Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ XẠ KHUẨN Streptomyces, ĐỂ PHÒNG CHỐNG BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT (Capsicum frutescens) TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG Mã số: Đ 2013-03-39 Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Thị Mai Đà Nẵng, Tháng 12/ 2013 Footer Page of 126 Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ XẠ KHUẨN Streptomyces, ĐỂ PHÒNG CHỐNG BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT (Capsicum frutescens) TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG Mã số: Đ 2013-03-39 Xác nhận quan chủ trì đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Lê Thị Mai Đà Nẵng, Tháng 12/2013 Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU INFORMATION ON RESEARCH RESULTS MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT VỀ CÂY ỚT VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Colletotrichum sp GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN ỚT 1.1.1 Khái quát ớt 1.1.1.1 Đặc điểm sinh học ớt 1.1.1.2 Giá trị dinh dưỡng, y học ớt 1.1.2 Nghiên cứu loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 1.2 SƠ LƯỢC VỀ XẠ KHUẨN 1.2.1 Cấu tạo xạ khuẩn 1.2.2 Ứng dụng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh bảo vệ thực vật giới Việt Nam 1.2.2.1 Ứng dụng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh bảo vệ thực vật giới 1.2.2.2 Ứng dụng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh bảo vệ thực vật Việt Nam CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.2 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Địa điểm phạm vi nghiên cứu thí nghiệm 2.2.1.1 Địa điểm thu mẫu thực địa 2.2.2.2 Địa điểm nghiên cứu thí nghiệm Footer Page of 126 Header Page of 126 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp thu mẫu thực địa 2.3.1.1.Thu mẫu bệnh 2.3.1.2 Phương pháp thu thập mẫu đất 2.3.1.3 Phương pháp thu mẫu theo giai đoạn sinh trưởng, phát triên ớt 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm 2.3.2.1 Phương pháp phân lập mẫu bệnh 2.3.2.2 Sơ phân loại chủng nấm mốc gây bệnh ớt 2.3.2.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học 2.3.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 2.3.2.5 Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh 2.3.2.6 Phương pháp tìm hiểu khả ứng dụng dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thán thư ớt 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 THÀNH PHẦN CÁC CHỦNG VI NẤM GÂY TRÊN CÂY ỚT 3.2 NGHIÊN CỨU TRIỆU CHỨNG BỆNH VÀ LÂY BỆNH NHÂN TẠO CỦA CÁC CHỦNG NÂM MỐC GÂY BỆNH THÁN THƯ (Colletotrichum) TRÊN CÂY ỚT 3.2.1 Nghiên cứu chủng nấm mốc gây bệnh thán thư (Colletotrichum) ớt 3.2.2 Kết lây bệnh nhân tạo xác định tác nhân nấm gây bệnh thán thư ớt Footer Page of 126 Header Page of 126 3.3 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH MẠNH VỚI VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY ỚT 10 3.4 NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN XK5 12 3.4.1 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm hình thái 12 3.4.2 Đăc điểm sinh lý, sinh hóa 12 3.4.2.1 Xác định nhiệt độ pH tối ưu 12 3.4.2.2 Sự hình thành sắc tố mêlanin 13 3.4.2.3 Khả đồng hóa nguồn cacbon 13 3.4.2.4 Khả sinh amilaza, xenlulaza ngoại bào chủng xạ khuẩn XK5 14 3.5 KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN XK5 14 3.5.1 Hoạt tính kháng nấm Colletrichum chủng xạ khuẩn XK5 14 3.5.2 Lựa chọn môi trường lên men 15 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến khả sinh tổng hợp CKS 15 3.5.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp CKS 15 3.6 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA DỊCH KHÁNG SINH THÔ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN XK5 16 3.6.1 Xử lý hạt dung dịch kháng sinh thô chủng XK5 16 3.6.2 Phương pháp tạo chế phẩm 17 3.6.3 Xử lý đất trồng ớt nhiễm Colletotrichum 17 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 19 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC CÁC BẢNG Số Tên bảng hiệu Trang bảng 3.1 Thành phần tỷ lệ % chi nấm mốc gây bệnh ớt Tỷ lệ mẫu có nấm mốc gây bệnh thán thư 3.3 tổng số mẫu phân lập giai đoạn sinh trưởng, phát triển ớt 3.4 3.5 3.7 3.8 3.9 3.14 3.15 Kết lây bệnh nhân tạo chủng nấm NB11 lên ớt Hoạt tính kháng VSVKĐ 20 chủng XK chi Streptomyces Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng XK5 Khả sinh amilaza, xenlulaza ngoại bào chủng xạ khuẩn XK5 Hoạt tính kháng nấm colletotrichum chủng XK Kết ảnh hưởng dịch kháng sinh thô chủng XK5 Khả chống bệnh thán thư chế phẩm kháng sinh chủng XK5 Footer Page of 126 10 11 13 14 14 16 17 Header Page of 126 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU : Colony Foming Unit (Đơn vị khuẩn lạc) CKS : Chất kháng sinh CT : Công thức MT : Môi trường NB : Nấm bệnh STT : Số thứ tự TP : Thành phố VSV : Vi sinh vật XK : Xạ khuẩn Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1.Thông tin chung Tên đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn Streptomyces, để phòng chống bệnh thán thư ớt (Capsium frutescens) Thành phố Đà Nẵng Mã số: Đ2013-39 Chủ nhiệm đề tài : ThS Lê Thị Mai Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng Thời gian thực hiện: Từ tháng 01 năm 2013 đến 31 tháng 12 năm 2013 Mục tiêu Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm sinh học từ chủng xạ khuẩn Streptomyces để phòng chống nấm gây bệnh ớt (Capsium frutescens) số vùng Tp Đà Nẵng Tính sáng tạo Đề tài cung cấp số liệu ban đầu chủng nấm mốc gây bệnh thán thư ớt (Capsicum frutescent L.) số vùng trồng ớt TP Đà Nẵng Thông tin kết ứng dụng dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thán thư ớt cho hiệu tốt, sở khoa học cho việc ứng dụng chất kháng sinh lĩnh vực bảo vệ trồng điều kiện địa phương nhằm góp phần nâng cao suất trồng xây dựng nông nghiệp dựa quan điểm sinh thái bền vững 4.Kết nghiên cứu - Thành phần chủng nấm mốc gây bệnh ớt Footer Page of 126 Header Page of 126 - Phân lập, nghiên cứu 04 chủng nấm mốc gây bệnh thán thư ớt - Tuyển chọn 05 chủng xạ khuẩn (XK1, XK5, XK8, XK14, XK20) có hoạt tính mạnh, kháng với chủng nấm bệnh gây thán thư ớt - Đã nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng XK5 - Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm kháng sinh thô chủng xạ khuẩn XK5 chống nấm gây bệnh thán thư ớt cho kết tốt, có tác dụng kích thích nhẹ sinh trưởng, phát triển cây, ứng dụng vào thực tiễn địa phương 5.Tên sản phẩm - Bài báo khoa học: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn XK5 sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh thán thư ớt (Capsicum frutescens L.)’’ Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết nghiên cứu khả áp dụng Các kết nghiên cứu đề tài ứng dụng vùng trồng ớt TP Đà Nẵng Ngày 22 tháng 12 năm 2013 Cơ quan Chủ trì Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên) Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Footer Page 10 of 126 Header Page 16 of 126 1.2.2 Ứng dụng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh bảo vệ thực vật giới Việt Nam 1.2.2.1 Ứng dụng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh bảo vệ thực vật giới 1.2.2.2 Ứng dụng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh bảo vệ thực vật Việt Nam CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Các chủng nấm mốc gây bệnh phân lập từ mẫu bệnh ớt mẫu đất trồng ớt hợp tác xã La Hường (phường Hòa Thọ Đông, quận Cẩm Lệ), thôn Túy Loan (xã Hòa Phong, huyện Hòa Vang), thôn Lộc Mỹ (xã Hòa Bắc, huyện Hòa Vang) - TP Đà Nẵng - Chủng xạ khuẩn Streptomyces phân lập mẫu đất Tp Đà Nẵng - Cây ớt (Capsium frutescens) 2.2 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Địa điểm phạm vi nghiên cứu thí nghiệm 2.2.1.1 Địa điểm thu mẫu thực địa Mẫu bệnh ớt mẫu đất trồng ớt lấy số vùng trồng ớt TP Đà Nẵng như: hợp tác xã La Hường (phường Hòa Thọ Đông, quận Cẩm Lệ), thôn Túy Loan (xã Hòa Phong, huyện Hòa Vang), thôn Lộc Mỹ (xã Hòa Bắc, huyện Hòa Vang) 2.2.2.2 Địa điểm nghiên cứu thí nghiệm - Phòng thí nghiệm hóa sinh - vi sinh, khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 - Phòng thí nghiệm vi sinh, Trường Cao đẳng Lương thực thực phẩm, TP Đà Nẵng - Phòng Hóa- Vi sinh, Trung tâm Kỹ thuật TC ĐLCL2, TP.Đà Nẵng - Phòng Vi sinh- Hóa sinh, Trung tâm Môi trường, TP.Đà Nẵng 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2013 đến 31/12/2013 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp thu mẫu thực địa [1],[2],[6],[8] 2.3.1.1.Thu mẫu bệnh [1], [2], [8] 2.3.1.2 Phương pháp thu thập mẫu đất [3], [6], [7] 2.3.1.3 Phương pháp thu mẫu theo giai đoạn sinh trưởng, phát triên ớt [6], [16], [20] 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm 2.3.2.1 Phương pháp phân lập mẫu bệnh [2], [6], [19] 2.3.2.2 Sơ phân loại chủng nấm mốc gây bệnh ớt [2], [25], [37] 2.3.2.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học [6],[12] 2.3.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 2.3.2.5 Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh 2.3.2.6 Phương pháp tìm hiểu khả ứng dụng dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thán thư ớt 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 THÀNH PHẦN CÁC CHỦNG VI NẤM GÂY TRÊN CÂY ỚT Từ 63 mẫu bệnh ớt mẫu đất lấy số vùng trồng ớt thành phố Đà Nẵng: La Hường, Túy Loan Lộc Mỹ, phương pháp phân lập môi trường WA (môi trường đặc trưng để phân lập nấm mốc gây bệnh) phân lập 16 chủng nấm kí hiệu NB1- NB16 Sử dụng khóa phân loại Oh.I.S (1995) [37], Brian C Sutton (1998) [29], S B Marthu Olga Kongsdal (2000) [43], J Taylor (2007) [33], Antonio N Moretti(2009) [28], Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam [2] sở đặc điểm hình thái 16 chủng nấm mốc Đặc biệt đặc điểm quan sát kính hiển vi hình dạng cuống sinh bào tử, bào tử, sợi nấm sơ phân loại chi nấm mốc Kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Thành phần tỷ lệ % chi nấm mốc gây bệnh ớt STT Chi nấm Số chủng Tỷ lệ % Alternaria 12,5 Colletotrichum 25 Curvularia sp 6,25 Fusarium 25 Phytophothora 18,75 Choanephora 12,5 Qua bảng 3.1 cho thấy nấm mốc gây bệnh ớt thường gặp chi: Alternaria, Colletotrichum, Curvularia, Fusarium, Phytophothora, Chrophyran Trong Alternaria chiếm 12,5%, Colletotrichum chiếm 25%, Curvularia chiếm 6,25%, Fusarium chiếm 25%, Phytophothora chiếm 18.75%,Choanephora chiếm 12,5% Như vậy, chi Colletotrichum chi Fusarium có số lượng nhiều nhất, chi Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 Curvularia có số lượng Chi Colletotrichum nguyên nhân gây bệnh thán thư ớt, bệnh làm giảm sản lượng, chất lượng ớt giới Việt Nam 3.2 NGHIÊN CỨU TRIỆU CHỨNG BỆNH VÀ LÂY BỆNH NHÂN TẠO CỦA CÁC CHỦNG NÂM MỐC GÂY BỆNH THÁN THƯ (Colletotrichum) TRÊN CÂY ỚT 3.2.1 Nghiên cứu chủng nấm mốc gây bệnh thán thư (Colletotrichum) ớt Bảng 3.3 Tỷ lệ mẫu có nấm mốc gây bệnh thán thư tổng số mẫu phân lập giai đoạn sinh trưởng, phát triển ớt Mẫu có nấm bệnh/ Tổng số mẫu phân lập giai đoạn sinh trưởng, phát triển ớt Các chủng nấm gây bệnh thán thư NB1 Giai đoạn Giai đoạn trưởng thành Số lượng TLB Số lượng Số lượng TLB (%) TLB (%) (mẫu (%) (mẫu bệnh) (mẫu bệnh) bệnh) 2/18 11,11 1/18 5,56 3/27 11,11 2/18 11,11 2/27 7,407 2/27 7,407 2/18 11,11 3/18 16,67 7/27 25,93 Tỷ lệ bệnh tổng số 3/18 16,67 mẫu giai đoạn 8/18 38,89 14/27 51,86 NB4 NB6 NB11 Giai đoạn đậu Ghi chú: TLB: Tỷ lệ bệnh 3.2.2 Kết lây bệnh nhân tạo xác định tác nhân nấm gây bệnh thán thư ớt Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 10 Bảng 3.4 Kết lây bệnh nhân tạo chủng nấm NB11 lên ớt Chỉ tiêu Ngày phát bệnh TLB (%) ĐKVB sau ngày (mm) Triệu chứng Đặc điểm ớt Lây bệnh không sát thương Lây bệnh có sát thương Ớt lây nhiễm Đối Ớt lây nhiễm Đối chủng nấm chứng chủng nấm NB11 chứng NB11 Sau ngày Sau ngày 20 60 Hình thành vết Hình thành vết loét, loét, lõm, Bình lõm, màu nâu, Bình màu nâu, có sợi thường có sợi nấm phát thường nấm phát triển triển vết bệnh vết bệnh Ghi chú: TLB: Tỷ lệ bệnh ĐKVB: đường kính vết bệnh Qua bảng 3.4 hình 3.3 cho thấy triệu chứng biểu bệnh mô tả bảng phù hợp với kết điều tra đồng ruộng 3.3 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH MẠNH VỚI VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY ỚT Sau tiến hành phân lập 30 mẫu đất lấy từ nhiều vùng đất khác Tp Đà Nẵng, môi trường Gauze I, thu 45 chủng xạ khuẩn Dựa vào đặc điểm hình thái quan sát khuẩn lạc, hệ sợi khí sinh, cuống sinh bào tử, bào tử kính hiển vi theo khóa phân loại Gauze [7] Bergey [24] Chúng xác định 45 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces tạm kí hiệu từ XK1- XK 45 Để nghiên cứu sơ tuyển chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có hoạt tính kháng sinh, tiến hành nuôi cấy Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 11 45 chủng xạ khuẩn môi trường Gauze II, nhiệt độ 28 - 30ºC, thời gian - ngày cho hệ sợi phát triển mạnh, CKS hình thành Kết thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng VSVKĐ 20 chủng XK chi Streptomyces STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Các chủng xạ khuẩn XK1 XK2 XK3 XK4 XK5 XK6 XK7 XK8 XK9 XK10 XK11 XK12 XK13 XK14 XK15 XK16 XK17 XK18 XK19 XK20 Trong đó: Hoạt tính kháng Collestotrichum (Kích thước vòng vô khuẩn (D-d,mm) NB1 NB4 NB6 NB11 16 10 11 21 12 18 10 12 14 16 11 17 10 12 11 14 18 10 17 19 20 11 16 15 14 11 19 10 18 10 17 19 10 16 20 13 13 19 15 19 13 10 12 13 22 13 13 11 15 19 23 19 12 25 20 21 18 17 13 15 16 17 12 16 15 13 17 22 D – d ≤ 10: hoạt tính yếu; D – d = 10 -15: hoạt tính trung bình; D – d > 15: hoạt tính mạnh Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 12 Kết bảng 3.5 cho thấy có 20/45 chủng có hoạt tính kháng sinh với nấm kiểm định, chiếm tỷ lệ 44,4% Nếu so sánh với số liệu Lê Gia Hy nuớc (48,13%) [15] thấp Bùi Thị Hà (37,5%) [10] cao Trong 20 chủng có hoạt tính kháng sinh chống nấm có chủng xạ khuẩn XK1, XK5, XK8, XK14, XK20 có hoạt tính mạnh Trong đó, chủng XK5 có khả kháng mạnh nấm bệnh gây hại Từ đó, tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn XK5 để có sở khoa học cho việc tạo chế phẩm kháng vi nấm ớt 3.4 NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN XK5 3.4.1 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm hình thái Qua bảng 3.6 hình 3.4 cho thấy chủng xạ khuẩn XK5 sinh trưởng mạnh môi trường A4-H Gauze II môi trường giàu đạm hữu cơ, sinh trưởng môi trường GauzeI, ISP-4 mọc yếu môi trường Czapek tinh bột Chủng XK5 có biến đổi màu sắc HSKS HSCC qua môi trường mô tả sau: HSKS có màu trắng đến trắng xám HSCC có màu nâu đến nâu đậm Chủng XK5 có khả sinh sắc tố tan từ màu vàng nhạt, vàng đậm Hình dạng cuống sinh bào tử chủng XK5 dạng RF, thẳng ngắn đến lượn sóng 3.4.2 Đăc điểm sinh lý, sinh hóa 3.4.2.1 Xác định nhiệt độ pH tối ưu Chủng xạ khuẩn XK5 nuôi cấy môi trường peptoncao nấm men- thạch, nhiệt độ khác nhau: 21, 24, 28, 30, 350C Kết cho thấy chủng XK5 sinh trưởng phát triển tốt nhiệt độ 28- 300C, sinh trưởng yếu nhiệt độ 350C Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 13 pH: Chủng XK nuôi cấy môi trường pepton- cao nấm men- thạch chỉnh pH= 5-8, nhiệt độ 28-300C, thời gian 5-7 ngày Sau lấy quan sát khả sinh trưởng chủng XK5 Kết cho thấy chủng XK sinh trưởng pH= 6,5- pH tối ưu pH = 7,0 3.4.2.2 Sự hình thành sắc tố mêlanin Chủng xạ khuẩn tuyển chọn nuôi cấy môi trường ISP-4, pH= 7,0, nhiệt độ 28- 300C, thời gian 15 ngày Bắt đầu quan sát màu môi trường sau ngày đến 15 ngày Nếu kết dương tính (+), màu môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang vàng nâu tối đến màu đen Kết cho thấy chủng xạ khuẩn XK5 sau 24 khả tiết sắc tố melanin môi trường làm cho môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang vàng nâu tối đến màu đen Khi nuôi chủng XK5 môi trường khác GauzeI, Gauze II, A4-H cho thấy hình thành sắc tố 3.4.2.3 Khả đồng hóa nguồn cacbon Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn XK5 trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng XK5 Nguồn cacbon Chủng xạ khuẩn XK5 D- glucoza + D- Frucroza + Dextrin + saccaroza + D- Manitol + L- Rhamnoza - Lactoza + Chú thích: Có khả : + Không có khả – Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 14 Qua kết bảng 3.7 cho thấy: Chủng XK5 có khả sử dụng nguồn cacbon D- glucoza, D- Frucroza, Dextrin, saccaroza, D- Manitol Không sử dụng nguồn cacbon L- Rhamnoza 3.4.2.4 Khả sinh amilaza, xenlulaza ngoại bào chủng xạ khuẩn XK5 Sau sử dụng phương pháp khuếch tán thạch cách đục lỗ, nhỏ dịch lên men đo vòng phân giải (D-d,mm) Kết thu bảng 3.8 Bảng 3.8 Khả sinh amilaza, xenlulaza ngoại bào chủng xạ khuẩn XK5 Hoạt tính enzim (D-d,mm) Chủng xạ khuẩn XK5 Xenlulaza Amylaza 21±1,4 26±1,25 3.5 KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN XK5 3.5.1 Hoạt tính kháng nấm Colletrichum chủng xạ khuẩn XK5 Bằng phương pháp khối thạch xác định khả ức chế nấm Collectotrichum chủng xạ khuẩn XK5 Kết trình bày bảng 3.9 sau: Bảng 3.9 Hoạt tính kháng nấm Colletotrichum chủng XK Hoạt tính kháng Colletotrichum (Kích thước vòng vô khuẩn, D-d,mm) Chủng xạ khuẩn XK5 NB1 NB4 NB6 NB11 21±1,1 20±1,7 19±1,53 25±0,82 Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 15 Qua kết bảng 3.9 cho thấy chủng xạ khuẩn XK5 có khả kháng nấm mạnh rộng với nhiều chủng nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 3.5.2 Lựa chọn môi trường lên men Chủng xạ khuẩn XK5 có hoạt tính kháng sinh kháng nấm mạnh môi trường A-4H Đây môi trường giàu đạm hữu thích hợp cho xạ khuẩn sinh trưởng phát triển Ngoài ra, thành phần môi trường A4-H đơn giản, thuận lợi cho việc tách chiết chất kháng sinh Do vậy, môi trường chọn làm môi trường lên men thích hợp cho trình sinh tổng hợp chất kháng sinh 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến khả sinh tổng hợp CKS * Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu thích hợp cho khả hình thành CKS 28 C Nhận xét phù hợp với nhiều tác giả nghiên cứu * Ảnh hưởng pH ban đầu Qua kết bảng 3.12 cho thấy pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS chủng XK5 pH=7-8 Nhưng pH tối ưu cho khả hình thành CKS chủng xạ khuẩn XK5 pH=7 Khi pH< ức chế hình thành CKS chủng XK5 3.5.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp CKS Chủng xạ khuẩn XK5, CKS hình thành sau ngày nuôi cấy, lượng kháng sinh đạt cực đại vào ngày thứ Do CKS sản phẩm trao đổi thứ cấp hình thành pha log ( sau 2448 nuôi cấy) đạt cực đại sau 120 nuôi cấy Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 16 3.6 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA DỊCH KHÁNG SINH THÔ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN XK5 3.6.1 Xử lý hạt dung dịch kháng sinh thô chủng XK5 Ớt giống ớt F1 TN155 có phẩm chất tốt, rửa sạch, ngâm vào nước ấm, sau xử lý theo công thức khác (mục a, thuộc 2.3.2.10) Kết thể bảng 3.14 Bảng 3.14 Kết ảnh hưởng dịch kháng sinh thô chủng XK5 hạt ớt nhiễm chủng nấm NB11 (Colletotrichum) Công thức Thí nghiệm Tổng số hạt Số hạt bị bệnh TLB (%) CT1 Hạt ớt + Colletotrichum+ dịch nuôi cấy MT A-4H chủng XK5 30 15 50 CT2 Hạt ớt + Colletotrichum + dịch nuôi cấy MT A-4H có chủng XK5 30 30 CT3 Hạt ớt + dịch dịch nuôi cấy MT A-4H có chủng XK5 30 0 CT4 Hạt ớt + dịch dịch nuôi cấy MT A-4H chủng XK5 30 0 Qua kết bảng 3.14 hình 3.7 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh thán thư công thức khác Ở CT1 tỷ lệ mắc bệnh 50%, CT2 30% (giảm tỷ lệ tới 20%) việc xử lý hạt ớt bị nhiễm nấm Colletotrichum dịch nuôi cấy chủng XK5 có hiệu rõ rệt Footer Page 26 of 126 Header Page 27 of 126 17 3.6.2 Phương pháp tạo chế phẩm Các chủng xạ khuẩn nuôi cấy nuôi cấy lắc 220 vòng/ phút nhiệt độ 28°C môi trường A4-H, sau ngày giống cấp 1, nhân tiếp môi trường A4-H với % giống cấp 1, sau ngày giống cấp Tiếp tục lên men rắn môi trường cám : trấu : nước với tỷ lệ : : với 10% giống cấp 2, sau - ngày thu chế phẩm rắn, tiến hành sấy khô nhiệt độ 35°C ta thu chế phẩm khô, nghiền bột đóng gói để bảo quản 3.6.3 Xử lý đất trồng ớt nhiễm Colletotrichum Việc thử nghiệm tiến hành theo công thức mục Kết trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15 Khả chống bệnh thán thư chế phẩm kháng sinh chủng XK5 Công thức CT1 Thí nghiệm Đất nhiễm nhiễm nấm Colletotrichum + không Chiều cao trung bình Tổng số Số bị bệnh 10 60 26,3 ± 0,5 10 40 28,4 ± 0,3 10 0 27,8 ± 0,25 TLB (%) ( X ± m) có chế phẩm CKS thô dạng rắn CT2 Đất nhiễm nấm Colletotrichum + chế phẩm CKS thô dạng rắn CT3 Đất không nấm Colletotrichum + chế phẩm CKS thô dạng rắn Kết thực nghiệm bảng 3.15 hình 3.9 cho thấy có khác tỷ lệ nhiễm nấm Colletotrichum sinh trưởng chiều cao ớt công thức khác Đối với tỷ lệ nhiễm Footer Page 27 of 126 Header Page 28 of 126 18 nấm công thức CT1 có tỷ lệ mắc bệnh cao lên tới 60%, CT2 tỷ lệ 40% (giảm 20%) Như vậy, chế phẩm kháng sinh thô chủng XK5 ức chế nấm Colletotrichum giảm tỷ lệ mắc bệnh ớt Chiều cao tiêu quan trọng phản ánh tình trạng sinh trưởng với điều kiện ngoại cảnh Chiều cao trung bình CT2 28,4cm cao so với CT1 2,1cm, CT3 0,6cm Các kết chứng tỏ vai trò hiệu tích cực chế phẩm kháng sinh thô chủng XK5 việc ngăn ngừa xâm nhiễm nấm colletotrichum vào ớt đạt hiệu Đây sở khoa học cho việc ứng dụng chất kháng sinh lĩnh vực bảo vệ trồng điều kiện địa phương cách hợp lý hiệu quả, nhằm giảm thiểu tồn dư chất sát trùng, thuốc trừ sâu tích lũy rau quả, hạt tiến tới xây dựng nông nghiệp bền vững Footer Page 28 of 126 Header Page 29 of 126 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua nghiên cứu rút số kết luận sau: 1.1 Đã xác định 16 chủng nấm mốc gây bệnh ớt thuộc chi, : Alternaria chiếm 12,5%, Colletotrichum chiếm 25%, Curvularia chiếm 6,25%, Fusarium chiếm 25%, Phytophothora chiếm 18.75%,Choanephora chiếm 12,5% Trong có chủng nấm mốc gây bệnh thán thư (NB1, NB4, NB6, NB11) chủng NB11 ảnh hưởng suốt trình sinh trưởng phát triển ớt 1.2 Phân lâp, tuyển chọn 20 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm thán thư Trong 05 chủng xạ khuẩn (XK1, XK5, XK8, XK14, XK20) có hoạt tính mạnh.chủng XK5 có khả kháng mạnh nấm bệnh gây thán thư ớt 1.3 Đã nghiên cứu ảnh hưởng môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy tới khả sinh kháng sinh chủng XK5 Kết chủng XK5 môi trường A4-H, lượng kháng sinh đạt cao sau ngày lên men nhiệt độ 280C, pH= 7,0 1.4 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm kháng sinh thô chủng xạ khuẩn XK5 chống nấm gây bệnh thán thư ớt cho kết tốt, có tác dụng kích thích nhẹ sinh trưởng, phát triển cây, ứng dụng vào thực tiễn địa phương KIẾN NGHỊ 1.1 Tiếp tục nghiên cứu điều kiện giữ giống xạ khuẩn để giữ nguyên hoạt tính thời gian dài Footer Page 29 of 126 Header Page 30 of 126 20 1.2 Nghiên cứu chất mang tối ưu để tạo chế phẩm có hoạt tính mạnh nhất, bảo quản lâu dài mang hiệu kinh tế cao 1.3 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm, ứng dụng đối kháng với nấm bệnh nhiều trồng khác Footer Page 30 of 126 ... Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn Streptomyces, để phòng chống bệnh thán thư ớt (Capsium frutescens) Thành phố Đà Nẵng MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm sinh. .. ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ XẠ KHUẨN Streptomyces, ĐỂ PHÒNG CHỐNG BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY... HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1.Thông tin chung Tên đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn Streptomyces, để phòng chống bệnh thán thư ớt (Capsium