VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -o0o VŨ ĐÌNH DUY ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI THÔNG ĐỎ BẮC (TAXUS CHINENSIS (PILG.) REHD.) ĐANG BỊ ĐE DỌA TRONG HỆ SINH THÁI RỪNG NHIỆT ĐỚI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 0114 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN MINH TÂM Hà Nội, 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng công bố tài liệu Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận văn Vũ Đình Duy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, quý trọng đến thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Minh Tâm Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán sở đào tạo sau Đại học Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật tận tâm truyền đạt kiến thức cho suốt khóa học Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Lãnh đạo phòng Phân loại thực nghiệm Đa dạng nguồn gen, bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho trình học tập, thực nghiên cứu hoàn thiện luận văn Để hoàn thành luận văn này, chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học; phòng Hệ thống học phân tử Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh; Ban lãnh đạo khu Bảo tồn vườn Quốc gia quyền địa phương tạo điều kiện cho thực đề tài Luận văn thực Dự án BVMT.VAST: “Bảo tồn sử dụng bền vững số loài thông quý có giá trị kinh tế cao bị đe dọa tuyệt chủng khu hệ nấm nội ký sinh có ích loài nghiên cứu” hỗ trợ học bổng Nagao – Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên Môi trường (CRES), Việt Nam Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình động viên, khích lệ chỗ dựa vững cho hoàn thành khóa luận Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Axit deoxyribonucleit (Deoxyribonucleic acid) ADN AFLP bp Đa hình độ dài đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) Cặp bazơ (base pair) Loài nguy cấp CR EDTA Genbank Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Ngân hàng gen quốc tế Trình tự lặp đơn giản ngẫu nhiên (interal simple sequence repeat) ISSR Maturase gen matK Phương pháp tiến hóa tối thiểu (Minimum Evolution Method) ME MEGA Phần mền phân tích di truyền tiến hóa phân tử Phương pháp tiết kiệm tối đa (Maximum Parasimony Method) MP Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (National Center for Biotechnology Information) Phương pháp kết nối liền kề (Neighbor Joining Method) NCBI NJ Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PCR RADP rbcL RFLP rpoC1 Đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA) Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit gen Đa hình độ dài đoạn DNA hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism) RNA polymerase C gen Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats) SSR UPGMA Phân tích Unweighted Pair Group Method Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Ánh sáng tử ngoại UV Loài nguy cấp VU Quần thể Bát Đại Sơn, Quản Bạ, Hà Giang Xuân Trường, Bảo Lạc, Cao Bằng Hang Kia, Mai Châu, Hòa Bình Hoàng Liên, Sa Pa, Lào Cai Thài Phìn Tùng, Đồng Văn, Hà Giang Mường Lựm, Yên Châu, Sơn La BDS BL HK HLS TPT YC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 2.1 Địa điểm số mẫu thu thập cho phân tích cpSSR 22 2.2 Danh sách loài Thông dùng xác định phân tích vị 23 trí phân loại 2.3 Trình tự nucleotide cặp mồi cpSSR 24 2.4 Các cặp mồi sử dụng để xác định vị trí phân loại 24 taxon 3.1 Cấu trúc tuổi quần thể loài Thông đỏ bắc 38 3.2 Đa dạng di truyền quần thể loài Thông đỏ bắc 42 3.3 Hệ số tương đồng di truyền (trên) khoảng cách di 44 truyền (dưới) theo Nei (1987) mức độ quần thể Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn loài loài Thông đỏ bắc 3.4 Phân tích AMOVA (khác mức độ phân tử) 46 loài Thông đỏ bắc 3.5 Thành phần bazơ (%) vùng gen rpoC1, rbcL, 52 matK 20 loài Thông Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Nội dung Hình Trang 1.1 Hình ảnh loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) 19 2.1 Bản đồ địa điểm nghiên cứu loài Thông đỏ bắc 24 3.1 Hình ảnh ADN tổng số đại diện loài Thông đỏ bắc 39 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR cặp mồi cpSSR gel 39 polyacrylamide 5% 3.3 Cấu trúc không gian alen quần thể nghiên cứu 41 3.4 Phân tích NJ sở khoảng cách di truyền quần 44 thể loài Thông đỏ bắc 3.5 Phân tích UPGMA sở khoảng cách di truyền từ 148 45 cá thể từ quần thể loài Thông đỏ bắc 3.6 Vị trí phân loại 14 loài Thông nghiên cứu theo phương 54 pháp NJ sở vùng gen matK 3.7 Vị trí phân loại 17 loài Thông nghiên cứu theo phương 55 pháp NJ sở vùng gen rbcL 3.8 Vị trí phân loại 14 loài Thông nghiên cứu theo phương 55 pháp NJ sở vùng gen rpoC1 3.9 Vị trí phân loại 14 loài Thông nghiên cứu theo phương pháp NJ sở kết hợp vùng gen rpoC1, matK rbcL Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cám ơn Những từ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU MỤC TIÊU VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm quần thể thực vật 1.2 Tính đa đa dạng di truyền quần thể thực vật 1.3 Ảnh hưởng phân cắt nơi sống đến đa dạng di truyền thực vật 1.4 Đa dạng di truyền quần thể nhỏ cô lập 1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường dùng nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 1.5.1 Kỹ thuật isozyme 1.5.2 Kỹ thuật RAPD 1.5.3 Kỹ thuật RFLP 1.5.4 Kỹ thuật AFLP 1.5.5 Kỹ thuật SSR 1.5.6 Kỹ thuật ISSR 1.6 Tình hình nghiên cứu nước nước đa dạng di truyền tiến hóa phân tử 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.7 Một số đặc điểm loài Thông đỏ bắc Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Địa điểm, thời gian phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 2.2.3 Phương pháp khảo sát thực địa 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm 2.2.4.1 Tách chiết ADN tổng số 2.2.4.2 Nhân ADN 2.2.4.3 Phân tích số liệu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Trang i ii iii iv v 3 4 5 7 9 10 11 11 16 18 20 20 23 23 24 24 24 24 25 26 27 3.1 Hiện trạng quần thể, loài Thông đỏ bắc 3.1.1 Phân bố loài Thông đỏ bắc 3.1.2 Cấu trúc nơi sống 3.1.3 Cấu trúc quần thể 3.2 Đa dạng di truyền quần thể loài 3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số điện di sản phẩm PCR 3.2.2 Đa dạng di truyền quần thể loài Thông đỏ bắc 3.2.3 Hệ số tương đồng di truyền khoảng cách di truyền 3.2.4 Phân bố không gian di truyền 3.2.5 Phân tích AMOVA 3.3 Mức độ tiến hóa phân tử số loài Thông KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 27 27 28 35 37 37 39 42 43 45 48 56 MỞ ĐẦU Loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.) thuộc chi Thông đỏ (Taxus), họ Thông đỏ (Taxaceae) loài quý có giá trị đặc biệt mặt y học sử dụng để sản xuất taxol (hợp chất chữa bệnh ung thư) [64], xây dựng nhà cửa, đóng đồ dùng gia đình, thủ công mỹ nghệ làm cảnh Các loài phân bố vùng núi đá vôi núi đất phía Bắc Việt Nam Theo tiêu chí IUCN 2010 [36] loài cần xếp vào bậc bị tuyệt chủng VU A2ac, B2ab (i-v), đưa vào Sách Đỏ Việt Nam với bậc bị tuyệt chủng VU A1a, c, B1+2b, c [2] Loài thuộc nhóm IIA: Thực vật rừng hạn chế khai thác, sử dụng mục đích thương mại nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/3/2006 quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, [3] Mặc dù, số quần thể chúng đối tượng bảo vệ số khu bảo tồn, chúng tình trạng bị đe doạ Các tác giả Thông đỏ bắc khoảng 250 cá thể, phân bố tản mạn, với kích thước quần thể nhỏ Thông đỏ bắc có mặt số địa điểm Quản Bạ, Đồng Văn (Hà Giang), Sapa (Lào Cai), Bảo Lạc (Cao Bằng), Yên Châu (Sơn La), Hang Kia - Pà Cò (Hoà Bình) Đã có số biện pháp bảo vệ loài với hình thức khác nhau, bảo vệ nguyên vị số khu bảo tồn chuyển vị (giâm hom) [7] Tuy nhiên, nhà quản lý nhà khoa học thiếu thông tin quan trọng đa dạng di truyền mức độ quần thể loài, đặc biệt yếu tố ảnh hưởng xấu đến tồn chúng liên quan đến tác động người Điều khó để nâng cao hiệu công tác bảo tồn sử dụng bền vững loài Thông nghiên cứu Để góp phần đưa giải pháp bảo tồn phục hồi loài việc đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Thông có ý nghĩa quan trọng Mức độ đa dạng di truyền khả tồn loài tương lại, mà tiềm tiến hoá loài Ngày nay, kỹ thuật công nghệ sinh học sử dụng rộng rãi, nhanh có hiệu việc đánh giá mức độ đa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... 1.1 Hình ảnh loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) 19 2.1 Bản đồ địa điểm nghiên cứu loài Thông đỏ bắc 24 3.1 Hình ảnh ADN tổng số đại di n loài Thông đỏ bắc 39 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR cặp... 28 35 37 37 39 42 43 45 48 56 MỞ ĐẦU Loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.) thuộc chi Thông đỏ (Taxus) , họ Thông đỏ (Taxaceae) loài quý có giá trị đặc biệt mặt y học sử dụng để sản... loài Thông đỏ bắc 3.1.1 Phân bố loài Thông đỏ bắc 3.1.2 Cấu trúc nơi sống 3.1.3 Cấu trúc quần thể 3.2 Đa dạng di truyền quần thể loài 3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số điện di sản phẩm PCR 3.2.2 Đa