55 %, quận Hoàn Kiếm 16/25 mẫu chiếm 65%, quận Hai Bà Trng 17/24 mẫu chiếm 72% số mẫu đợc lấy ngẫu nhiên gần tơng đơng quận, nhng tỉ lệ nhiễm mốc khác Nh kết ô nhiễm nấm mốc sản phẩm ngũ cốc xảy đâu, ven đô hay nội thành 4.2 Kết định lợng Aflatoxin(tổng số) ELISA 4.2.1 xác định khoảng tuyến tính đờng chuẩn Footer Page 27 of 146 27 Header Page 28 of 146 Việc đánh giá nồng độ Aflatoxin(tổng số) mẫu dựa chế phản ứng miễn dịch nồng độ đợc tính toán theo đờng chuẩn thiết lập nồng độ biết trớc.Từ đờng chuẩn tính xác nồng độ mẫu nồng độ Aflatoxin chuẩn : 0, 1, 2, ppb dẫn xuất theo quy trình đọc elisa với phần mềm Microplate manager 5.1, vẽ đợc đờng chuẩn với tơng quan nồng độ aflatoxin mật độ quang thể bảng 4, hình Bảng : Mật độ quang chất chuẩn Mẫu Aflatoxin (ppb) OD Chuẩn S1 0.000 1.7970 Chuẩn S2 1.000 1.5570 Chuẩn S3 2.000 1.4080 Chuẩn S4 4.000 1.0200 Chuẩn S5 8.000 0.6920 Từ nồng độ có OD tơng ứng Trên sơ đồ có điểm tơng quan từ xác định đợc khoảng tuyến tính Đờng cong chuẩn : Standardcurve S1 S2 Absorbance (OD) 1.5 S3 S4 S5 Conc (ppb) hình 1: Đờng chuẩn thể mối tơng quan mật độ quang nồng độ Aflatoxin 4.2.2 Giới hạn định lợng phạm vi định lợng: Định lợng chất phơng pháp ELISA trớc tiên phải có só nồng độ Footer Page 28 of 146 28 Header Page 29 of 146 chuẩn Dựa vào mật độ quang học chất chuẩn thiết lập đợc đờng chuẩn Cho mẫu nồng độ (0, 1, 2, 4, ppb) tiến hành theo quy trình, kết khảo sát cho thấy nồng độ từ 1- có giá trị OD nằm khoảng tuyến tính, nh nồng độ 1ppb điểm thấp đờng cong biểu đồ và 1- phạm vi định lợng 5.2.3 Kiểm tra độ thu hồi kỹ thuật Bảng 5: độ thu hồi mẫu thực ELISA Aflatoxin kết đo Hiệu xuất thu Hiệu xuất nạp(ppb) ELISA(ppb) hồi thu hồi TB S3BM 5.2 4.7 90, 4% S3BM 5.2 5.4 103,8% S3BM 5.2 5.0 96,2% Mẫu trắng Aflatoxin = 97% Từ ba mẫu trắng(âm tính) ban đầu, nạp 5,2ppb Aflatoxin cho mẫu, tiến hành kỹ thuật ELISA kết đo đợc 4,7ppb, 5,4ppb, 5,2ppb hiệu xuất thu hồi trung bình 97% Nh độ thu hồi độc tố thực thực phản ứng đạt đợc 97% 4.2.4 Kết định lợng Aflatoxin mẫu ELISA Bảng 6: Kết nồng độ Aflatoxin mẫu Tên mẫu tt Nồng độ Aflatoxin(ppb) tt Tên mẫu Nồng độ Aflatoxin (ppb) X1 - Lạc