BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y ********** TIỂU LUẬN TỐT NGHIỆP THEO DÕI TỶ LỆ GÀ, VỊT CÓ KHÁNG THỂ ĐỦ BẢO HỘ VỚI VIRUS CÚM A SUBTYPE H5N1 SAU TIÊM PHÒNG VẮCXIN TẠI HUYỆN TÂN UYÊN, TỈNH BÌNH DƯƠNG Sinh viên thực : TẠ VĂN MINH LỚP : TC05 TYBD Ngành : THÚ Y Niên khóa : 2005 - 2010 Tháng 4/2011 THEO DÕI TỶ LỆ GÀ, VỊT CÓ KHÁNG THỂ ĐỦ BẢO HỘ VỚI VIRUS CÚM A SUBTYPE H5N1 SAU TIÊM PHÒNG VẮCXIN TẠI HUYỆN TÂN UYÊN, TỈNH BÌNH DƯƠNG TẠ VĂN MINH Tiểu luận đệ trình đáp ứng yêu cầu cấp bác sỹ thú y Giáo viện hướng dẫn TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH Tháng 3/2011 LỜI CẢM TẠ -Chân thành cảm tạ : Quý thầy cô trường Đại Học Nơng Lâm tận tình giảng dạy cho tơi, kiến thức bổ ích phục vụ cho cơng tác chuyên môn sống Quý thầy cô khoa chăn nuôi thú y trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh tận tình hướng dẫn, giảng dạy truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm chuyên môn sống hàng ngày cho tôi, suốt thời gian học tập trường -Chân thành cảm tạ : TS Nguyễn Thị Phước Ninh người thầy tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, kinh nghiêm thực tế chuyên ngành khoa chăn nuôi Thú Y giáo viên trực tiếp hướng đẫn tiểu luận tốt nghiệp, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi nhất, cho tơi hồn thành tiểu luận -Chân thành cảm tạ : Ban lãnh đạo chi cục Thú Y tỉnh Bình Dương tạo điều kiện thuận lợi gúp đở suốt thời gian học thực tiểu luận tốt nghiệp Trạm chẩn đốn-xét nghiệm Chi Cục Thú Y tỉnh Bình Dương tận tình gúp đở tạo thuận lợi cho tơi thưc hoàn thành tiểu luận Trạm Thú Y Tân Uyên đả giúp đở tạo thuận lợi cho suốt trình học tập thực tiểu luận Cảm ơn Hà người thường xuyên đôn đốc, động viên tình thần cho tơi suốt q trình học tập thực tiểu luận Cảm ơn bạn đồng nghiệp giúp đở tội suốt thời gian học thực hiên tiểu luận TẠ VĂN MINH XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên : TẠ VĂN MINH Tên đề tài: “THEO DÕI TỶ LỆ GÀ, VỊT CÓ KHÁNG THỂ ĐỦ BẢO HỘ VỚI VIRUS CÚM A SUBTYPE H5N1 SAU TIÊM PHÒNG VẮCXIN TẠI HUYỆN TÂN UN, TỈNH BÌNH DƯƠNG” Đã hồn thành đề tài theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến nhận xét, đóng góp hội đống chấm thi tốt nghiệp ngày ……/……/2011 Giáo viên hướng dẫn TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH TÓM TẮT Đề tài: “THEO DÕI TỶ LỆ GÀ, VỊT CÓ KHÁNG THỂ ĐỦ BẢO HỘ VỚI VIRUS CÚM A SUBTYPE H5N1 SAU TIÊM PHỊNG VẮCXIN TẠI HUYỆN TÂN UN, TỈNH BÌNH DƯƠNG” Được thực từ 15 tháng năm 2010 đến 15 tháng năm 2011 16 xã, thị trấn thuộc huyện Tân Uyên, tỉnh bình Dương Nhằm đánh giá tỉ lệ gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ với virus cum gia cầm H5N1 sau tiêm phòng vắcxin làm liệu cho cơng tác phịng chóng dịch, Khảo sát thực 2.757 mẫu huyết vừa gà vịt 126 hộ chăn nuôi nhỏ lẻ 51trại chăn nuôi tập trung lấy mẫu huyết sau tiêm phòng 30 ngày Sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutination Inhibition), để xác định hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng cúm A subtuye H5N1 Các tiêu khảo sát: -Theo dõi tỉ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ đàn gà, vịt nhỏ lẻ trang trại sau tiêm phòng vắcxin cúm gia cầm H5N1 -Theo dõi tỉ lệ đàn gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ sau tiêm phòng vắcxin cúm gia cầm H5N1 Kết khảo sát cho thấy sau: Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phòng vắccine hộ chăn nuôi nhỏ lẻ theo xã 72,32%, xã không đạt Bạch Đằng 61,45%, Tân Lập 47,44%, Phú Chánh 30,00% khác biêt giữ xã có ý nghĩa thống kê Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phịng vắccine theo lồi 61,26% gà 64,33% vịt 33,33% Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phòng vắccine theo qui mô chăn nuôi nhỏ lê 63,61% trang trại 59,38% Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phòng vắccine theo Hướng sản xuất trứng 93,14% thịt 59,38% Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phòng vắccine theo lần têm phòng khác biệt có nghĩa thống kê Lần 59,10%, lần 89,32%, lần 95,26% Tỉ lệ đàn có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phịng vắccine hộ chăn ni nhỏ lẻ theo xã khác biệt có ý nghĩa thống kê Tỉ lệ chung 61,53%, xã không đạt bảo hộ Thạnh Phước 50,00%, Vĩnh Tân 50,00%, Bạch Đằng 33,33% hai xã đạt O% Tân Lập Tỉ lệ đàn có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phịng vắccine theo lồi gà 65,81% vịt 22,22% Tỉ lệ đàn có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phịng vắccine theo qui mơ chăn ni nhỏ lẻ 58,115 trang trại 69,23% Tỉ lệ đàn có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phòng vắccine theo Hướng sản xuất trứng !00% thịt 57,93% Tỉ lệ đan có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1sau tiêm phòng vắccine theo lần têm phòng khác biệt có ý nghĩa thống kê Tỉ lệ bảo hơ qua lần lả,13%, lần 91,67%, lần 100% MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TÓM TẮT .5 MỤC LỤC .7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 DANH SÁCH CÁC BẢNG 14 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ 19 Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶt vẤn đỀ 1.2 MỤC ĐÍCH 1.3 YÊU CẦU TỔNG QUAN 2.1 HỆ miỄn dỊch gia cẦm 2.1.1 Các quan lympho tham gia đáp ứng miễn dịch 2.1.1.1 Các quan lympho trung ương 2.1.1.2 Các quan lympho ngoại vi .4 Sơ đồ 2.1 Phát triển Lympho B T (Tizard Schubot, 2000) 2.1.2 Đáp ứng miễn dịch gia cầm 2.1.2.1 Miễn dịch không đặc hiệu 2.1.2.2 Miễn dịch đặc hiệu .6 Sơ đồ 2.2 Mơ hình tổng quát chế đáp ứng miễn dịch gia cầm 2.2.Sơ lưỢc vỀ bỆnh cúm gia cẦm 2.2.1 Lịch sử bệnh 2.2.2 Khái niệm 2.2.3 Lịch sử phân bố bệnh 2.2.4 Căn bệnh 10 2.2.5.Cấu trúc virus ( 10 Hình : 2.1 cấu tạo virus cúm A .10 2.2.6 Đặc điểm nuôi cấy .11 2.2.7 Độc lực virus 11 2.2.8.Sức đề kháng 12 2.2.9.Đặc điểm dịch tể học 12 2.2.10.Truyền nhiễm học .13 2.2.10.1.Cách lây lan .13 Hình : 2.2 Đường lây lan bệnh cúm A 13 Hình 2.3 Đường truyền lây bệnh cúm A (nguyễn Thị Phước Ninh, 2007) 13 2.2.11.Triệu chứng 14 Hình 2.4 Gà bị sưng đầu, m, mào, tích tím tái 14 Hình: 2.5 Xuất huyết lớp sừng chân .14 2.2.12 Bệnh tích 15 Hình 2.6 Nang nỗn thối hóa, mền nhão, sung huyết, xuất huyết .16 Hình 2.7 Tụy tạng xuất huyết hoại tử 16 Hình 2.8 Xuất huyết mô liên kết 17 Hình 2.9 Phổi viêm thủy thủng .17 2.2.13.Chẩn đoán 17 2.2.13.1 Chẩn đoán lâm sàng .17 2.2.13 2.Chẩn đốn phịng thí nghiệm 17 2.2.14 Phòng bệnh 18 Hình 2.10 Phịng bệnh cúm phương thức chăn nuôi 18 2.2.15.Chống dịch Cum gia cầm 19 2.3.VẮcxin phòng bỆnh cúm gia cẦm 19 2.3.1.Vắcxin 19 2.3 2.Các loại vắcxin sử dụng Việt Nam 20 2.4 NhỮng yẾu tỐ Ảnh hưỞng đÊn đáp Ứng miỄn dỊch vỚi vẮcxin 20 2.4.1 Đáp ứng miễn dịch mang tính cá thể 20 2.4.2.Số lần sử dụng vắcxin 21 Hình 2.11 loại vácxin sử dụng Việt Nam 21 2.4.3.Chất phụ gia vắcxin 21 2.4.5 Cách sử dụng vắcxin 22 2.5.Tình hình chăn ni gia cẦm TẠi huyỆn tân un năm 2010 .22 2.5.1.Cơ cấu đàn 22 2.5.2.Tỉ lệ tiêm phòng 22 Bảng 2.1: Tỉ lệ tiêm phòng hộ chăn nuôi nhỏ lẻ tổng đàn huyện Tân Uyên .22 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 1.ThỜi gian đỊa điỂm thỰc hiỆn 23 3.2 ĐỐi tưỢng theo dõi 23 3.3 NỘi dung khẢo sát 23 Chì tiêu theo dõi 23 3.4 Tỉ lệ mẫu huyết gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1 .23 3.4 Tỉ lệ đàn gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1 23 3.5 VẬt liỆu thỰc hiỆn 24 3.6 VẮcxin Quy trình tiêm phịng: 24 Bảng 3.1: Quy trình tiêm phịng vắcxin Cúm .24 3.7 Phương pháp tiẾn hành: 24 3.7.1.Cách chọn mẫu : 24 3.7.2.Cách bố trí lấy mẫu 25 Bảng 3.2: Cách bố trí lấy mẫu theo đàn 25 Bảng 3.3: Cách bố trí lấy mẫu huyết 26 3.8 Phương pháp xét nghiỆm kháng thỂ H5 (HI) 26 Sơ đồ 3.1 Phương pháp xét nghiệm kháng thể H5 (HI) .27 Bảng 3.4: Cách thực hiệu ứng HA 29 3.8.1 Phương pháp HI phát type phụ H5 xác định hiệu giá kháng thể 30 3.8.1.1 Cách chuẩn bị huyền dịch kháng nguyên đơn vị HA/25µl cho phản ứng HI 30 3.8.1.2 Tiến hành phản ứng 30 Bảng 3.5: Cách thực phản ứng HI 31 3.8.2 Kết luận mẫu xét nghiệm 31 3.9 Cơng THỨc tính cỬI tiêu theo dõi 31 3.10 Cách xỬ lý sỐ liỆu 33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 TỶ lỆ mẪu huyẾt gà, vỊt có khẢ bẢo hỘ vỚi bỆnh Cúm subtype H5N1 34 4.1.1 Tỉ lệ mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo xã .34 Bảng 4.1: Số mẫu huyết gà có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 hộ chăn nuôi nhỏ lẻ theo xã 34 4.1.2 Tỉ lệ mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo loài gia cầm .35 Bảng 4.2: Số mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo loài gia cầm .35 10 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN - Thời gian: Từ 15 tháng 09 năm 2010 đến 31 tháng 03 năm 2011 - Địa điểm thực tiểu luận + Địa điểm lấy mẫu: Đàn gia cầm (gà, vịt) 50 hộ chăn nuôi nhỏ lẻ 15 xã 51 trang trại năm xã huyện Tân Uyên + Địa điểm xét nghiệm định hiệu giá kháng thể chống bệnh Cúm gia cầm: Trạm chẩn đoán-xét nghiệm chi Cục Thú Y Bình Dương 3.2 ĐỐI TƯỢNG THEO DÕI - Đàn gia cầm nuôi nhỏ lẻ: Gồm gà, vịt 65 hộ chăn ni nhỏ lẻ có quy mơ chăn ni 2000 - Trang trại: Gồm gà 52 trang trại có quy mơ 2000 3.3 NỘI DUNG KHẢO SÁT Đánh giá tỷ lệ gà, vịt có khả bảo hộ với bệnh cúm gia cầm H5N1 sau tiêm phịng huyện Tân Un tỉnh Bình Dương CHÌ TIÊU THEO DÕI 3.4 Tỉ lệ mẫu huyết gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1 - Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ theo xã - Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ theo loài - Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ theo qui mơ chăn ni - Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ theo hướng sản xuất - Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ theo lần tiêm phòng 3.4 Tỉ lệ đàn gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1 - Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ theo xã - Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ theo loài - Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ theo qui mơ chăn ni - Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ theo hướng sản xuất - Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ theo lần tiêm phòng 3.5 VẬT LIỆU THỰC HIỆN - Thiết bị: Gồm tủ lạnh, tủ lạnh âm (-70 0C), máy lắc, máy ly tâm, nồi hấp cách thủy - Dụng cụ : gồm có xy lanh 3ml, ống chắt huyết (eppendoff) 1,5 ml, tube nhựa 1,5ml, vỉ nhựa 98 giếng, micropipet, đầu tiếp micropipet, găng tay, trang - Mẫu máu lấy từ tĩnh mạch cánh (ở gà), tĩnh mạch chân (ở vịt) Dùng xy lanh lấy 1-2ml máu gia cầm, để nghiêng 45 60 phút, sau chắt lấy huyết để xét nghiệm bảo quản lạnh 40C 72 tuần -700C - Kháng nguyên chuẩn H5N1: AIV antigen H5N1 (kháng nguyên virus cúm gà H5N1 công ty VLA-Anh (1ml/ống), sử dụng cho phản ứng HI phát kháng thể chống virus Cúm type phụ H5 3.6 VẮCXIN VÀ QUY TRÌNH TIÊM PHÒN Vắcxin: Sử dụng vắc xin H5N1 chủng Re-1 Trung Quốc chai 100 ml Bảng 3.1: Quy trình tiêm phòng vắcxin Cúm (Kế hoạch tiêm phòng Cúm gia cầm Chi Cục Thú Y Bình Dương) Loại loại gia vắcxin H5N1 cầm Gà chủng Vịt Mũi thứ I 14-35 ngày tuổi Trên 35 ngày tuổi 14-35 ngày tuổi Trên 35 ngày tuổi Quy trình sử dụng Lập lại liều dùng tháng sau 0,5ml Mỗi tháng 0,5ml 28 ngày sau 0,3ml 28 ngày lập 1ml lại sau tháng 3.7 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH: 3.7.1.Cách chọn mẫu - Chon mẫu theo dõi : Huyết gà, vịt Đường tiêm Da cổ Tiêm bắp Da cổ Tiêm bắp - Chọn mẫu ngẩu nhiên từ cá thể đàn tiêm phòng cúm sau 30 ngày(ở gà ) sau tiêm lập lại 30 ngày(ở vịt ) 3.7.2.Cách bố trí lấy mẫu Bảng 3.2: Cách bố trí lấy mẫu theo đàn S ố TT Số đàn lấy mẫu từ hộ dân Xã Gà thịt Vịt thịt Số đàn lấy mẫu từ trang trại Gà thịt Gà đẻ TP TP TP TP TP TP TP TP Uyên Hưng - - - - - Thái Hòa - - - - - - - Thạnh Phước - - - - - - - Đất Cuốc - - - - - Vĩnh Tân - - - - - - - Lạc An - - - - - - - Tân lập - - - - - - - Tân Định - - - - - - - Phú Chánh - - - - - - - 10 Tân Thành - - - - - - - 11 Bạch Đằng - - - - - - - 12 Hiếu Liêm - - - - - - - 13 Tân Mỹ - - - 11 - - - 14 Thường Tân - - - - - - - !5 Khánh Bình - - - - - - - 16 Tân Hiệp - - - - - - - 17 Tân Vĩnh Hiệp - - - - 24 - - - 42 23 46 Tổng cộng - Chọn 11 22 xã lấy mẫu gà chăn nuôi nhỏ lẻ, đàn vịt chăn nuôi nhỏ lẻ huyện Số lượng mẫu mổi xã lấy 90 mẫu gà 30 mẫu đàn vịt, trang trại trại lấy 30 mẫu, Mẫu huyết lấy đàn sau tiêm phòng 30 ngày, để kiểm tra khả bảo hộ theo hướng dẫn, định Chi Cục Thú Y Bảng 3.3: Cách bố trí lấy mẫu huyết Số TT 10 11 12 13 14 !5 16 17 Xã Uyên Hưng Thái Hòa Thạnh Phước Đất Cuốc Vĩnh Tân Lạc An Tân lập Tân Định Phú Chánh Tân Thành Bạch Đằng Hiếu Liêm Tân Mỹ Thường Tân Khánh Bình Tân Hiệp TânVĩnh Hiệp Tổng cộng Số mẫu huyết từu hộ Số mẫu huyết từ trang trại Gà thịt dân Vịt thịt TP TP TP TP 90 90 89 86 88 92 78 72 90 92 83 30 30 90 123 610 340 273 Gà thịt TP TP 130 150 330 30 719 1359 Gà đẻ TP TP 150 25 25 150 3.8 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ H5 (HI) Theo Quyết định 495 QĐ/TY-CĐ ngày 29/4/2004 Cục Thú Y ban hành quy trình xét nghiệm kháng thể H5 phương pháp HI qui định sau: (1) qui trình xét nghiệm Mẫu máu (gà, vịt) Tách lấy huyết Xử lý huyết Thực phản ứng HI Phản ứng HI đương tính Phản ứng HI âm tính Mẫu dương tính Mẫu âm tính (Xác định phân type H5) Hiệu giá kháng thể kháng virus Sơ đồ 3.1 Phương pháp xét nghiệm kháng thể H5 (HI) (Nguyễn Văn Bé Sáu, 2010) (2) Các giai đoạn chuận bị a Xử lý huyết RDE (Receptor destroying enzyme ) Trong huyết có phân tử khơng phải kháng thể, có khả bám vào điểm tiếp nhận hồng cầu gây ngưng kết hồng cầu, làm phản ngăn trở không đặc hiệu Do đo, kết sai lệch Tiến hành xử lý huyết bước sau: - Cho 60 µl PBS vào tất cà giếng từ cột đến cột 10 đĩa đáy hình chữ U - Cho 40 µl mẫu huyết vào giếng - Dùng băng keo dán kỹ đĩa đáy chữ U có chứa huyết pha lỗng đặt vào nồi ổn nhiệt 560C vòng 45 phút - Lấy đĩa để nhiệt độ phòng cho thêm 40 µl huyễn dịch hồng cầu 10% vào giếng chứa mẫu huyết Ủ đĩa nhhie6t5 độ phòng qua đêm 40C-80C, tách huyết thành tiến hành phản ứng HI Hoàn nguyên RDE PBS vô trùng (Theo hướng dẫn nhà sản xuất ) - Pha loãng mẫu huyết b ng dung dịch RDE, phần mẫu + ba phần RDE (40 µl mẫu + 120 µl RDE) - Ủ mẫu 370C qua đêm (16-20 giờ) - Đun hỗn hợp: Mẫu +RDE 560C 45 phút để nguội - Thêm µl RBC 10 % lắc đều, ủ 40C 30 phút - Lấy mẫu nước phía xét nghiệm b.Chuẩn bị hồng cầu gà 10% 1% : - Chọn 2-3 gà khỏe mạnh trưởng thành, máu sử dụng cho phản ứng kháng thể kháng virus Cúm H5N1 Newwcastle - Lấy máu 2-3 gà trộn lại khoảng 4-5ml, có chất kháng đơng ( EDTA) - Thêm lương tương đương PBS vào máu gà vừa lấy, lắc - Ly tâm 1500-2000 vòng phút, vòng 10 phút - Loại bỏ nước phía - Lập lại bước 3, 4, 5, làm ba lần, sau bước lần thứ 3, cho thêm lượng PBS tương đương lượng hồng cầu thu phía lắc - Dùng heamatocrite để đo phân trăm hồng cầu vừa thu hoạch (8) Dùng công thức V1 × C1 = V2 × C2 để tính pha hồng cầu % - Trong : V1, C1 thể tích nồng độ đo heamatocrite V2 ,C2 thể tích nồng độ cần dùng - Từ hồng cầu 10% áp dụng công thức tính pha hồng cầu 1% từ hồng cầu 10% pha với PBS hồng cầu 1% 10 c.Chuẩn bị kháng nguyên chuẩn -Kháng nguyên đông khô sẻ pha với 1ml dung dịch PBS để trở thành dung dịch kháng nguyên -Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) Nguyên lý phản ứng bề mặt virus Cúm có cấu trúc kháng nguyên Heamagglutinin có khà kết gắn với thụ thể bề mặt hồng cầu loại gà, vịt, bồ câu… làm ngưng kết loại hồng cầu - Chọn hàng (mõi hàng 12 giếng) vỉ nhựa đáy hình chữ U, có 96 giếng (ký hiệu A, B ) - Cho 50 µl PBS vào giếng -12 (ký hiệu từ A1- A12, B1 - B12 ) - Cho 50 µl kháng nguyên Cúm vào cặp giếng A1, B1 (pha loãng ) - Dùng micropipet trộn cặp giếng A 1, B1 Lấy 50 µl từ cặp giếng A1, B1, chuyển sang cặp giếng A2, B2 (pha loãng ) - Lập lại bước cặp giếng A 11, B11,từ cặp giếng A11, B11, bỏ 50 µl Giếng đối chứng 12 gồm PBS huyễn dịch hồng cầu 1% - Thêm 50 µl hồng cầu gà 1% vào tất giếng ( A 1- A12, B1 - B12 ), lắc nhẹ tay - Ủ 40C 30 phút - Đọc kết hiệu giá kháng nguyên (virus) độ pha lỗng cao có khả gây ngưng kết hồng cầu gà (kết ghi nhận hồng cầu gà cặp giếng A12, B12 (đối chứng) hồn tồn khơng ngưng kết) Bảng 3.4: Cách thực hiệu ứng HA Giếng Chất tham gia Dung dịch BPS (µl) 50 Cho kháng nguyên 50 10 11 ĐC 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 (-) 50 16 32 64 1 128 256 cúm chuẩn vào giếng (µl) Độ pha lỗng kháng ngun Cúm chuẩn 1 5212 1024 2048 (-) (µl) Huyễn dịch hồng cầu 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 gà 1% (µl) Lắc nhẹ tay Ủ 40 C 45 phút Kết 3.8.1 Phương pháp HI phát type phụ H5 xác định hiệu giá kháng thể 3.8.1.1 Cách chuẩn bị huyền dịch kháng nguyên đơn vị HA cho phản ứng HI Ví dụ : Giả sử hiệu giá huyễn dịch hồng cầu kháng nguyên điều 256 có nghĩa có 256 HAU/(HAU : Đơn vị gây ngưng kết hồng cầu ) - 4HAU/ = 1 × 4= 256 64 - Phải kiểm tra dịch kháng nguyên HAU trước tiến hành phản ứng 3.8.1.2 Tiến hành phản ứng - Cho 25 µl PBS vào tất giếng đĩa 96 giếng, từ ( A1- H12) - Cho 25 µl huyết (mẫu xử lý) vào giếng thứ hàng (A1- H1) hàng kiểm tra mẫu) - Từ giếng thứ 1(A1- H1), dùng micropipet trộn lấy 25 µl chuyển sang giếng thứ (A2- H2), tương tự từ giếng thứ chuyển sang giếng thứ (A 3- H3) tiếp tục chuyển đến giếng thứ 10 (A10- H10), hút bỏ 25 µl - Nhỏ 25 µl kháng nguyên HAU vào giếng thứ đến thứ 10 ( A 1- H10) giếng thứ 12 ( A12- H12), lắc - Để nhiệt độ phòng 60 phút, 30 phút lắc lần - Nhỏ 25 µl hồng cầu gà 1% vào tất giếng ( A1- H12) - Ủ 40C 45 phút - Đọc kết : hiệu giá kháng thể kháng virút cúm gia cầm mẫu huyết độ pha loãng cao mẫu huyết có tượng ức chế (ngăn trở) ngưng kết hồng cầu 50% so với đối chứng (đóng nút) - Kết luận : Mẫu huyết xem có kháng thể kháng virút cúm gia cầm (dương tính) khí có hiệu giá lớn Type phụ dương 16 tính tuỳ thuộc vào kháng nguyên dùng phản ứng HI Bảng 3.5: Cách thực phản ứng HI Giếng Chất tham gia Dung dịch BPS (µl) 25 Huyết gia cầm 25 11 ĐC 25 (-) 25 (+) 25 25 25 25 25 25 16 32 64 1 128 256 1 5212 1024 2048 (-) Kháng nguyên đv 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 HA (µl) Lắc đều, để yên nhiệt độ phòng 60 phút Huyễn dịch hồng cầu 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 (µl) 25 10 25 kiểm tra (µl) Độ pha lỗng huyết 25 gà % (µl) Ủ 40 C 45 phút Kết 3.8.2 Kết luận mẫu xét nghiệm Căn văn hướng dẫn số 487/TY-DT ngày 01/04/2009 Về việc hướng dẫn giám sát sau tiêm phòng cúm giám sát lưu hành virút cúm năm 2009 Cục Thú Y Theo tiêu chí đánh giá hiệu giá HI ≥ (4 log2), coi hiệu giá bảo 16 hộ cá thể gia cầm, đàn gia cầm bảo hộ đàn có tỉ lệ ≥ 70% số cá thể có hiệu giá HI ≥ (4 log2) 16 3.9 CƠNG THỨC TÍNH CÁC CỬI TIÊU THEO DÕI Số mẫu có kháng thể đủ bảo hộ theo lồi - Tỉ lệ mẫu có kháng thể đủ bảo hộ = x 100 theo loài % Tổng số mẫu khảo sát theo lồi Số mẫu có kháng thể đủ bảo hộ theo xã -Tỉ lệ mẫu có kháng thể đủ bảo hộ = theo xã % x 100 Tổng số mẫu khảo sát theo xã Số mẫu có kháng thể đủ bảo hộ theo quy mơ -Tỉ lệ mẫu có kháng thể đủ bảo hộ = theo quy mô % x 100 Tổng số mẫu khảo sát theo quy mô Số mẫu có kháng thể đủ bảo hộ hương sản xuất -Tỉ lệ mẫu có kháng thể đủ bảo hộ = theo hướng sản xuất % x 100 Tổng số mẫu khảo sát theo hướng sản xuất Số mẫu có kháng thể đủ bảo hộ lần tiêm phòng -Tỉ lệ mẫu có kháng thể đủ bảo hộ = theo lần tiêm phòng % x 100 Tổng số mẫu khảo sát theo lần tiêm phịng Số đàn có khả đủ bảo hộ theo xã -Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ = theo xã % x 100 Tổng số đàn khảo sát theo xã Số đàn có khả đủ bảo hộ theo lồi -Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ = theo xã % x 100 Tổng số đàn khảo sát theo lồi Số đàn có khả đủ bảo hộ theo quy mô -Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ = theo qui mô % x 100 Tổng số đàn khảo sát theo qui mơ Số đàn có khả đủ bảo hộ theo hướng sản xuất -Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ = Theo hướng sản xuất % x 100 Tổng số đàn khảo sát theo hướng sản xuất Số đàn có khả đủ bảo hộ theo lần tiêm phịng -Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo hộ = theo lần tiêm phòng % x 100 Tổng số đàn khảo sát theo lần tiêm phòng 3.10 CÁCH XỬ LÝ SỐ LIỆU Trắc nghiệm λ (Chi-Square test) để so sánh tỷ lệ phần mềm Minitab Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong trình thực tiểu luận ghi nhận kết sau: 4.1 TỶ LỆ MẪU HUYẾT THANH GÀ, VỊT CÓ KHẢ NĂNG BẢO HỘ VỚI BỆNH CÚM SUBTYPE H5N1 4.1.1 Tỉ lệ mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo xã Tỷ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm A subtype H5N1 hộ chăn ni nhỏ lẻ theo xã trình bày qua bảng 4.1 Bảng 4.1: Số mẫu huyết gà có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 hộ chăn nuôi nhỏ lẻ theo xã STT 10 11 Xã.TT Uyên Hưng Thái Hòa Thạnh Phước Đất Cuốc Vĩnh Tân Lạc An Tân lập Tân Định Phú Chánh Tân Thành Bạch Đằng Tổng cộng Số mẫu xét nghiệm 90 90 89 86 88 92 78 72 90 92 83 950 Số mẫu bảo hộ 77 71 64 76 62 88 37 65 27 69 51 687 Tỉ lệ % 85,55 78,88 71,91 88,37 70,45 95,65 47,44 90,28 30,00 75,00 61,45 72,32 P 0,000 Căn bảng 4.1 cho thấy gà,vịt hộ chăn nuôi nhỏ lẻ sau tiêm phịng vắcxin Cúm H5N1 xã, có tỷ lệ cao xã Lạc An 95,65%, Tân Định 90,28% xã Đất Cuốc 88,37%, Uyên Hưng 85,55%, xã đạt yêu cầu Thái Hòa 78,88%, Xã Tân Thành 75,00%, Thạnh Phước 71,91%, Vĩnh Tân 70,45%, xã thấp Bạch Đằng 61,45%, Tân Lập 47,44%, Phú Chánh 30,00% Tỷ lệ chung đạt 72,32% cao so với kết tác giả Lưu Đình Lệ Thúy (2007) khảo sát hiệu giá kháng thể đàn gia cầm sau tiêm phòng số vắcxin cúm Bình Dương (66,15%), thấp tác giả Phạm Văn Diện (2009) khảo sát hiệu giá kháng thể gia cầm huyện Tân Uyên hộ nhỏ lẻ (81,63%) Theo Cục Thú Y, 2009 đàn gia cầm bảo hộ đàn có ≥ 70% cá thể có hiệu giá HI ≥ (4 log2) Kết cho thấy chí có xã 11 xã lấy 16 mẫu huyết xét nghiệm có khả bảo hộ với bệnh Cúm gia cầm subtype H5N1 Có thể sai sót tiêm phịng, kỹ thuật tiêm, không đủ liểu, ấp xe chổ tiêm, dinh dưỡng chăm sóc quản lý dịch bệnh 4.1.2 Tỉ lệ mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo loài gia cầm Kết tỉ lệ bảo hộ theo lồi gia cầm( gà, vịt), trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2: Số mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo loài gia cầm Loài gia cầm Gà Vịt Tổng cộng Số mẫu xét nghiệm 2484 273 2757 Só mẫu bảo hộ 1598 91 1689 Tỉ lệ % 64,33 33,33 61,26 P 0,000 Qua bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ với virus Cúm A subtype H5N1 hai đối tượng gà vịt huyện Tân Uyên 61,26%, tỉ lệ gà 64,33% vịt la3,33% Kết khảo sát chung gà cao so với kết tác giả Lưu Đình Lệ Thúy (2007) khảo sát hiệu giá kháng thể đàn gia cầm sau tiêm phòng số vắcxin cúm Bình Dương (66,15%), thấp tác giả Phạm Văn Diện (2009) khảo sát hiệu giá kháng thể gia cầm huyện Tân Uyên (85,25%) Kết vịt cao tác giả Phạm Văn Diện (2009) khảo sát hiệu giá kháng thể gia cầm huyện Tân Uyên (18,02%), thấp Nguyễn Văn Bé Sáu (2010), đánh giá khả bảo hộ với bệnh Cúm H5N1 vịt chạy đồng tỉnh Tiền Giang thấp tác giả Trần Thị Trúc Linh (2009) khảo sát đàn vịt thịt nhỏ lẻ tỉnh Vĩnh Long 41,7% Kết cho thấy, loại vắcxin gà có đáp ứng mễn dịch cao hơn, phù hợp với quy trình tiêm phịng Trên gà đợt tiêm lần vịt đơt tiêm lần Kết bảo hộ vịt thấp không đạt yêu cầu (33,33%) ngun nhân sau: -Chăn ni hộ gia đình khơng khai báo chăn ni để tiêm phòng bổ xung, tiêm phòng lần, thời gian nuôi thịt ngắn, ngại ảnh hưởng tăng trọng sau tiêm phịng, nên người ni chủ quan khơng chấp hành qui trình tiêm phịng, ví nhiều ảnh hưởg đến chất lượng làm tỉ lệ bảo hộ thấp -Sai sót tiêm phịng, thiếu liều, kỹ thuật tiêm, qn lý chăm sóc vệ sinh phịng bệnh chưa tốt khả đáp ứng miễn dịch thấp vịt, trình bảo quản vắcxin 4.1.3.Tỉ lệ mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo quy mô chăn nuôi Kết kiểm tra mẫu huyết gia cầm trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3: Số mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo quy mô chăn nuôi Qui mô chăn nuôi Nhỏ lẻ Trang trại Tổng cộng Qua bảng 4.3 Số mẫu xét nghiệm 1223 1534 2757 cho thấy khác biệt Só mẫu bảo hộ Tỉ lệ % P 778 63,61 0,024 911 59,38 1689 61,26 qui mô chăn nuôi, tỉ lệ hộ nuôi nhỏ lẻ 63,61% chưa đạt yêu cầu, kết thấp tác giả Phạm Văn Diện (2009) tí 68,38% Kết trang trại 59,38% thấp hộ nuôi nhỏ lẻ thấp nhiều so tác giả Phạm Văn Diện (2009) tí 90,28% Kết có khác biết tỉ lệ khơng đủ bảo hộ nguyên nhân sau: Hộ chăn nuôi nhỏ lẻ vịt tiêm khơng qui trình, sai sót q trình kỹ thuật tiêm phịng, khơng đủ liều, khả đáp ứng miễn dịch, quản lý chăm sóc phịng trừ dịch bệnh, người tiêm phòng cộng tác viên ban Thú Y Trang trại hai hình thức chăn nuôi tư nhân công ty chăn nuôi Khả xảy sai sót trại ni tư nhân cao, họ khơng có chun mơn, chủ yếu kinh nghiệm, tiêm phịng cơng nhân chủ trại thực hiện, thời gian nuôi lại ngắn nên họ quan tâm cơng tác tiêm phịng, ngại tiêm phịng ảnh hưởng tăng trọng, cơng tác bảo quản sử dụng vắcxin 4.1.4.Tỉ lệ mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo hướng sản xuất Kết tổng hợp mẫu xét nghiệm theo hướng sản xuất có khả bảo hộ với virus Cúm H5N1 trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4: Số mẫu huyết gia cầm có kháng thể đủ bảo hộ với bệnh Cúm gia Cầm subtype H5N1 theo hướng sản xuất trứng thịt Hướng sản xuất Trứng Thịt Tổng cộng Số mẫu xét nghiệm 175 2582 2757 Só mẫu bảo hộ 163 1526 1689 Tỉ lệ % 93,14 59,10 61,26 P 0,031 Theo bảng 4.4 cho thấy Tỉ lệ theo hướng sản xuất trứng đạt cao 93.14%, cao hướng thịt 59,10% Trong có gà, vịt nhỏ lẻ, gà trại tư nhân công ty CP, mà gà tư nhân vịt nhỏ lẻ làm giảm tỉ lệ bảo hộ xuống thấp Nó kéo theo tỉ lệ bảo hộ chung theo hướng sản xuất thấp 61,26% , Không đạt yêu cầu bảo hộ Kết thấp tác giả Nguyễn Văn (2010) khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ gà trứng thương bến Cát Bình Dương 98,75%trên gà trứng 79,78 gà thịt Kết tổng hợp phân tích yếu tố ảnh hửơng đáp ứng miễn dịch Nhun nhân thiếu sót q trình tiêm phịng, chủ trang trại tự thực sai sót kĩ thuật tiêm phịng, cơng nhân thực tiêm phịng Trên vịt kĩ thuật bảo quản sử dụng vắcxin tiêm chưa đủ qui trình khả đáp ứng miển dịch ... giá tỷ lệ gà, vịt có khả bảo hộ với bệnh cúm gia cầm H5N1 sau tiêm phòng huyện Tân Un tỉnh Bình Dương CHÌ TIÊU THEO DÕI 3.4 Tỉ lệ mẫu huyết gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1. .. dõi tỉ lệ đàn gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ sau tiêm phòng vắcxin cúm gia cầm H5N1 Kết khảo sát cho thấy sau: Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thề đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N 1sau tiêm phòng vắccine... đủ bảo hộ theo hướng sản xuất - Tỉ lệ mẫu huyết có kháng thể đủ bảo hộ theo lần tiêm phịng 3.4 Tỉ lệ đàn gà, vịt có kháng thể đủ bảo hộ với virus Cúm gia cầm H5N1 - Tỉ lệ đàn có kháng thể đủ bảo