Header Page of 145 N N N UYỄN T Ị ỒN ƢƠN N T ÊN ỨU ẾT TÁ V XÁ ỊN N P ẦN OÁ TRON MỘT SỐ DỊ ẾT ỦA UỐ ỘT RỪN (MUSA ACUMINATA OLLA) Ở TÂY N UYÊN ữ M 60 44 01 14 TÓM TẮT LU N V N T N Footer Page of 145 S - Năm 2015 OA C Header Page of 145 ông trình hoàn thành IH N NG Người hướng dẫn khoa học: TS GIANG THỊ KIM LIÊN ƣ Phản biện 1: GS TS Phản biện 2: PGS TS T T X Luận văn bảo trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp ại học Nẵng vào ngày 19 tháng 12 năm 2015 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin – Học liệu, ại học Nẵng - hư viện trường ại học Sư phạm, ại học Nẵng Footer Page of 145 Header Page of 145 MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Y học dân gian Việt Nam từ lâu sử dụng nhiều thuốc cổ truyền hiệu từ loài cỏ xung quanh, song chất hóa học nguồn dược liệu mối liên quan cấu trúc hóa học tác dụng dược lý biết chưa biết Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học lý thuốc cần thiết ý nghĩa lĩnh vực tổng hợp, điều chế thuốc Tây Nguyên núi rừng tiếng với thuốc nam Trong đó, chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) biết đến loại thảo dược có chứa nhiều hoạt tính cao dùng làm thuốc phổ biến từ lâu y học cổ truyền kinh nghiệm dân gian Các phận chuối hột rừng có tác dụng chữa bệnh tốt bệnh táo bón, đau bụng, đau nhức xương, cao huyết áp, tiểu đường Bên cạnh đó, đồng bào địa phương rừng khát nước thường chặt chuối rừng, dùng lõi ăn sống ép lấy nước uống Người rừng thành thạo tìm tới đóng trại thung lũng có chuối rừng, nơi có nguồn nước tinh khiết nhiều mùa hè Với nhiều công dụng trên, chuối hột rừng nhà khoa học giới nghiên cứu sử dụng dạng tươi khô Một số nghiên cứu giới tìm nhiều chất chuối hột rừng có tính ứng dụng cao sống, nghiên cứu thành phần hóa học có chuối hột rừng Ở Việt Nam kết nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học chuối hột công bố, nhiên Footer Page of 145 Header Page of 145 nghiên cứu thành phần hóa học chuối hột rừng hạn chế, chủ yếu nghiên cứu tác dụng dược lý chuối hột rừng dựa vào kinh nghiệm dân gian Vì vậy, chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học số dịch chiết chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) Tây Nguyên” nhằm đóng góp thông tin khoa học thành phần hóa học loài ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Qủa chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) thu hái Tây Nguyên - Việt Nam MỤC TIÊU VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 3.1 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định số thông số hóa lý chuối hột rừng - Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo số hợp chất có chuối hột rừng - Phân lập số chất có chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) Tây Nguyên PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.1 Nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp, phân tích tư liệu nước đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, tác dụng dược lý chuối hột rừng - Tổng hợp tài liệu phương pháp nghiên cứu chiết tách xác định hợp chất thiên nhiên 4.2 Nghiên cứu thực nghiệm - Phương pháp lấy mẫu, thu hái xử lý mẫu - Phương pháp phân tích trọng lượng để xác định thông Footer Page of 145 Header Page of 145 số hóa lý (xác định độ ẩm nguyên liệu tươi) - Phương pháp phân hủy mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng tro - Phương pháp chiết: chiết soxhlet dung môi n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), dichloromethane - Phương pháp vật lý: phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để xác định hàm lượng kim loại nặng; phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối (GC-MS) nhằm xác định thành phần, định danh cấu tử dịch chiết - Phân lập số chất chuối hột rừng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, phương pháp kết tinh phân đoạn - Các phương pháp xác định cấu trúc số chất: kết hợp phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR): HMQC, HMBC phương pháp khác để xác định cấu trúc hợp chất phân lập BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN: Luận văn bao gồm trang, bảng, hình, ảnh, tài liệu tham khảo phụ lục Với: Phần mở đầu Chương – TỔNG QUAN Chương – CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tài liệu tham khảo Footer Page of 145 Header Page of 145 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 SƠ LƯỢC VỀ CHI MUSA- HỌ CHUỐI (MUSACEAE) 1.1.1 Vài nét họ chuối 1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chuối hột rừng 1.1.3 Giới thiệu số đặc điểm sống đời 1.1.4 Ứng dụng y học Việt Nam và giới 1.1.5 Nghiên cứu hoá học chi Musa 1.2 CƠ SỞ LÍ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 1.3 CƠ SỞ LÍ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ (AAS) 1.4 CƠ SỞ LÍ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC-MS) 1.5 KỸ THUẬT SẮC KÝ BẢN MỎNG 1.6 SẮC KÝ CỘT 1.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA MỘT HỢP CHẤT 1.8 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHƯƠNG CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT 2.1.1.Nguyên liệu Nguyên liệu nghiên cứu chuối hột rừng, thu hái Tây Nguyên vào tháng năm 2015 Quả chuối hột rừng sau thu hái rửa sạch, phơi, sấy khô xay nhỏ thành bột để sử dụng cho phần nghiên cứu Footer Page of 145 Header Page of 145 2.1.2 Hoá chất 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Hình 2.1 Sơ đồ điều chế cao chiết 2.3 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÍ 2.3.1 Xác định độ ẩm 2.3.2 Xác định hàm lượng tro 2.3.3 Xác định hàm lượng kim loại 2.4 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS Footer Page of 145 Header Page of 145 2.5 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT CÓ TRONG CAO ETHYL ACETATE CỦA CHUỐI HỘT RỪNG 2.5.1 Tạo cao chiết 2.5.2 Tiến hành chạy sắc ký mỏng 2.5.3 Tiến hành sắc ký cột 2.5.4 Chạy cột sắc ký phân đoạn CHRE6 2.6 THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 3.1.1 Độ ẩm Độ ẩm trung bình chuối hột rừng 13.711% 3.1.2 Hàm lượng tro Hàm lượng tro trung bình 5.276% 3.1.3 Xác định hàm lượng số kim loại Hàm lượng kim loại chuối hột rừng không gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người 3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Cao chiết phân đoạn ethyl acetate chuối hột rừng có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn kiểm định,với cao chiết phân đoạn nhexane hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn kiểm định 3.3 HIỆU SUẤT CHIẾT Dung môi methanol cho hiệu suất chiết cao Đây sở để lựa chọn dung môi methanol dung môi chiết cao tổng phương pháp chiết lỏng-lỏng để tiến hành phân lập Footer Page of 145 Header Page of 145 3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 3.4.1 Dịch chiết n-hexane phương pháp chiết soxhlet Bằng phương pháp GC, kết xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexane chuối hột rừng cho thấy: dịch chiết nhexane có cấu tử định danh, chủ yếu là: n- hexadecanoic acid, Beta.–Sitosterol, Cis-13-octadecenoic acid Các cấu tử lại có hàm lượng thấp hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh 3.4.2 Dịch chiết dichloromethane phương pháp chiết soxhlet Bằng phương pháp GC, kết xác định thành phần hóa học dịch chiết dichloromethane chuối hột rừng cho thấy: dịch chiết dichloromethane có 13 cấu tử định danh, chủ yếu là: n-hexadecanoic acid, 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, Beta.Sitosterol, Cis-13-Octadecenoic acid Các cấu tử lại có hàm lượng thấp hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh 3.4.3 Dịch chiết ethyl acetate phương pháp chiết soxhlet Bằng phương pháp GC, kết xác định thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate chuối hột rừng cho thấy: dịch chiết ethyl acetate có cấu tử định danh, chủ yếu là: nHexadecanoic acid, Beta.-Sitosterol, Phenol, 2-propyl-, Cis-13Octadecenoic acid Các cấu tử lại có hàm lượng thấp hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh Footer Page of 145 Header Page 10 of 145 3.4.4 Dịch chiết methanol phương pháp chiết soxhlet Bằng phương pháp GC kết xác định thành phần hóa học dịch chiết methanol chuối hột rừng cho thấy: dịch chiết methanol có cấu tử định danh, chủ yếu là: 2Furancarboxaldehyde, 5-(hydroxymethyl)-, 4H-Pyran-4-one, 2,3dihydro-3,5-dihydroxyl-6-methyl- Các cấu tử lại có hàm lượng thấp hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh 3.4.5 Dịch chiết n-hexane phương pháp chiết lỏng-lỏng Bằng phương pháp GC, kết xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexane chuối hột rừng cho thấy: dịch chiết nhexane có 17 cấu tử định danh, chủ yếu là: 9,12Octadecadienoic acid (z,z), Beta –Sitosterol, n-Hexadecanoic acid, 11-Octadecenoic acid Methyl ester Các cấu tử lại có hàm lượng thấp hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh 3.4.6 Dịch chiết ethyl acetate phương pháp chiết lỏnglỏng Bằng phương pháp GC kết xác định thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate chuối hột rừng cho thấy: dịch chiết ethyl acetate có 18 cấu tử định danh, chủ yếu là: Phenol, 3-ethyl-, 2-Furancarboxaldehyde, 5-(hydroxymethyl)-, 4HPyran-4-one, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxyl-6-methyl Các cấu tử lại có hàm lượng thấp hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh 3.4.7 Dịch chiết methanol phương pháp chiết lỏng-lỏng Bằng phương pháp GC kết xác định thành phần hóa học dịch chiết methanol chuối hột rừng cho thấy: dịch chiết methanol có cấu tử định danh, chủ yếu là: 2- Footer Page 10 of 145 Header Page 12 of 145 10  Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) Phổ 13C-NMR chất E1 cho thấy 14 tín hiệu carbon, tín hiệu nhóm –CH2 đặc trưng δ = 28.2ppm phía trường cao, tín hiệu nhóm –CH nhân thơm (vòng C), với độ chuyển dịch hóa học δ=114ppm (C5’, C3’) δ = 128 ppm (C6’, C2’) tương ứng với proton nói Các tín hiệu khoảng độ chuyển dịch từ 98.4 đến 130 ppm cho thấy tín hiệu nhóm –CH vòng thơm Hình 3.2 Phổ 13C-NMR (DMSO) chất E1 Các số liệu phổ chất E1 hoàn toàn tương ứng với phổ chất 2-(4-hydroxyphenyl) chroman-3,5,7-triol) phân lập từ loài Cycas beddomei Vị trí nhóm –CH2 vị trí C4 khẳng định tương tác qua liên kết C4 với proton H4 (1-2) phổ HSQC Footer Page 12 of 145 Header Page 13 of 145 11 Hình 3.3 Phổ HSQC-1 (DMSO) chất E1 Tương tự, vị trí proton nhóm –CH vòng A B vị trí 3, 2, thể qua tương tác trực tiếp C-H phổ HSQC Footer Page 13 of 145 Header Page 14 of 145 12 Hình 3.4 Phổ HSQC-2 (DMSO) chất E1 Vị trí nhóm –OH khẳng định nhờ tương tác phổ HMBC H4(1) với C9, C10 C3; tương tác H2 với C9, C1’, C6’ C2’; tương tác H6 với C10, C8 C7; tương tác H8 với C10, C7 C6 Từ việc phân tích liệu phổ chất E1 so sánh với tài liệu tham khảo cho phép khẳng định chất E1 2-(4hydroxyphenyl) chroman-3,5,7-triol Chất xác định có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm tốt Footer Page 14 of 145 Header Page 15 of 145 13 Công thức cấu tạo E1 là: 5' HO O OH 4' 6' 1' 3' 2' 10 OH OH 3.5.2 Số liệu phổ cấu trúc chất E2 Số liệu phổ 1H- NMR phổ 1H- NMR giãn rộng chất E2 cho thấy có 10 proton phân tử chất Số liệu phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu cacbon Các đặc trưng vạch phổ tương quan số nguyên tử C H phân tử E2 cho phép dự đoán E2 hợp chất no, vòng  Phổ 1H-NMR (MeOH, 500MHz) Phổ 1H-NMR chất cho thấy tín hiệu cụm tín hiệu 10 proton với nhóm CH3 đặc trưng δ = 2,01 ppm (3H) Hình 3.5 Phổ 1H-NMR (DMSO) chất E2 Footer Page 15 of 145 Header Page 16 of 145 14  Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) Phổ 13C-NMR chất E2 cho thấy tín hiệu carbon, tín hiệu nhóm –CH3 đặc trưng δ =20,79 ppm phía trường cao phù hợp với tín hiệu proton phổ 1H-NMR, tín hiệu carbon bậc nhóm –C=O carboxyl chuyển dịch phía trường thấp δ=170,54 ppm Hình 3.6 Phổ 13C-NMR (DMSO) chất E2 Các số liệu phổ chất E2 hoàn toàn tương ứng với phổ chất 2,3-dihydroxypropyl acetate công bố thư viện liệu phổ hợp chất thiên nhiên Vị trí nhóm nguyên tử –CH, –CH2 –CH3 khẳng định nhờ tương tác trực tiếp H-C phổ HSQC Tương tác H3 với C3; tương tác proton H1 với C1; tương tác H2 với C2 tương tác proton H1” với C1” Footer Page 16 of 145 Header Page 17 of 145 15 Hình 3.7 Phổ HSQC (DMSO) chất E2 Vị trí nhóm chức khẳng định nhờ tương tác qua nhiều liên kết H-C phổ HMBC Tương tác C1’ với proton H1” proton H1; tương tác H2’ với carbon C2, C1 C3; tương tác H3’ với C3; tương tác proton H1 với C2 C3; tương tác H3 với C2 C1 Footer Page 17 of 145 Header Page 18 of 145 16 Hình 3.8 Phổ HMBC (DMSO) chất E2 Từ việc phân tích liệu phổ chất E2 so sánh với tài liệu tham khảo cho phép khẳng định chất E2 2,3-dihydroxypropyl acetate Công thức cấu tạo E2 là: 3' 1'' H3C Footer Page 18 of 145 1' O O OH OH 2' Header Page 19 of 145 17 3.5.3 Các chất E3 E4 Dựa vào số liệu phổ 1H 13C-NMR, màu sắc hình dạng vệt sắc ký mỏng, khẳng định chất E3 E4 chất Để xác định xác cấu trúc hai chất cần bổ sung thêm nhiều số liệu khác phổ IR, MS, NMR chiều, nhiên điều kiện trang thiết bị thời gian thực nghiệm có hạn nên chưa đủ thông tin để xác định cấu trúc chất a Số liệu phổ chất E3 Hình 3.9 Phổ 1H-NMR (DMSO) chất E3 Footer Page 19 of 145 Header Page 20 of 145 18 Hình 3.10 Phổ 13C-NMR (DMSO) chất E3 Hình 3.11 Phổ HSQC (DMSO) chất E3 Footer Page 20 of 145 Header Page 21 of 145 19 Hình 3.12 Phổ HMBC (DMSO) chất E3 Footer Page 21 of 145 Header Page 22 of 145 20 b Số liệu phổ chất E4 Dựa vào số liệu phổ, hình ảnh sắc ký mỏng, khẳng định chất sạch.Tuy nhiên, thời gian thực nghiệm có hạn nên chưa xác định cấu trúc chất Hình 3.13 Phổ 1H-NMR (DMSO) chất E4 Hình 3.14 Phổ 13C-NMR (DMSO) chất E4 Footer Page 22 of 145 Header Page 23 of 145 21 Hình 3.15 Phổ HSQC (DMSO) chất E4 Footer Page 23 of 145 Header Page 24 of 145 22 Hình 3.16 Phổ HMBC (DMSO) chất E4 Footer Page 24 of 145 Header Page 25 of 145 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I Kết luận Đã xác định số tiêu hóa lí chuối hột rừng: - Độ ẩm: 13.711% - Hàm lượng tro: 5.276% - Hàm lượng kim loại Cu, Zn, Pb, Cd, Hg, As chuối hột rừng không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người Hoạt tính sinh học Cao chiết phân đoạn ethyl acetate chuối hột rừng có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn kiểm định,với cao chiết phân đoạn nhexane hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn kiểm định Bằng phương pháp GC-MS định danh 40 cấu tử Trong đó, phương pháp chiết soxhlet, định danh cấu tử dịch chiết n-hexane, 13 cấu tử dịch chiết dichloromethane, cấu tử dịch chiết ethyl acetate, cấu tử dịch chiết methanol Bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng, định danh 17 cấu tử dịch chiết n-hexane, 18 cấu tử dịch chiết ethyl acetate, cấu tử dịch chiết methanol Bốn hợp chất phân lập xác định cấu trúc từ cao chiết ethyl acetate chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla): - Chất E1: 2-(4-hydroxyphenyl) chroman-3,5,7-triol Chất xác định có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm tốt - Chất E2: 2,3-dihydroxypropyl acetate - Các chất E3 E4: xác định chất sạch, có số liệu đo phổ 1H 13C-NMR Footer Page 25 of 145 Header Page 26 of 145 24 II Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn, thông qua kết đề tài mong muốn đề tài phát triển rộng số vấn đề sau: Nghiên cứu sâu thành phần dịch chiết chuối hột rừng, phân lập xác định hợp chất hóa học chưa định danh chuối hột rừng Tiếp tục thử hoạt tính sinh học dịch chiết dichloromethane, MeOH chuối hột rừng nghiên cứu phận khác chuối hột rừng như: thân, Các kết nghiên cứu sở để tạo chế phẩm có hoạt tính độc tế bào, góp phần vào việc điều trị ung thư từ cao chiết EtOAc chuối hột rừng, loài trồng phổ biến Tây Nguyên Footer Page 26 of 145 ... PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHƯƠNG CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT 2.1.1 .Nguyên liệu Nguyên liệu nghiên cứu chuối hột rừng, thu hái Tây Nguyên vào tháng năm 2015... (MUSACEAE) 1.1.1 Vài nét họ chuối 1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chuối hột rừng 1.1.3 Giới thiệu số đặc điểm sống đời 1.1.4 Ứng dụng y học Việt Nam và giới 1.1.5 Nghiên cứu hoá học chi... chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) Tây Nguyên nhằm đóng góp thông tin khoa học thành phần hóa học loài ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Qủa chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) thu hái Tây Nguyên - Việt