Header Page of 126 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN BÍCH LOAN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Footer Page of 126 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN BÍCH LOAN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGHIÊM NGỌC MINH Thái Nguyên - 2013 Footer Page of 126 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu nhóm cộng nghiên cứu phòng Công nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thực từ tháng 06 năm 2012 tới tháng 06 năm 2013 Tác giả Nguyễn Bích Loan Footer Page of 126 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nghiêm Ngọc Minh trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn tạo điều kiện kinh phí, hóa chất thiết bị suốt thời gian thực luận văn phòng Tôi xin chân thành cảm ơn tới KS Nguyễn Thị Hoài Thu anh chị, cán phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu để hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh thầy cô giáo nhà trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; thầy cô Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè người bên tôi, động viên góp ý cho suốt trình học tập thực luận văn Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 Học viên Nguyễn Bích Loan Footer Page of 126 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm 1.1.1 Tình hình nhiễm độc thực phẩm chung 1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus độc tố ruột Staphylococal enterotoxin B giới Việt Nam 1.2 Một vài nét tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc điểm phân loại 1.2.3 Tính chất phân bố 11 1.2.4 Đặc điểm hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 12 1.2.5 Độc tố khả gây bệnh 12 1.3 Nội độc tố ruột Staphyloccoccal enterotoxin B 16 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc 16 1.3.2 Cơ chế gây bệnh 18 1.3.3 Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp tiềm ứng dụng 19 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 22 2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 22 2.1.2 Chủng vi khuẩn plasmid 22 Footer Page of 126 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 iv 2.1.3 Các kit 22 2.1.4 Hóa chất, máy móc thiết bị 22 2.1.5 Môi trường đệm 23 2.1.6 Phần mềm 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 23 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 24 2.2.2.1 Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli BL21(DE3) 24 2.2.2.2 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E coli BL21(DE3) 25 2.2.2.3 Phương pháp xử lý enzym hạn chế 26 2.2.2.4 Biểu protein Staphyloccoccal enterotoxin B tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 27 2.2.2.5 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 28 2.2.2.6 Phương pháp sạc cột Ni - NTA 31 2.2.2.7 Phương pháp tinh protein 32 2.2.2.8 Định lượng protein theo phương pháp Bradford 33 2.2.2.9 Phương pháp kiểm tra độc tính protein SEB đột biến 35 2.2.2.10 Phương pháp gây miễn dịch chuột 38 2.2.2.11 Phương pháp Western blot 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Nghiên cứu biểu gen mã hóa cho protein tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B 41 3.1.1 Biến nạ pET21a+ mang gen seb vào chủng E coli 41 3.1.2 Nghiên cứu biểu gen seb với điều kiện tối ưu 44 3.2 Tinh protein tái tổ hợp 46 3.3 Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford 48 Footer Page of 126 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 v 3.4 Kiểm tra độc tính protein 50 3.4.1 Đánh giá độc tính SEB tự nhiên (SEB1) SEB đột biến (SEB2) liều tiêm 1xLD50 51 3.4.2 Đánh giá độc tính SEB tự nhiên (SEB1) SEB đột biến (SEB2) liều tiêm 3xLD50 10xLD50 51 3.5.Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch chuột kháng nguyên Staphylococcal enterotoxin B 54 3.5.1.Gây đáp ứng miễn dịch chuột Balb/C 54 3.5.2.Kết kiểm tra khả gây đáp ứng miễn dịch chuột kháng nguyên 54 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Tài liệu Tiếng Việt 60 Tài liệu Tiếng Anh 61 Tài liệu internet 65 Footer Page of 126 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Footer Page of 126 µg Microgram µl Microlit APS Ammonium persulphate ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm Bp Base pair BSA Bovine serum albumin Cs Cộng dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Epp Eppendorf HRP Horseradish peroxidase IPTG Isopropyl- -D-thiogalactoside kDa Kilodalton Kb Kilobase LB Luria and Bertani Mg Miligam Ml Mililít MRSA Methicilline-resistant Staphylococcus aureus Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 vii NBB Native Binding buffer Ng Nanogram Nm Nanomet PBS Phosphate buffer saline S aureus Staphylococcus aureus SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis Footer Page of 126 SE Staphylococcal enterotoxin SEB Staphylococcal enterotoxin B TB Trung bình TBS Tris Bloting solution TTBS Tris Tween Blotting solution v/p vòng / phút Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 10 of 126 viii DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Phân loại khoa học Staphylococcus aureus 10 2.1 Công thức pha gel tách (12%) 30 2.2 Công thức pha gel cô (5%) 30 2.3 Pha Nồng độ pha dung dịch BSA 34 2.4 Kí hiệu tên eppendorf nồng độ 35 3.1 Kết đo độ hấp thụ BSA bước sóng 595 nm 50 3.2 Nồng độ protein SEB sau tinh 51 3.3 So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 SEB2 liều 1xLD50 52 So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 SEB2 liều 3.4 3xLD50 10xLD50 Số hóa trung tâm học liệu Footer Page 10 of 126 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 63 of 126 52 Bảng 3.4 So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 SEB2 liều 3xLD50 10xLD50 Nhóm Số chuột chết/tổng Số chuột số chuột chết (%) Nhóm (tiêm ActD) 0/10 Nhóm (tiêm ActD SEB2 = 3xLD50) 0/10 Nhóm (tiêm ActD SEB2 = 10xLD50) 0/10 Nhóm (tiêm ActD SEB1 = 3xLD50) 10/10 100 Kết bảng 3.4 cho thấy nâng liều tiêm tới 10xLD50 với Actinomycin D liều 0,5 µg/g dung dịch SEB2 không gây chết chuột; dung dịch SEB1 cần tiêm liều 3xLD50 với Actinomycin D liều 0,5 µg/g làm chết 100% số chuột thử nghiệm (nhóm 6) 3.4.3 Biến động số lƣợng chuột nghiên cứu nhóm ngày Hình 3.7 Theo dõi biến động số chuột theo ngày nhóm nghiên cứu Số hóa trung tâm học liệu Footer Page 63 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 64 of 126 53 Hình 3.8 Hình dõi biến động số chuột theo ngày nhóm nghiên cứu Kết hình 3.7 3.8 cho thấy nhóm 1, nhóm 2, nhóm nhóm không thấy xuất chuột chết sau tiêm chất thử nghiệm ngày theo dõi Nhóm bắt đầu xuất chuột chết từ ngày thứ ngày thứ 3, từ ngày thứ thêm chuột chết; tổng số chuột chết nhóm 6/10 60% (ứng với liều tiêm 1xLD50) Nhóm bắt đầu xuất chuột chết từ ngày thứ ngày thứ 3, tổng số chuột chết nhóm 10/10 100% Theo nghiên cứu trước cho biết, với động vật nhỏ chuột nhắt trắng phòng thí nghiệm, tiêm với lượng lớn dung dịch thử nghiệm làm phù phổi suy tạng gây chết động vật trước đánh giá độc tính, cần phải phối hợp với Actinomycin D để giảm liều giảm lượng dung dịch thử nghiệm đưa vào thể chuột Actinomycin D với liều 0,5 µg/g cân nặng không gây chết chuột thí nghiệm giúp làm tăng tính độc giảm liều chất thử nghiệm 100 lần so với dùng đơn độc chất thử nghiệm [28] Trong nghiên cứu này, sử dụng Actinomycin D kết hợp với dung dịch SEB1 SEB2 tìm liều lượng thích hợp đưa vào thể chuột để đánh giá khách quan độc tính dung dịch Số hóa trung tâm học liệu Footer Page 64 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 65 of 126 54 Từ kết cho thấy dung dịch protein tái tổ hợp SEB2 không gây chết chuột mức liều tương đương 10xLD50 dung dịch SEB1 gây chết 60% động vật thí nghiệm mức liều 1xLD50 làm chết 100 % động vật thí nghiệm mức liều 3xLD50 3.5 Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch chuột kháng nguyên Staphylococcal enterotoxin B 3.5.1 Gây đáp ứng miễn dịch chuột Balb/C Để chuẩn bị cho việc gây đáp ứng miễn dịch chuột Balb/C nhằm tạo kháng thể đa dòng phục vụ cho việc đánh giá tính kháng nguyên protein tái tổ hợp SEB, tiến hành lựa chọn 20 chuột Balb/C chủng (4 tuần tuổi) khỏe mạnh, đồng trọng lượng đặc biệt không nhiễm độc tố SEB chia làm lô thí nghiệm, lô 10 Các bước gây đáp ứng miễn dịch thực sau: Kháng nguyên SEB sau tinh qua cột Niken trộn với tá dược toàn phần FCA (Complete Freund Adjuvant) tiêm vào da chuột với lần tiêm 30 µg cho chuột tiêm nhắc lại lần vào ngày 1; 5; 10 ngày 20 Sau tuần tiến hành thu máu chuột, ly tâm loại tế bào máu, thu huyết tiến hành kiểm tra nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên kháng thể có huyết kỹ thuật Western blot 3.5.2 Kết kiểm tra khả gây đáp ứng miễn dịch chuột kháng nguyên Chúng sử dụng phương pháp Western blot để phát kháng thể mong muốn phù hợp kháng nguyên SEB nhóm chuột thí nghiệm Các kháng nguyên có khối lượng phân tử rõ ràng, phân tách SDSPAGE thấm lên màng PVDF để cố định băng vạch kháng nguyên SEB Sau vạch kháng nguyên biết phân tách dò Số hóa trung tâm học liệu Footer Page 65 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 66 of 126 55 với mẫu nghi ngờ chứa kháng thể đặc hiệu cho hay nhiều kháng nguyên Phản ứng kháng thể với vạch phát kháng thể thứ cấp liên kết enzym đặc hiệu cho tính chuyên biệt kháng thể mẫu thử nghiệm Để kiểm tra khả bắt cặp kháng nguyên SEB với kháng thể sinh chuột, tiến hành hai thí nghiệm dựa nguyên tắc chung phương pháp Western blot Thí nghiệm 1: Thử khả bắt cặp kháng nguyên SEB với kháng huyết chuột Kháng nguyên SEB kháng nguyên mong muốn tiêm vào chuột để tạo kháng thể phù hợp chống lại kháng nguyên Sau tuần gây miễn dịch, lấy máu chuột tiến hành ly tâm thu kháng huyết thanh, sau cho thử khả bắt cặp với kháng nguyên SEB kháng nguyên Salmonella Lý chọn kháng nguyên Salmonella cho phản ứng với kháng huyết kháng SEB vì: + Thứ Salmonella loại vi khuẩn đứng hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm toàn giới Việt Nam + Thứ hai kháng nguyên Salmonella chuẩn sẵn có nên tạo điều kiện thuận lợi cho việc tiến hành thí nghiệm Vì kháng nguyên Salmonella lựa chọn làm mẫu so sánh để đánh giá tính đặc hiệu kháng nguyên SEB Kết thí nghiệm hình 3.9 Số hóa trung tâm học liệu Footer Page 66 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 67 of 126 56 28 kDa 35 kDa 25 kDa 15 kDa Hình 3.9 Phản ứng Western blot protein tái tổ hợp SEB với kháng huyết chuột M: Maker 1: Kháng nguyên SEB 2: Kháng nguyên Salmonella Kết hình 3.9 cho thấy kháng huyết chuột gây miễn dịch với kháng nguyên SEB cho bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên SEB (giếng 1) mà không bắt cặp với kháng nguyên Salmonella (giếng 2) Thí nghiệm 2: Từ kết trên, tiếp tục tiến hành thí nghiệm dựa nguyên lý phản ứng Western blot nhằm tìm nồng độ kháng nguyên phù hợp cho phản ứng nhận biết kháng nguyên SEB kháng huyết chuột theo tiêu chí tối ưu tối thiểu để vừa nhận biết kháng nguyên vừa tiết kiệm nguyên liệu Chuẩn bị thí nghiệm: Marker màu Fermentas Kháng thể pha loãng khoảng 300 lần Số hóa trung tâm học liệu Footer Page 67 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 68 of 126 57 Kháng nguyên SEB tái tổ hợp pha loãng nồng độ: 240 ng/giếng; 480 ng/giếng; 1200 ng/giếng; 2400 ng/giếng Kết thí nghiệm thể hình 3.10 Hình 3.10 Phản ứng Western bot nồng độ kháng nguyên SEB khác với tỉ lệ kháng thể pha loãng 1/300 lần M: Marker màu Fermentas 1: 240 ng/giếng 2: 480 ng/giếng 3: 1200 ng/giếng 4: 2400 ng/giếng Từ kết thí nghiệm ta nhận thấy, kháng huyết chuột gây miễn dịch kháng nguyên SEB cho khả nhận biết kháng nguyên nồng độ tối thiểu 240 ng/giếng với độ pha loãng kháng huyết 300 lần Như vậy, với kết thí nghiệm sử dụng kháng nguyên SEB tinh để tạo kháng thể đơn dòng phục vụ cho việc chế tạo que thử nhanh giai đoạn sau Số hóa trung tâm học liệu Footer Page 68 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 69 of 126 58 KẾT LUẬN Gen seb đột biến biểu thành công tế bào E coli BL21(DE3 Đã tinh định lượng protein tái tổ hợp SEB với nồng độ TB 1,278 (mg/ml) Độc tố protein SEB dạng đột biến không gây chết chuột mức liều tương đương 25 µg/g dung dịch SEB tự nhiên gây chết 60% động vật thí nghiệm mức liều 2,5 µg/g làm chết 100% động vật thí nghiệm mức liều 7,5 µg/g Gây đáp ứng miễn dịch thành công chuột Với kháng huyết chuột gây miễn dịch kháng nguyên SEB cho khả nhận biết kháng nguyên nồng độ tối thiểu 240 ng độ pha loãng kháng huyết 300 lần Footer Page 69 of 126 Header Page 70 of 126 59 KIẾN NGHỊ Trên sở kết tinh đánh giá tính kháng nguyên protein tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) tiếp tục nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng chuẩn bị cho việc tạo kít phát nhanh ngộ độc thực phẩm độc tố ruột nhóm B vi khuẩn S aureus gây Footer Page 70 of 126 Header Page 71 of 126 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Phan Thị An cs, Khảo sát tình hình nhiễm vi khuẩn số loại thức ăn đường phố thành phố Đà Lạt Cục An toàn vệ sinh thực phẩm www.vfa.gov.vn,.2005 Lê Huy Chính (2003), Vi sinh y học Nxb Y học, Hà Nội Phan Văn Hải cs (2005) "Đánh giá tình hình vệ sinh an toàn thức ăn đường phố Thị xã Kon Tum." Cục An toàn vệ sinh thực phẩm www.vfa.gov.vn Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình ô nhiễm vi khuẩn nhận thức vệ sinh an toàn thực phẩm người kinh doanh thức ăn đường phố Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc Việt Nam năm 2008, dự báo giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, http://vfa.gov.vn/news.asp?ID=21322 Nguyễn Lý Hương, Nguyễn Thị Phấn Bùi Thị Kim Dung (2005), Khảo sát tình hình ô nhiễm vi sinh vật số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán chợ tp.Hồ Chí Minh năm 2002-2004, Trung tâm y tế dự phòng tp.Hồ Chí Minh, Thông tin khoa học, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, 2005 Nghiêm Ngọc Minh, Hầu Thị Thu Trang, Nguyễn Thị Hoài Thu (2011), Biểu tinh protein nội độc tố Staphylococcal enterotoxin B (SEB) chủng Staphylococcus aureus phân lập từ vụ ngộ độc thực phẩm, Tạp chí khoa học công nghệ 86 (10): p 179-183 Footer Page 71 of 126 Header Page 72 of 126 61 Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương Bùi Kiều Nương (2003), Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố thành phố Hồ Chí Minh năm 2002, Viện Vệ Sinh Y tế Công Cộng Tp HCM, Thông tin khoa học, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, (2003) Đông Phương (2008) "Đề phòng ngộ độc thực phẩm tụ cầu vàng "http://news.restaurants.com.vn/?page=tintuc&code=home&id=587 10 .Trần Thị Thành (2005), Tình hình ngộ độc thực phẩm Tiền Giang năm 2000-2004 Cục An toàn vệ sinh thực phẩm 11 Trần Văn Thọ cs, 2004 Đánh giá thực trạng đề xuất số giải pháp quản lý chủ yếu bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm Hải Phòng Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Tài liệu Tiếng Anh 12 Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K (2008), Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands, J Bacteriol, 190(1), 300-310 13 Bradford, 1976, Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,Anal Biochem,72 : 248–254 14 Bruce A G., Kermit D H (2009), CBRNE - Staphylococcal enterotoxin B,http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview 15 CAST (1994), CAST Report: Foodborne Pathogens: Risks and Consequences, Task Force Report No 122, Washington, DC: Council for Agricultural Science and Technology.Wieneke A A., Roberts D., Gilbert Footer Page 72 of 126 Header Page 73 of 126 62 R J (1993),Staphylococcalfood poisoning in the United Kingdom, 196990, Epidemiol Infect,110:519-531 16 Chen J Y., Qiao Y., Komisar J L., Baze W B., Hsu I C., Tseng J (1994), Increased susceptibility to staphylococcal enterotoxin B intoxication in mice primed with actinomycin D, Infect Immun, 62 (10), 4626-4631 17 Christopher L J., Saleem A K.(1986), Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus,Journal of bacteriology, 166(1),29-33 18 Gill S R., Fouts D E., Archer G L., Mongodin E F., Deboy R T., Ravel J., Paulsen I T., Kolonay, J F., Brinkac L., Beanan M., Dodson R J., Daugherty S C., Madupu R., Angiuoli S V., Durkin A S., Haft D H., Vamathevan J., Khour I H., Utterback T., Lee C., Dimitrov G., Jiang L., Qin H., Weidman J., Tran K., Kang K., Hance I R., Nelson K E., Fraser C M (2005), Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain, J Bacteriol, 187, 2426-2438 19 Haeghebaert S., Le Q F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V.(2002), Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000,Bull Epidémiol Hebdo, 23, 105-109 20 Herron O L., Fitzgerald J R., Musser J M., Kapur V (2007), Molecular correlates of host specialization in Staphylococcus aureus, PLoS ONE, 2(10), E1120; Holden M T.,Feil E J., Lindsay J A., Peacock S J., Day N P., Enright M C., Foster T J., Moore C E., Hurst L., Atkin R.,Barron A., Bason N., Bentley S D., Chilling W C., Chilling W.T., Churcher C., Clark L., Corton C., Cronin A.,Doggett J., Dowd L., Feltwell T., Hance Footer Page 73 of 126 Header Page 74 of 126 63 Z., Harris B., Hauser H.,Holroyd S., Jagels K., James K D., Lennard N., Line A., Mayes R.,Moule S., Mungall K., Ormond D., Quail M A., Rabbinowitsch E., Rutherford K., Sanders M., Sharp S., Simmonds M., Stevens K.,Whitehead S., Barrell B G., Spratt B G., Parkhill J (2004), Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance, Proc Natl Acad Sci USA, 101(26), 9786-9791 21 Huang L Y., Bergdoll M S (1970), The primer structure of staphylococcal enterotoxin B, J Biol Chem, 245, 3518-3525 22 Korolev S., Pinelis D., Savransky V., Komisar J., Vogel P., Fegeding K (2003), Toxicity of the staphylococcal enterotoxin B mutants with histidine-to-tyrosine substitutions, Toxicology,187(2/3), 229–238 23 Lee J S., Dyas B K., Nystrom S S., Lind C M., Smith J F., Ulrich R G (2002), Immune protection against staphylococcal enterotoxin-induced toxic shock by vaccination with Venezuelan equine encephalitis virus replicon, J Infect Dis, 185, 1192-1196 24 Lowell G H., Colleton C., Frost D., Kaminski R W., Hughes M., Hatch J., Hooper C., Estep J., Pitt L., Topper M., Hunt R E., Baker W., Baze W B (1996), Immunogennicity and efficacy agains lethal aerosol staphylococcal enterotoxin B challenge in monkeys by intramuscular and respiratory delivery of proteosome – toxoid vaccines, Infect Immun, 64(11), 4686-4693 25 Mary K, Sandel, John L, McKillip 2002 Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches Food control 15:5-10 26 Nema V., Agrawal R., Kamboj D V., Goel A K., Singh L (2007), Isolation Footer Page 74 of 126 and characterization of heat resistant enterotoxigenic Header Page 75 of 126 64 Staphylococcus aureus from a food poisoning outbreak in Indian subcontinent, Int J Food Microbiol, 117(1), 29-35 27 Ono H K., Omoe K., Imanishi K., Iwakabe Y., Hu D L., Kato H (2008), Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T, Infect Immun, 76(11), 4999-5005 28 Rose W C., Bradley S G (1971), Enhanced toxicity for mice of combinations of antibiotics with Escherichia coli cells or Salmonella typhosa endotoxin, Infect Immun, 4(5), 550-555 29 Sambrook J and R DW., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3nd ed Cold Spring Harbor Press: New York, 2001 30 SavranskyV., Pinelis D., Korolev S., Ionin B., Fegeding K (2004), Immunogenicity of the histidine-to-tyrosine staphylococcal enterotoxin B mutant protein in C3H/HeJ mice, Toxicon, 43, 433–438 31 Schlech WF, Lavigne PM, Bortolussi RA, Allen AC, Haldane EV, Wort AJ, Hightower AW, Johnson SE, King SH, Nicholls ES and others 1983 Epidemic listeriosis evidence for transmission by food 32 Stelma G N., Bergdoll M S (1982), Inactivation of staphylococcal enterotoxin A by chemical modification, Biochem Biophys Res Commun, 105(1), 121-126 33 Steven R G., Derrick E F., Gordon L A (2005), Insights on Evolution of Virulence and Resistance from the Complete Genome Analysis of an Early Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strain and a BiofilmProducing Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis Strain,J Bacteriol, 187(7), 2426–2438 PMCID: PMC1065214 34 Swaminathan S., Furey W., Pletcher J., Sax M (1992), Crystal structure of staphyloccocal enterotoxin B, a superantige, Nature, 359, 801 – 806 Footer Page 75 of 126 Header Page 76 of 126 65 35 Thibodeau J., Cloutier I., Lavoie P M., Labrecque N., Mourad W., Jardetzky T., Sekaly R P (1994), Subsets of HLA-DR1 molecules defined by SEB and TSST-1 binding, Sciences, 266(5192), 1874-1878 36 Towbin H., Stachelin T.,and Gondon J ( 1979), Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications PNAS 76: 4350-4354 37 Wallace D J., Van G T., Shallow S., Fiorentino T., Segler S D., Smith K E., Shiferaw B., Etzel R., Garthright W E., Angulo F J and the Food Net Working Group (2000), Incidence of Foodborne Illnesses Reported by the Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet)-1997, J Food Prot, 63, 807-809 38 Wieneke A A., Roberts D., Gilbert R J (1993),Staphylococcalfood poisoning in the United Kingdom, 1969-90, Epidemiol Infect,110:519-531 39 Woody M A., Krakauer T., Stiles B G (1997), Staphylococcal enterotoxin B mutants (N23K and F44S): biological effects and vaccine potential in a mouse model, Vaccine, 15, 133-139 40 Yarwood J M., McCormick J K., Paustian M L., Orwin P M., Kapur V., Schlievert P M (2002), Characterization and expression analysis of Staphylococcus aureus pathogenicity island Implications for the evolution of staphylococcal pathogenicity islands, J Biol Chem, 277(15), 13138-13147 41 Yves L L., Florence B., Michel G (2003), Staphylococcus aureus and food poisoning, Genet Mol Res, 2(1), 63-76 Tài liệu internet 42 http://nld.com.vn/2013032612423555p0c1050/sot-trung-ga-va-cha-bokhien-27-nguoi-ngo-doc.htm 43 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/dai-cuong-an-toan-thuc-pham.271194.html Footer Page 76 of 126 Header Page 77 of 126 66 44 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/staph.html 45 http://vfa.gov.vn/content/article/tinh-hinh-ngo-doc-thuc-pham-trong-thoigian-vua-qua-196.vfa 46 http://vi.wikipedia.org/wiki/Cơ_chế_độc_lực_của_vi_khuẩn 47 http://www.csgid.org/csgid/img/pdb_images/3r2t.png 48 http://www.uniprot.org/uniprot/P01552 49 http:www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/suc-khoe/11949_khuan-tu-caumoi-co-the-gay-tu-vong-trong-72-gio.aspx 50 www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/suckhoe/18180_MRSA-nguy-hiemhon-HIV.aspx 51 www.pc.maricopa.edu Footer Page 77 of 126 ... THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN B CH LOAN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB TRONG THỰC PHẨM... tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ chế tạo kít phát nhanh độc tố SEB thực phẩm môi trường Mục tiêu nghiên cứu: Tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) đặc... việc biểu tinh kháng nguyên SEB tái tổ hợp độc tính, có khả gây phản ứng miễn dịch tạo kháng thể IgG đặc hiệu cấp thiết Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: Biểu hiện, tinh kháng nguyên tái tổ