VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ************************** CHU THỊ HOA TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA CHITINASE CỦA BACILLUS LICHENIFORMIS KNUC213 TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến-ngƣời thầy dìu dắt bƣớc đƣờng nghiên cứu khoa học, truyền đạt cho kiến thức, bảo tận tình có đóng góp mẻ, sâu sắc lĩnh vực nghiên cứu Đồng thời, thầy tạo điều kiện tốt thời gian điều kiện làm việc thực nghiên cứu luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Hiếu, KS Quách Ngọc Tùng tập thể cán Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên bảo kiến thức chuyên môn, góp ý cho luận văn tạo điều kiện tốt giúp học tập rèn luyện suốt trình thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiện cho suốt trình học tập hoàn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện mặt thời gian, động viên khích lệ trình học tập Bên cạnh đó, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời thân yêu thƣơng, ủng hộ, động viên giúp đỡ suốt trình học tập để có đƣợc kết nhƣ ngày hôm Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2012 Học viên Chu Thị Hoa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Kí hiệu Amp Ampicillin Bp Base pair CHI Chitinase DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleic triphotphate EDTA Ethylennediaminetetraacetic EtBr Ethidium Bromide GlcN N- glucosamine GlcNAc N- acetylglucosamine LB Môi trƣờng Luria Bertani OD Optical Density (mật độ quang) PCR Polymerase chain reaction rCHI Chitinase tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Đệm Tris – Acetate – EDTA TE Đệm Tris – EDTA YPD Môi trƣờng Yeast – Peptone – Dextrose YPDS Môi trƣờng Yeast – Peptone – Dextrose - Sorbitol Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Gen chi mã hóa chitinase từ chủng Bacillus licheniformis 1.2 3.1 Tình hình nghiên cứu chitinase giới 15 Đặc điểm nuôi cấy chủng vi khuẩn KNUC213 môi trƣờng thạch khác Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa chủng KNUC213 3.2 sử dụng kit API 50 CHB sau 48 nuôi cấy 37C Ảnh hƣởng nhiệt độ, nồng độ muối, pH đến khả 3.3 35 37 phát triển chủng B licheniformis KNUC213 Kết so sánh độ tƣơng đồng trình tự amino acid endochitinase từ B licheniformis KNUC213 (AEQ55312) 3.4 với trình tự amino acid chitinase tƣơng ứng từ 38 43 chủng B licheniformis khác đƣợc đăng ký GenBank 3.5 (NCBI) So sánh hoạt tính enzyme chitinase chủng nghiên cứu thời điểm khác 3.6 48 Ảnh hƣởng ion kim loại lên hoạt tính rCHI chủng nấm men P pastoris Y2 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHITIN 1.1.1 Cấu trúc hóa học chitin 1.1.2 Vai trò ứng dụng chitin 1.2 CHITINASE 1.2.1 Giới thiệu chitinase 1.2.2 Cơ chế thủy phân chitin 1.2.3.2 Dựa vào phản ứng phân cắt 1.2.3.3 Căn vào cấu trúc phân tử 1.2.4 Cấu trúc phân tử chitinase 1.2.5 Nguồn thu nhận chitinase 1.2.5.1 Chitinase từ thực vật 1.2.5.2 Chitinase từ động vật 10 1.2.5.3 Chitinase từ vi sinh vật 10 1.2.5.4 Chitinase từ vi sinh vật tái tổ hợp 11 1.2.6 Vai trò ứng dụng chitinase 12 1.2.7 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính chitinase 13 1.2.7.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 13 1.2.7.2 Ảnh hƣởng pH 14 1.2.7.3 Ảnh hƣởng ion kim loại 14 1.2.8 Tình hình nghiên cứu chitinase giới Việt Nam 15 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2.8.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 1.2.8.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 17 1.3 BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS 18 1.3.1 Đặc điểm hệ biểu P pastoris 18 1.3.2 Vector biểu pPICZA 20 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU 22 2.1.1 Các chủng sinh vật plasmid 22 2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 22 2.1.3 Các dung dịch sử dụng môi trƣờng nghiên cứu 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn KNUC213 24 2.2.2 Tách DNA tổng số vi khuẩn Bacillus licheniformis KNUC213 25 2.2.3 Khuếch đại gen chi mã hóa chitinase B licheniformis KNUC21325 2.2.4 Điện di DNA gel agarose 27 2.2.5 Tinh sản phẩm PCR 27 2.2.6 Cắt ghép nối gen 27 2.2.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli phƣơng pháp sốc nhiệt 28 2.2.8 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn 29 2.2.9 Giải trình tự gen chi 29 2.2.10 Thiết kế vector biểu gen chi P pastoris 30 2.2.11 Biến nạp vector tái tổ hợp vào P pastoris X33 phƣơng pháp xung điện 30 2.2.12 Biểu rCHI 31 2.2.13 Tách chiết enzyme ngoại bào 32 2.2.14 Điện di protein gel polyacrylamide-SDS 32 2.2.15 Xác định hoạt tính enzyme chitinase 32 2.2.16 Xác định đặc tính rCHI 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN KNUC213 36 3.1.1 Đặc điểm nuôi cấy 36 3.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào 37 3.1.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 37 3.2 TÁCH DÒNG GEN chi MÃ HÓA CHITINASE CỦA CHỦNG B licheniformis KNUC213 40 3.2.1 Tách DNA tổng số 40 3.2.2 Khuếch đại gen chi kỹ thuật PCR 40 3.2.3 Tách dòng gen chi vector pJET1.2/blunt 41 3.2.4 Giải phân tích trình tự gen chi B licheniformis KNUC213 43 3.3 BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B licheniformis KNUC213 TRONG P pastoris X33 45 3.3.1 Thiết kế vector biểu pPICZαA::chi 45 3.3.2 Tạo chủng P pastoris tái tổ hợp có khả biểu rCHI 46 3.3.3 Biểu rCHI chủng P pastoris Y2 48 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 51 3.4.2 Ảnh hƣởng pH 52 3.4.3 Ảnh hƣởng ion kim loại 54 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 Phụ lục 1: Sơ đồ cấu trúc plasmid pJET1.2/blunt 62 Phụ lục 2: Sơ đồ cấu trúc plasmid pPICZA 63 Phụ lục 3: Khả sử dụng nguồn cacbon chủng Bacillus licheniformis KNUC213 65 Phụ lục 4: Trình tự gen chi chủng Bacillus licheniformis KNUC213 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Chitin polyme sinh học không phân nhánh, đƣợc cấu thành từ đơn vị N-acetyl D-glucosamin (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1,4)-glucozit Chitin phổ biến, phân bố rộng rãi tự nhiên sau cellulose đóng vai trò polysaccharide cấu trúc sinh vật nhƣ: thành tế bào nấm, khung vỏ động vật chân đốt, vỏ loài giáp xác giun tròn Một phƣơng pháp chuyển hóa chitin tạo dẫn xuất mạch ngắn chitin-oligosaccharide có giá trị kinh tế ứng dụng cao, an toàn ngƣời môi trƣờng sử dụng enzyme chitinase Chitinase (EC 3.2.1.14) enzyme phân hủy chất chitin không hòa tan nƣớc thành sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan thông qua trình thủy phân liên kết β-(1,4)-glucozit Hiện nay, chitinase đƣợc ứng dụng chủ yếu sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl Dglucosamine Đây sản phẩm giá trị ứng dụng cao đƣợc sử dụng thực phẩm, nông nghiệp, y dƣợc, kháng nấm côn trùng Ngoài ra, chitinase đƣợc sử dụng nhƣ thuốc trừ sâu sinh học nông nghiệp nhờ khả phân hủy chitin cấu trúc thành tế bào nấm, côn trùng gây bệnh xử lý chất thải giàu chitin Theo công bố giới, chitinase thu nhận từ nhiều nhóm vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn (Serratia sp., Bacillus sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Alteromonas sp…), nấm sợi (Trichoderma sp., Gliocladium virens, Fusarium chlamydosporum, Trichothecium roseum, Stachybotry elegans, Talaromyces flavus,…), xạ khuẩn (Streptomyces griseus, Str plicatus, Str lydicus…) Tuy nhiên, chitinase thu nhận từ chủng tự nhiên thƣờng không ổn định, hoạt tính không cao, chứa nhiều loại chitinase khác (nhóm exochitinase endochitinase) ảnh hƣởng đến phổ sản phẩm thủy phân chitin nhƣ quy mô thu nhận ứng dụng chitinase nhằm tạo sản phẩm chuyển hóa chitin Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hiện nay, nhiều nhóm nghiên cứu giới nâng cao hiệu suất trình sản xuất chitinase cách tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp Cho đến gen chi mã hóa chitinase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác đƣợc biểu thành công nấm men, vi khuẩn; hệ thống biểu nấm men Pichia pastoris đƣợc sử dụng rộng rãi có đặc tính: nuôi cấy đơn giản, đạt sinh khối cao môi trƣờng khoáng rẻ tiền, dễ dàng nâng cấp quy mô sản xuất, dễ điều khiển hệ thống biểu enzyme nhờ trình cảm ứng Xuất phát từ tiềm ứng dụng chitinase ƣu điểm hệ thống biểu P pastoris, thực đề tài: ―Tách dòng biểu gene mã hóa chitinase B licheniformis KNUC213 Pichia pastoris‖ nhằm nâng cao trình sinh tổng hợp endochitinase có hoạt tính cao, tạo tiền đề cho sản xuất enzyme quy mô lớn Đề tài đƣợc thực phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam với nội dung sau: - Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase nhằm khai thác nguồn gen - Tách dòng phân tích trình tự gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis KNUC213 - Biểu gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis KNUC213 P pastoris X33 - Bƣớc đầu nghiên cứu số tính chất chitinase tái tổ hợp (rCHI) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHITIN 1.1.1 Cấu trúc hóa học chitin Chitin polyme sinh học không phân nhánh, cấu thành từ đơn vị N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1-4)-glycosyl (Hình 1.1) Chitin polymer sinh học phổ biến tự nhiên đứng sau cellulose (cấu trúc hóa học chitin gần giống với cellulose) đóng vai trò polysaccharide cấu trúc sinh vật nhƣ: thành tế bào nấm, khung vỏ động vật chân đốt, vỏ loài giáp xác giun tròn Trong cấu trúc chitin, nhóm (-OH) nguyên tử C2 đƣợc thay nhóm axetyl amino (-NHCOCH3) Liên kết β-(1-4)-glycosyl đơn phân cấu trúc chitin lệch góc 180o tạo nên mạch xoắn loại liên kết bền, dễ bị cắt đứt tác nhân có tính axit hay enzyme [7] Cấu tạo hóa học chitin đƣợc thể hình 1.1 Công thức phân tử chitin: (C8H13O5N)n, Khối lƣợng phân tử: (203,09)n với thành phần nguyên tố: C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91% Hình 1.1 Công thức cấu tạo hóa học chitin Các nghiên cứu nhiễu xạ sử dụng tia X cho thấy, chitin tồn dƣới ba dạng α-, β- γ-chitin khác xếp nhánh phân tử bên tinh thể chitin Trong α-chitin, nhánh đƣợc xếp theo hƣớng đối song (antiparallel), β-chitin gồm nhánh song song γ-chitin đƣợc hình thành từ hỗn hợp hai loại α-chitin β-chitin Trong ba loại α-chitin Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... thống biểu enzyme nhờ trình cảm ứng Xuất phát từ tiềm ứng dụng chitinase ƣu điểm hệ thống biểu P pastoris, thực đề tài: Tách dòng biểu gene mã hóa chitinase B licheniformis KNUC213 Pichia pastoris ... khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase nhằm khai thác nguồn gen - Tách dòng phân tích trình tự gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis KNUC213 - Biểu gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis. .. trình tự gen chi B licheniformis KNUC213 43 3.3 BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B licheniformis KNUC213 TRONG P pastoris X33 45 3.3.1 Thiết kế vector biểu pPICZαA::chi