BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẶNG THỊ MAI LAN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ ĐỘC TỐ ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROTOXIN) CỦA VI KHUẨN Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus Ô NHIỄM TRONG THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC Chuyên ngành: Ký sinh trùng VSV học thú y Mã số: 62.64.01.04 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Thái Nguyên, năm 2017 Công trình hoàn thành tại: Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Xuân Bình PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh Phản biện 1:…………………………………………… …………………………………………… Phản biện 2:…………………………………………… …………………………………………… Phản biện Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận cấp Đại học Thái Nguyên họp tại: …………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… Vào hồi ngày Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia; - Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên; - Thư viện Trường Đại học Nông Lâm tháng năm DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Đặng Thị Mai Lan, Đỗ Hồng Anh, Nguyễn Thị Huê, Trần Phi Vương (2014), “Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus thịt lợn thành phố Thái Nguyên”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, Chuyên đề Nông lâm nghiệp trung du, miền núi phía Bắc, tháng 6/2014, tr 104 - 110 Nguyễn Thị Hoài Thu, Phạm Thùy Linh, Bùi Văn Ngọc, Đặng Thị Mai Lan, Nghiêm Ngọc Minh (2015), “Biểu tinh vùng định kháng nguyên Staphylococcus enterotoxin B (SEB) mã hóa đoạn gen seb phân lập từ chủng tụ cầu vàng Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 13 (2), tr 295 - 301 Đặng Xuân Bình, Đặng Thị Mai Lan, Nguyễn Thị Thu Huyền (2015), “Indentification and Characterrization of Staphylococcus aureus Bacteria In Fresh Pork At Public Markets In The North of Vietnam”, Research Journal of Animal and Veterinary Sciences, 8(2) Special 2015, pp 24 - 32 Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình (2016), “Xác định tỷ lệ nhiễm đặc tính sinh vật hóa học số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thịt lợn tươi bán chợ địa bàn tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXIII, số 6, tr 53 - 63 Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình (2016), “Xác định khả sản sinh độc tố đường ruột vi khuẩn Salmonella spp., Staphylococcus aureus phân lập thịt lợn tươi bán chợ số tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXIII, số 7, tr 46 - 53 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong năm gần đây, ngộ độc thực phẩm (NĐTP) xảy thường xuyên với số lượng vụ NĐTP lớn làm ảnh hưởng không nhỏ đến sức khoẻ người kinh tế người dân Nguyên nhân thức ăn không đảm bảo vệ sinh, nhiều tạp chất, chất hoá học… đặc biệt thức ăn nhiễm số loại vi khuẩn như: E coli, Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes… Xuất phát từ thực tiễn tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm độc tố đường ruột (enterotoxin) vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus ô nhiễm thịt lợn số tỉnh phía Bắc” * Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S aureus… nhiễm thịt lợn bán chợ tỉnh khu vực phía Bắc - Nghiên cứu xác định khả sản sinh độc tố đường ruột chủng vi khuẩn Salmonella spp S aureus phân lập * Ý nghĩa khoa học - Cung cấp tư liệu khoa học loài Salmonella spp trình tự gene độc tố enterotoxin type B S aureus phục vụ nghiên cứu nhằm phòng, chống hiệu NĐTP - Là sở khoa học từ đề xuất biện pháp khống chế ô nhiễm thịt lợn Salmonella spp S aureus gây * Ý nghĩa thực tiễn - Bổ sung tư liệu tình hình nhiễm khuẩn nói chung, ô nhiễm Listeria, Salmonella spp S aureus nói riêng thịt lợn - Bổ sung tư liệu độc lực khả sản sinh độc tố enterotoxin vi khuẩn Salmonella spp., S aureus giải trình tự gene sản sinh độc tố chúng * Điểm đề tài - Xác định khả sản sinh độc tố đường ruột vi khuẩn Salmonella spp., S aureus ô nhiễm thịt lợn - Đã nhân dòng xác định trình tự gene seb dạng tự nhiên kích thước 534 bp gene sản sinh độc tố enterotoxin Salmonella spp Đồng thời, nhân, biểu tinh thành công protein tổ hợp seb 534 dạng tự nhiên * Bố cục luận án Luận án gồm 154 trang chia thành chương, phần mở đầu: trang, chương 1: Tổng quan tài liệu 49 trang; chương 2: Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 19 trang; chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận 57 trang; Kết luận đề nghị trang; Danh mục công trình có liên quan đến luận án 01 trang; Tài liệu tham khảo 16 trang; Hình ảnh luận án trang, Phụ lục trang Luận án có 29 bảng, 22 hình, 152 tài liệu tham khảo (65 tài liệu tiếng Việt, 79 tài liệu tiếng nước ngoài, 08 tài liệu Internet) 12 ảnh màu cấu trúc từ ảnh điện di Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bộ Y tế (2008) tổng hợp số liệu thống kê Cục an toàn Vệ sinh thực phẩm vòng năm (2000 - 2007) cho thấy: Nước ta, xảy 1.616 vụ NĐTP làm 41.898 người mắc, 436 người tử vong có 178 vụ làm 4.036 người mắc tử vong người sử dụng thức ăn đường phố Trong nguyên nhân gây NĐTP nguyên nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao (43,20 %) Đặng Xuân Bình Dương Thùy Dung (2010) cho biết: Trong tổng số 136 mẫu thịt lợn tươi thu thập chợ khu vực Trung tâm thành phố Thái Nguyên từ 5/2009 - 4/2010 có tiêu tổng số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt chiếm 50 - 56 %; E coli chiếm 37,9 - 48,7 %; Salmonella spp chiếm 10 - 19,5 %; Bacillus cereus chiếm 27,5 - 31,7 %; S aureus chiếm 31,0 - 38,8 %; C perfringens chiếm 10 - 14 % Lê Huy Chính (2003) cho biết: vi khuẩn Listeria kháng thuốc kháng sinh, điều trị bệnh Listeria penicillin erythromycin cho kết tốt Tuy nhiên, số loại vi khuẩn kháng lại tetracycline như: Listeria 48,3 %; Salmonella spp 63,6 %; Yersinia spp 51,3 % (Jamali H cs., 2014) Trần Thị Xuân Mai cs (2011) thực kỹ thuật PCR đa mồi để phát Salmonella enteritica thực phẩm Kết nghiên cứu cho thấy cặp mồi invA đặc hiệu cho Salmonella spp cặp mồi spvC đặc hiệu cho S enteritica (gồm S typhimurium S enteritidis) phát triển thành công Theo Walter Chaim David A Eschenbach (2014) yếu tố độc lực Listeria monocytogenes bao gồm: listeriolysin O (LLO), protein ACTA, phospholipases, metalloprotease, protein P60, protease CLP ATPases Steven R G cs (2005) thành công việc giải trình tự gene dài 2809422 bp chủng Staphylococcus aureus COL Kết giải trình tự ghi nhận Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân CP000045 cho hệ gene plasmid Nghiêm Ngọc Minh cs (2011) lựa chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc số để tiến hành biểu protein tái tổ hợp seb nồng độ IPTG 0,1 mM; nhiệt độ 30oC thời gian cảm ứng Kết cho thấy protein seb biểu có khối lượng khoảng 28 kDa theo lý thuyết tính toán Hao D cs (2015) phát gene mã hóa độc tố tụ cầu vàng, gene chiếm ưu sec (38,5 %); seg (19,7 %); sej (16,2 %); see (12,8 %); sea (11,1 %) seb (10,3 %) Chương - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Thịt lợn tươi sống bán chợ Thái Nguyên, Hà Tây - Hà Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc - Vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S aureus 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 2.1.2.1 Địa điểm triển khai - Chợ Trung tâm tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây - Hà Nội, Vĩnh Phúc 2.1.2.2 Địa điểm xét nghiệm mẫu - Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên - Phòng Công nghệ sinh học môi trường Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2015 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Động vật thí nghiệm - Chuột bạch, có khối lượng 18 - 20g/con - Thỏ, có khối lượng - 2,5kg/con 2.2.2 Các loại môi trường sử dụng trình nghiên cứu - Môi trường thông thường đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập giám định vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S aureus: Nutrient Broth, Selenite Broth, XLD, TSI, BHI, Chapman, Fraser, Palcam,… loại đệm sử dụng nghiên cứu chuẩn bị theo Sambrook Russell (2001) theo hướng dẫn nhà sản xuất - Máy móc, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất khác: Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học sống - Đại học Thái Nguyên Công nghệ sinh học môi trường Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học cung cấp 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Xác định tỷ lệ nhiễm đặc tính sinh học vi khuẩn Listeria, Salmonella spp S aureus thịt lợn tươi bán chợ Trung tâm số tỉnh phía Bắc - Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S aureus thịt lợn bán chợ Trung tâm số tỉnh phía Bắc - Xác định đặc tính sinh hóa, độc lực, tính mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập - Xác định độc lực chủng vi khuẩn phân lập chuột thí nghiệm - Xác định tính mẫn cảm chủng vi khuẩn phân lập số loại kháng sinh 2.3.2 Xác định serovar chủng Salmonella spp phân lập bằng phương pháp ngưng kết nhanh phiến kính 2.3.3 Xác định khả sản sinh độc tố đường ruột vi khuẩn Salmonella spp S aureus bằng “Phản ứng khuếch tán da thỏ” 2.3.4 Xác định gene sản sinh độc tố enterotoxin vi khuẩn Salmonella spp S aureus phân lập - Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin vi khuẩn Salmonella spp S aureus phương pháp PCR - Đọc trình tự ADN máy đọc tự động phân tích kết phần mềm chuyên dụng - Biểu tinh gene seb vi khuẩn S aureus phân lập - Đề xuất biện pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm 2.4 Phương pháp nghiên cứu Để thực đề tài này, sử dụng phương pháp nghiên cứu thường quy định phòng thí nghiệm chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) tiêu chuẩn Quốc tế (ISO) 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu thịt lợn tươi lấy theo TCVN 4833 - : 2002, TCVN 4833 - : 2002, ISO 3100 - : 1991 2.4.2 Phương pháp xác định tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp S aureus nhiễm thịt lợn tươi Xác định tiêu vi khuẩn hiếu khí nhiễm thịt lợn tươi theo TCVN 7046 : 2002, vi khuẩn Salmonella spp theo TCVN 5153 : 1990, vi khuẩn Staphylococcus aureus theo TCVN 5156 : 1990; vi khuẩn Listeria theo TCVN 7700 - : 2007 2.4.3 Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn Nhuộm Gram nhằm xác định đặc điểm hình thái khả bắt màu vi khuẩn, quan sát hình thái, tính chất bắt màu vi khuẩn kính hiển vi với vật kính dầu (100) 2.4.4 Xác định đặc tính sinh hóa chủng Listeria, Salmonella spp S aureus phân lập Tiến hành giám định đặc tính vi sinh vật hóa học: kiểm tra hình thái, kích thước, tính chất bắt màu Gram, khả di động, phản ứng 11 Tây, Vĩnh Phúc Các chủng vi khuẩn phân lập chợ Trung tâm Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây Vĩnh Phúc xác định tỷ lệ nhiễm ký hiệu với Listeria từ L1 - L47 (13,13 %), Salmonella spp từ Sal1 - Sal41 (11,45 %) S aureus từ S1 - S275 (76,82 %) 3.3 Xác định tiêu vi khuẩn L monocytogenes, Salmonella spp., S aureus nhiễm thịt lợn bán chợ 3.3.1 Xác định tiêu vi khuẩn L monocytogenes nhiễm thịt lợn Tỷ lệ mẫu thịt lấy chợ nhiễm L monocytogenes chiếm từ 8,57 % đến 17,98 % Có từ 4,76 % đến 12,36 % mẫu không đạt TCVN Mức nhiễm cao từ 1,36 x 10 CFU/g - 4,91 x 105 CFU/g; mức thấp từ 2,73 x 104 CFU/g - 7,27 x 104 CFU/g 3.3.2 Xác định tiêu vi khuẩn Salmonella spp nhiễm thịt lợn Trong tổng số 358 mẫu thịt kiểm tra có 41 mẫu nhiễm Salmonella spp chiếm 11,45 % Trong đó, Thái Nguyên: mẫu thịt nhiễm Salmonella spp không đạt TCVN chiếm 11,43 %; Vĩnh Phúc 11,84 %; Bắc Giang 12,36% Hà Tây 10,23 % 3.3.3 Xác định tiêu vi khuẩn S aureus nhiễm thịt lợn Các mẫu thịt có tỷ lệ nhiễm S aureus chiếm từ 72,37 % đến 83,15 % Có từ 34,21 % đến 47,19 % mẫu thịt bị nhiễm S aureus không đạt TCVN Mức nhiễm cao từ 3,76 x 106 CFU/g - 5,31 x 106 CFU/g; mức thấp từ 1,05 x 106 CFU/g - 1,18 x 106 CFU/g 3.4 Xác định tiêu vi khuẩn L monocytogenes, Salmonella spp., S aureus nhiễm thịt lợn theo thời gian lấy mẫu sau bán hàng 12 3.4.1 Xác định tiêu vi khuẩn L monocytogenes thịt lợn theo thời gian lấy mẫu Tỷ lệ mẫu thịt lợn nhiễm L monocytogenes vào thời điểm lấy mẫu ngày có khác rõ rệt, tỷ lệ thịt lợn nhiễm L monocytogenes cao vào - chiều (7,54 %), sau thời điểm 10 - 11 trưa (4,19 %) thấp - sáng (1,40 %) 3.4.2 Xác định tiêu vi khuẩn Salmonella spp thịt lợn theo thời gian lấy mẫu Các mẫu thịt lấy vào buổi sáng sớm (6 - sáng) chợ phát có 4/358 mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella spp chiếm tỷ lệ 1,12 % Thời điểm 10 - 11 trưa tỷ lệ mẫu thịt nhiễm Salmonella spp tăng lên 3,63 % Đến cuối buổi chiều, (khoảng - chiều) tỷ lệ nhiễm lên tới 6,70 % 3.4.3 Xác định tiêu vi khuẩn S aureus nhiễm thịt lợn theo thời gian lấy mẫu Sau bán hàng từ - (6 - sáng) mẫu thịt thu thập từ chợ phát có 18/358 mẫu nhiễm vi khuẩn S aureus chiếm tỷ lệ 5,03 % Khoảng 10 - 11 trưa tỷ lệ mẫu thịt nhiễm S aureus tăng lên 28,49 % Đến cuối buổi chiều (khoảng - giờ) tỷ lệ nhiễm lên tới 43,30 % 3.5 Tỷ lệ cường độ nhiễm vi khuẩn L monocytogenes, Salmonella spp., S aureus nhiễm thịt lợn theo mùa 3.5.1 Tỷ lệ cường độ nhiễm vi khuẩn L monocytogenes, thịt lợn theo mùa Tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn L monocytogenes vào mùa Hè có 18/101 mẫu kiểm tra chiếm 17,82 % cao với cường độ nhiễm trung bình mẫu không đạt TCVN 1,80 x 10 CFU/g; sau đến mùa Xuân 12/80 mẫu kiểm tra chiếm 15,00 % với cường độ nhiễm trung bình mẫu không đạt TCVN 1,07 x 10 CFU/g 13 Mùa Thu mùa Đông có tỷ lệ thịt lợn nhiễm L monocytogenes thấp mùa Hè mùa Xuân, tỷ lệ dao động từ 9,09 % đến 10,26 % với cường độ nhiễm trung bình mẫu không đạt TCVN 1,07 x 105 CFU/g 3.5.2 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp thịt lợn theo mùa Đã phát có 19/101 mẫu thịt nhiễm vi khuẩn Salmonella spp vào mùa Hè chiếm 18,81 %; 8/99 mẫu nhiễm vào mùa Xuân chiếm 10,00 % Và hai mùa có tỷ lệ thịt nhiễm vi khuẩn Salmonella spp cao so với mùa Đông (7,69 %) mùa Thu (8,08 %) Tất mẫu dương tính với Salmonella spp không đạt TCVN 3.5.3 Tỷ lệ cường độ nhiễm vi khuẩn S aureus thịt lợn theo mùa Tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn S aureus vào mùa Hè 96/101 mẫu kiểm tra chiếm 95,05 % cao nhất, mùa Xuân 65/80 mẫu kiểm tra chiếm 81,25 % Mùa Thu mùa Đông có tỷ lệ thịt lợn nhiễm S aureus thấp mùa Hè mùa Xuân, tỷ lệ dao động từ 53,85 % đến 72,73 % Số mẫu không đạt TCVN mùa Hè 65,63 %; mùa Xuân 55,38 %; mùa Thu 44,44 % mùa Đông 40,48 % 3.6 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn L monocytogenes, Salmonella spp S aureus phân lập 3.6.1 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn L monocytogenes phân lập Các chủng vi khuẩn L monocytogenes phân lập bắt màu Gram (+) có tính di động, dương tính với phản ứng rhamnose, xylose catalase (100 %); âm tính với phản ứng oxidase khả lên men mannitol 89,36 % số chủng L monocytogenes dương tính gây dung huyết (β - hemolysis) 14 3.6.2 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập Các chủng vi khuẩn Salmonella spp vi khuẩn Gram (-), có khả lên men glucose, manitol, phản ứng catalase sản sinh H2S (100 %) Các chủng vi khuẩn không dung huyết, không lên men lactose Có 34/41 chủng có khả di động (82,93 %), 7/41 chủng khả di động (17,07 %) chứng tỏ Salmonella pollorum Salmonella gallinarum 3.6.3 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn S aureus phân lập Các chủng S aureus phân lập có đặc tính sinh học điển hình giống mô tả tài liệu kinh điển; bắt màu tím thuốc nhuộm Gram (+), có phản ứng lên men catalase dương tính, lên men sucrose dương tính, phản ứng sản sinh coagulase làm đông tụ huyết tương, hoàn nguyên nitrate thành nitrit (100 %); không lên men gatactose khả di động Phần lớn chủng S aureus có khả dung huyết (255/275 chủng) chiếm 92,73 % 3.7 Thử độc lực chủng vi khuẩn L monocytogenes, Salmonella spp S aureus phân lập chuột thí nghiệm 3.7.1 Kết thử độc lực chủng vi khuẩn L monocytogenes phân lập chuột thí nghiệm Có tới 100 % số chuột tiêm canh khuẩn L monocytogenes qua phúc xoang chết khoảng thời gian từ - 72 Từ 24 có 12/47 chủng 25 - 72 có 16/47 chủng gây chết 100 % chuột thí nghiệm Tổng chủng L monocytogenes đem thử độc lực gây chết 89,36 % chuột thí nghiệm Chuột chết mổ khám để kiểm tra bệnh tích đồng thời tiến hành phân lập lại vi khuẩn từ máu tim cho kết dương tính 100 % 15 3.7.2 Kết thử độc lực chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập chuột thí nghiệm Các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập xác định độc lực qua khả gây chết chuột thí nghiệm Có 26 chủng gây chết 100 % chuột thí nghiệm Trong đó, có 15 chủng gây chết 100 % chuột gây nhiễm vòng - 24 giờ, Các chủng lại gây chết chuột từ 25 - 72 Có tới 92,68 % chuột thí nghiệm đem thử độc lực với chủng Salmonella spp phân lập chết Điều chứng tỏ, độc lực chủng Salmonella spp phân lập mạnh 3.7.3 Kết thử độc lực chủng vi khuẩn S aureus phân lập chuột thí nghiệm Sau 48 tiêm canh khuẩn, chủng vi khuẩn S aureus gây chết tới 100 % chuột thí nghiệm thể độc lực mạnh Trong khoảng từ - 24 có 53 chủng gây chết 100 % chuột, đến 48 có tổng 117 chủng gây chết 100% chuột thí nghiệm Đây sở để xác định độc tố đường ruột S aureus phương pháp giải trình tự gene mã hoá cho protein độc tố đường ruột nhóm B (seb) chủng S aureus có độc lực mạnh chuột thí nghiệm 3.8 Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh chủng L monocytogenes, Salmonella spp S aureus phân lập 3.8.1 Kết kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh chủng L monocytogenes phân lập Các chủng vi khuẩn L monocytogenes phân lập có 47/47 chủng mẫn cảm với amoxicilline, erythrommycin, SMX/TMP (100 %); 61,70 % số chủng mẫn cảm trung bình với streptomycin; 53,19 % mẫn cảm với norfloxacin 38,30 % - 53,19 % chủng kháng lại streptomycin, clindamycin oxacill 16 3.8.2 Kết kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh chủng Salmonella spp phân lập Các chủng Salmonella spp mà phân lập thử nghiệm mẫn cảm với cephalexin, SMX/TMP, norfloxacin, enrofloxacin tỷ lệ từ 56,10 % - 73,17 % Các loại khác như: erythromycin, spectinomycin, lincomycin mẫn cảm trung bình với Salmonella spp tỷ lệ từ 51,22 % - 58,54 % Có số chủng Salmonella spp kháng với clindamycin, erythromycin, lincomycin (41,46 % - 56,10 %) kháng cao với oxacill (68,29 %) 3.8.3 Kết kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh chủng S aureus phân lập S aureus mẫn cảm với SMX/TMP, doxycycline, cephalexin, clindamycin norfloxacin tỷ lệ từ 50,18 % - 87,64 % Mẫn cảm trung bình với spectinomycin, penicillin, neomicin (52,36 % - 74,55 %) Tuy nhiên, S aureus lại kháng mạnh với oxacill (51,64 %) 3.9 Kết xác định khả sản sinh độc tố đường ruột vi khuẩn Salmonella S aureus “Phản ứng khuếch tán da thỏ” Bảng 3.24 Khả sản sinh độc tố đường ruột vi khuẩn Salmonella spp “Phản ứng khuếch tán da thỏ” Đợt thử Đợt Đợt Đợt Tính chung Số chủng thử 10 26 Số chủng Tỷ lệ sản sinh (%) độc tố 37,50 60,00 50,00 13 50,00 Số chủng Tỷ lệ không sản (%) sinh độc tố 62,50 40,00 50,00 13 50,00 Đã tiến hành thực “phản ứng khuếch tán da thỏ” 17 phát 50,00 % chủng vi khuẩn Salmonella spp sản sinh độc tố 50,00 % chủng không sản sinh độc tố Sau đó, sử dụng chủng sản sinh độc tố để xác định serovar tách chiết AND Bảng 3.25 Khả sản sinh độc tố đường ruột vi khuẩn S aureus “Phản ứng khuếch tán da thỏ” Đợt thử Đợt Đợt Đợt Tính chung Số chủng thử 33 46 38 117 Số chủng Tỷ lệ sản sinh (%) độc tố 14 42,42 23 50,00 17 44,74 54 46,15 Số chủng Tỷ lệ không sản (%) sinh độc tố 19 57,58 23 50,00 21 55,26 63 53,85 Tương tự vi khuẩn Salmonella spp., phát 46,15 % chủng vi khuẩn S aureus sản sinh độc tố 53,85 % chủng không sản sinh độc tố 3.10 Kết xác định serovar chủng Salmonella spp phân lập phương pháp ngưng kết nhanh phiến kính theo sơ đồ Kauffmann - White Bảng 3.26 Kết xác định serovar chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập type kháng thể chuẩn STT Ký hiệu mẫu O H1 H2 Serovar Sal A4 Ai 1, Typhimurium Sal A4 Ai 1, Typhimurium Sal A4 Ai 1, Typhimurium Sal A3, 10, 15 Cr Z6 Weltevreden Sal A4 Ai 1, Typhimurium 18 Sal 12 A4 Ai 1, Typhimurium Sal 17 O3, 10 e, h 1, Anatum Sa 24 A4 Ai 1, Typhimurium Sal 28 O3, 10 e, h 1, Anatum 10 Sal 35 A4 Ai 1, Typhimurium 11 Sal 36 A4 Ai 1, Typhimurium 12 Sal 38 O3, 10 e, h 1, Anatum 13 Sal 40 A3, 10, 15 Cr Z6 Weltevreden Kết thu từ bảng 3.26 cho thấy: Có 13 chủng Salmonella spp cho phản ứng dương tính, định loại serovar khác đó, có mẫu chủng Salmonella typhimurium (61,53 %); mẫu chủng Salmonella anatum (23,08 %) mẫu chủng Salmonella weltevreden (15,38 %) 3.11 Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin chủng Salmonella spp S aureus phân lập 3.11.1 Gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin vi khuẩn Salmonella spp 13 chủng vi khuẩn điện di, có chủng cho thấy ADN mang gene mã hóa sản sinh độc tố ruột rõ nét, vạch phụ kèm theo chủng nói trên, chạy PCR cho kết đặc hiệu vạch phụ kèm theo, kích thước khoảng 259 bp theo tính toán lý thuyết Các sản phẩm PCR làm xác định trình tự, kết qủa cho thấy phù hợp với gene sinh độc tố đường ruột Salmonella spp công bố ngân hàng gene Quốc tế 19 3.11.2 Gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin nhóm B vi khuẩn S aureus Đoạn gen (seb) mã hoá cho độc tố đường ruột chủng vi khuẩn khuếch đại phương pháp PCR Các sản phẩm sau kiểm tra điện di gel agarose cho thấy băng đặc hiệu, rõ vạch phụ kèm, có kích thước khoảng 534 bp, theo lý thuyết * Kết tinh sản phẩm PCR Kết tinh sản phẩm PCR cho thấy đoạn ADN có kích thước khoảng 534 bp theo lý thuyết thiết kế đáp ứng cho phản ứng gắn gene seb vào vector tách dòng pTZ57R/T * Phân lập gene wtSEB vào vector đọc trình tự vector biểu Kết giải trình tự gene seb vector tách dòng pJET1.2 cho thấy, gene seb chứa khoảng 534 nucleotide tương đồng 100 % so với gene seb mã số AB716349.1, DQ997828.1, AM158256.1, AY196689.1 ngân hàng gene Quốc tế; tương đồng 99 % so với gene seb mã số AB860415.1, CP007499.1 nhiều mã số khác ngân hàng gene Quốc tế * Kết xác định trình tự gene seb vector pJET1.2 Tiến hành giải trình tự gene seb vector pJET1.2 Đoạn gene seb chủng S aureus nghiên cứu xác định trình tự nucleotide máy đọc tự động ABI PRISMR 3100 Avant Genetic Analyzer Sau có trình tự, tiến hành so sánh mức độ tương đồng gene seb chủng S aureus nghiên cứu với kết công bố ngân hàng gene giới (NCBI) Kết đọc trình tự trình bày hình 3.7 sau: 20 ccagatgagt tgcacaaagc gagtaaattc actggtttga tggaaaatat gaaagttttg tatgatgata atcatgtatc agcaataaac gttaaatcta tagatcaatt tctatacttt gacttaatat attctattaa ggacactaag ttagggaatt atgataatgt tcgagtcgaa tttaaaaaca aagatttagc tgataaatac aaagataaat acgtagatgt gtttggagct aattattact atcaatgtta tttttctaaa 61 12 18 24 aaaacgaatg atattaattc acatcaaact 30 gacaaacgaa aaacttgtat gtatggtggt gtaactgagc ataatggaaa ccaattagat aaatatagaa gtattactgt tcgggtattt 36 gaagatggta aaaatttatt atcttttgac 42 gtacaaacta ataagaaaaa agtgactgct caagaattag attacctaac tcgtcactat 48 ttggtgaaaa ataaaaaact ctatgaattt aacaactcgc cttatgaaac ggga Hình 3.7: Trình tự gene seb 534 chủng S aureus Bảng 3.29: Độ tương đồng gene seb chủng S aureus nghiên cứu với số chủng vi khuẩn ngân hàng gene giới (NCBI) TT Tên trình tự gene tương đồng với gene seb Mã số Tỉ lệ 21 NCBI tương đồng S aureus DNA, pathogenicity island, strain: IVM10 AB716349.1 100 % S aureus strain F136 enterotoxin B precursor (seb) gene, partial cds DQ997828.1 100 % S aureus partial seb gene for staphylococcal enterotoxin B precursor (SEB) AM158256.1 100 % S aureus strain 339E enterotoxin seb variant gene, partial cds AY196689.1 100 % S aureus DNA, pathogenicity island SaPITokyo12413, complete sequence, strain: Tokyo12413 AB860415.1 99 % CP007499.1 99 % S.aureus strain 2395 USA500, complete genome Từ bảng 3.29, kết thu cho thấy: Mức độ tương đồng gene seb nhân từ chủng S aureus có mức tương đồng cao từ 99 % 100 % so với số chủng công bố ngân hàng gene giới (NCBI) * Thiết kế vector biểu Dòng tế bào tái tổ hợp mang gene seb tổng hợp protein ngoại lai có khối lượng theo tính toán lý thuyết Chúng tiến hành biểu wtSEB điều kiện khác nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian thu mẫu để cải thiện tính tan wtSEB thu lượng protein wtSEB tốt 22 * Khảo sát điều kiện biểu gene wtSEB Sau khảo sát, điều kiện tối ưu để cảm ứng biểu protein wtSEB chủng biểu BL21(DE3) nhiệt độ 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM, thời gian cảm ứng * Tinh protein wtSEB tái tổ hợp Qua khảo sát điều kiện trình tinh chế, protein tái tổ hợp wtSEB thu lại tốt dung dịch đệm có 400 mM imidazol, với nồng độ đo mg/ml lượng wtSEB tinh thu 100 ml môi trường nuôi cấy 10 mg Trên điện di gel SDS-PAGE, wtSEB sau tinh có băng đậm, với trọng lượng khoảng 22 kDa với kích thước tính toán lý thuyết Protein wtSEB sau tinh thẩm tích loại imidazol, loại urea hồi tính 3.12 Đề xuất số biện pháp phòng ngừa * Trong sản xuất - chăn nuôi Người sản xuất, chăn nuôi phải tuân thủ nghiêm ngặt quy định Nhà nước Sản xuất, chế biến, kinh doanh thịt sản phẩm từ thịt theo Pháp lệnh vệ sinh an toàn thực phẩm Khi sử dụng hóa chất, kháng sinh chăn nuôi phải loại, liều, lúc cách * Trong giết mổ Giết mổ gia súc cần phải có kiểm soát thú y, không giết mổ buôn bán thịt gia súc bị bệnh Phải vệ sinh khu vực giết mổ, có phân khu riêng biệt thân thịt, nội tạng chất thải Sử dụng nguồn nước đạt quy chuẩn để vệ sinh, chế biến thịt Người làm nghề giết mổ, người trực tiếp tiếp xúc với phân chất thải gia súc cần phải giữ vệ sinh cá nhân vệ sinh chế biến Phải trang bị kiến thức vệ sinh an toàn thực phẩm 23 * Trong vận chuyển Phương tiện vận chuyển phải chế tạo vật liệu không làm ô nhiễm thực phẩm Thực phẩm bao gói, bảo quản thực phẩm suốt trình vận chuyển, không vận chuyển hàng hóa độc hại… * Trong chế biến Nấu chín kỹ thực phẩm có nguồn gốc từ động vật nhiệt độ 74°C (165°F); giữ nhiệt độ tủ lạnh mức 4°C (40°F) thấp hơn; Thực phẩm hâm lại phải đảm bảo độ sôi, kéo dài 10 phút; thức ăn thừa sau sau nấu cần cho vào tủ lạnh Cất riêng thịt sống chưa nấu chín vào túi riêng tránh xa loại rau, củ, thực phẩm chế biến khác; Tránh dùng thịt rã đông nhiều lần từ tủ lạnh (dễ bị tái nhiễm vi khuẩn); Rửa tay, dao, thớt dụng cụ nhà bếp trước sau chế biến thực phẩm Đồng thời, thu gom chất thải bỏ từ nguyên liệu thực phẩm thức ăn thừa đảm bảo vệ sinh, tránh để ruồi nhặng, côn trùng xâm nhập phát triển; Tạo thói quen rửa tay trước chế biến thực phẩm sau tiểu tiện KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, rút kết luận sau: Thịt lợn bán chợ Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây Vĩnh Phúc nhiễm Listeria 13,13 % có từ 4,76 - 12,36 % mẫu thịt không đạt TCVN; 11,45 % mẫu thịt nhiễm vi khuẩn Salmonella spp không đạt TCVN; 76,82 % mẫu nhiễm S aureus có từ 34,21 - 47,19 % mẫu không đạt TCVN 24 Thịt lợn thu thập chợ lúc - sáng có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn thấp so với thời gian thu thập lúc 10 - 11 trưa - chiều; L monocytogenes nhiễm từ 1,40 - 7,54 %; Salmonella spp từ 1,12 - 6,70 %; S aureus 5,03 - 43,30 % Các mẫu nhiễm vào mùa Hè chiếm tỷ lệ cao vi khuẩn L monocytogenes 17,82 %; vi khuẩn Salmonella spp 13,50 %; S aureus 93,00 % Các mùa khác tỷ lệ dao động vi khuẩn L monocytogenes từ 9,09 - 15,00 %; Salmonella spp từ 7,69 - 10,00 %; S aureus 53,85 - 58,75 % Đã xác định chủng vi khuẩn L monocytogenes, Salmonella spp S aureus phân lập có đặc tính sinh vật, hóa học đặc trưng giống Các chủng vi khuẩn L monocytogenes phân lập mẫn cảm với amoxicilline, erythrommycin, SMX/TMP chiếm tỷ lệ 100 % Salmonella spp mẫn cảm với cephalexin, SMX/TMP, norfloxacin, enrofloxacin tỷ lệ từ 56,10 - 68,29 % S aureus mẫn cảm với SMX/TMP, doxycycline, cephalexin, clindamycin norfloxacin tỷ lệ từ 50,18 % - 87,64 % Tất chủng vi khuẩn kháng với oxacill mạnh với tỷ lệ 50 % Đã xác định chủng huyết Salmonella spp khác nhiễm thịt lợn bán chợ Trong đó, Salmonella typhimurium (61,54 %), Salmonella anatum (23,08 %) Salmonella weltevreden (15,38 %) Các chủng vi khuẩn Salmonella spp S aureus phân lập có độc lực mạnh, gây chết chuột thí nghiệm từ 92,68 - 100 % Đã xác định ADN mang gene mã hóa sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin chủng vi khuẩn Salmonella spp 27 chủng vi khuẩn S aureus Đã nhân dòng xác định trình tự gene seb dạng tự nhiên kích thước khoảng 534 bp vi khuẩn S aureus gene sản sinh độc tố ruột enterotoxin Salmonella spp 25 - Gene seb nhân từ chủng S aureus phân lập có mức tương đồng cao từ 99 % - 100 % so với gene seb S aureus công bố ngân hàng gene giới (NCBI) - Đã thiết kế biểu thành công protein wtSEB tái tổ hợp tế bào E coli BL21 (DE3) Hàm lượng protein tái tổ hợp tạo cao chủng nuôi cảm ứng 37 oC với nồng độ IPTG 0,5 mM; sau cảm ứng Protein tái tổ hợp wtSEB tinh thành công sắc ký cột lực Ni - NTA với lượng 10 mg/100 ml môi trường nuôi cấy Đã tinh thành công protein tái tổ hợp seb 534 dạng tự nhiên Đã đề xuất biện pháp dự phòng phòng chống ngộ độc thực phẩm Kiến nghị - Cần tiếp tục có nghiên cứu sâu rộng tình hình ô nhiễm vi khuẩn Salmonella spp Staphylococcus aureus thịt lợn đưa giải pháp khắc phục hiệu có - Áp dụng kết nghiên cứu để sản xuất kháng thể đơn dòng chế tạo Kit chẩn đoán nhanh nhằm phát độc tố vi khuẩn Salmonella spp và Staphylococcus aureus thực phẩm - Các quan thú y có thẩm quyền cần không ngừng nâng cao vai trò, tăng cường giám sát kiểm tra hoạt động sở giết mổ, quầy bán thịt để từ có biện pháp thiết thực để khống chế tình hình ô nhiễm vi khuẩn Salmonella spp Staphylococcus aureus - Tăng cường giáo dục cộng đồng, nâng cao ý thức người dân nhận thức nguồn thực phẩm tiêu dùng hàng ngày mức độ nguy hại bị ngộ độc vi khuẩn nói chung, vi khuẩn Salmonella spp Staphylococcus aureus nói riêng ... THỊ MAI LAN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ ĐỘC TỐ ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROTOXIN) CỦA VI KHUẨN Listeria, Salmonella spp. , Staphylococcus aureus Ô NHIỄM TRONG THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC Chuyên... Listeria, Salmonella spp. , Staphylococcus aureus ô nhiễm thịt lợn số tỉnh phía Bắc * Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. , S aureus nhiễm thịt lợn bán chợ tỉnh. .. Xác định tỷ lệ nhiễm đặc tính sinh học vi khuẩn Listeria, Salmonella spp S aureus thịt lợn tươi bán chợ Trung tâm số tỉnh phía Bắc - Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. , S aureus thịt