BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… HOÀNG THỊ BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… HOÀNG THỊ BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Ngày nay, nhờ có mặt nhiều kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn mạnh nên góp phần giải nhiều bệnh nhiễm trùng mắc phải Tuy nhiên tỷ lệ đề kháng kháng sinh vi khuẩn ngày tăng cao (ở Mỹ: khoảng 70%) Theo ước tính Trung tâm kiểm soát bệnh (Centers for Disease Control - CDC) Mỹ, hàng năm Mỹ có khoảng 90 000 ca tử vong/ triệu ca mắc bệnh nhiễm trùng [1] Sự kháng thuốc nhiều loại vi khuẩn ngày gia tăng mối lo ngại mang tính toàn cầu Nhiều kháng sinh mà người tìm không công hiệu việc điều trị Nhiều kháng sinh xuất sử dụng thời gian ngắn bị kháng, việc nghiên cứu tìm loại kháng sinh thực thời gian ngắn, tìm loại kháng sinh điều trị vi khuẩn kháng kháng sinh Vì vậy, nhu cầu khẩn cấp cần có thuốc kháng vi sinh vật để kiểm soát bệnh cách có hiệu [2] Chính vậy, kháng sinh tổng hợp, kháng sinh bán tổng hợp, kháng sinh tự nhiên có mặt thị trường ngành công nghiệp dược phẩm tìm kiếm chất kháng vi sinh vật từ nguồn gốc khác vừa có hiệu lực cao, vừa có hoạt phổ rộng mà lại thân thiện với môi trường Các vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh với côn trùng (Entomopathogenic Nematodes - EPN) đối tượng nghiên cứu nhà khoa học khả diệt côn trùng gây hại khả sinh kháng sinh chúng có khả ngăn chặn vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết côn trùng vật chủ Nhiều nghiên cứu cho thấy sản phẩm trao đổi chất thứ cấp vi khuẩn cộng sinh có khả kháng vi sinh vật hoạt phổ rộng, ngăn chặn phát triển vi khuẩn, nấm tế bào ung thư [6,15] Việt Nam đất nước có vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ấm, mưa nhiều nên tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng có tính đa dạng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn cao Hiện nay, khoảng 40 chủng EPN phân lập từ vùng sinh thái khác Việt Nam [3,8] nguồn cung cấp vi khuẩn cộng sinh có ý nghĩa khoa học không Việt Nam mà có ý nghĩa giới việc nghiên cứu chất kháng sinh phục vụ cho người, động vật, thực vật Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu tuyến trùng có giá trị v có ý nghĩa khoa học xác định hình thái , đa dạng loài chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng sản phẩm trao đổi chất chúng Chính vậy, lựa chọn đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp.TĐ3 Tam Đảo, Vĩnh Phúc có khả kháng khuẩn, kháng nấm Với mục tiêu: - Phân lập vi khuẩn cộng sinh từ tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 Tam Đảo, Vĩnh Phúc - Thử nghiệm khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn phân lập - Xác định số ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn cộng sinh - Tách chiết hoạt chất thử khả kháng vi sinh vật kiểm định - Định loại vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 phương pháp sinh học phân tử sở phân tích đoạn gen 16S rDNA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng loài giun tròn (Nematodes) có ích, ký sinh số loài côn trùng có hại- làm suy yếu giết chết côn trùng này, lại an toàn người, động vật thực vật [3] Trong số hàng nghìn loài tuyến trùng ký sinh côn trùng có nhóm Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả vừa ký sinh vừa gây bệnh cho côn trùng, gồm giống Steinernema Heterorhabditis (giống Steinernema thuộc họ Steinernematidae Heterorhabditis thuộc họ Heterorhabditidae ngành giun tròn Mặc dù loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc giống Steinernema Heterorhabditis loài ký sinh bắt buộc côn trùng chúng lại có pha chuyên hóa tồn bên vật chủ côn trùng, (thường môi trường đất) Đó ấu trùng tuổi 3, gọi ấu trùng xâm nhiễm (infective juveniles - IJs), giai đoạn đặc biệt vòng đời phát triển nhóm tuyến trùng Ở giai đoạn này, IJs không cần dinh dưỡng chúng lại có khả tồn lâu dài môi trường đất, chưa gặp vật chủ Đây giai đoạn ấu trùng nằm chờ đất sẵn sàng xâm nhập vào vật chủ thích hợp để ký sinh, gây bệnh Khi tìm vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào thể côn trùng qua lỗ mở tự nhiên miệng, hậu môn lỗ thở số dạng IJs trang bị mấu kitin dạng sừng đục thủng thành thể côn trùng nơi xung yếu ranh giới đốt thể để xâm nhập Sau vào thể vật chủ, IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu, vi khuẩn cộng sinh giải phóng Nhờ môi trường thích hợp huyết tương vật chủ, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi khuẩn cộng sinh nhân nhanh số lượng tạo độc tố gây chết vật chủ vòng 24 -48h [3] 1.1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối đực cái, trứng thụ tinh tinh trùng đực Điều có nghĩa để sinh sản thể côn trùng vật chủ, tuyến trùng cần xâm nhập IJs đực IJs cái, để chúng phát triển thành đực trưởng thành, cho phép chúng có điều kiện ghép đôi vật chủ Ở giai đoạn đầu, đẻ trứng vào thể côn trùng trứng nở thành ấu trùng hệ Các ấu trùng hệ không phát tán mà lại bên xác chết thể vật chủ để dinh dưỡng mô côn trùng vật chủ phát triển nhanh chóng đạt đến giai đoạn trưởng thành hệ Trong trường hợp xác chết vật chủ nguồn thức ăn, hệ tiếp tục giao phối tiếp tục phát triển qua hệ 3, chí hệ bên thể vật chủ Cuối cùng, nguồn dinh dưỡng hết, hệ cuối xác chết côn trùng dừng lại pha ấu trùng tuổi Các ấu trùng bắt đầu chui khỏi xác chết côn trùng phát tán môi trường bên trở thành IJs (tuổi 3) từ chúng tiếp tục chu kỳ phát triển với côn trùng vật chủ 1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis Không giống với loài Steineinema, loài tuyến trùng Heterorhabditis, IJs xâm nhập vào thể côn trùng phát triển thành lưỡng tính (Hermaphroditis) Con có khả sản sinh tinh trùng với trứng tự thụ tinh để sinh sản Từ hệ trở sau, IJs phát triển thành trưởng thành phân tính đực sinh sản hình thức giao phối Giai đoạn đầu lưỡng tính phân tính, chúng đẻ trứng (oviparous) giai đoạn sau già chúng đẻ trứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thai (oviviparous); lúc ấu trùng nở bên thể mẹ sử dụng thể mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi 2, biến thành bọc chứa ấu trùng tuổi Khi phá vỡ thành thể mẹ chui trở thành ấu trùng cảm nhiễm (tuổi 3) chúng giữ lại vỏ cutin ấu trùng tuổi [3] 1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN Mỗi ấu trùng xâm nhiễm của tuyến trùng EPN (infective juveniles –IJs) mang ruột của chúng một loài vi khuẩn cộng sinh chuyên hóa chúng gây bệnh cho côn trùng xâm nhập vào máu Các nghiên cứu 20 năm qua từ tuyến trùng EPN cho thấy vi khuẩn Xenorhabdus cộng sinh ruột ấu trùng cảm nhiễm Steinernema, với loài giống Heterorhabditis vi khuẩn cộng sinh thuộc giống Photorhabdus [15] 1.2.1 Vi khuẩn Xenorhabdus Xenorhabdus trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hình que, kỵ khí không bắt buộc Chúng sinh trưởng nhiệt độ tối ưu 280C; số chủng có khả phát triển 400C Xenorhabdus khác với chi khác họ Enterobacteriaceae có kích thước tế bào lớn 0,3 – x – 10 μm Lên men đường glucose sinh acid (không sinh khí) số đường khác lên men Phản ứng catalase âm tính khả chuyển nitrat thành nitrit Đa số chủng có deoxyribonuclease (DNase) protease dương tính Xenorhabdus có mối quan hệ mật thiết với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng giống Steinernema có đặc tính miễn dịch Ở IJs loài Steinernema spp., VKCS nằm một cái bọc ở phần trước của ruột , phía sau thực quản Các tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có tính chuyên hóa cao: loại tuyến trùng tổ hợp với số Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn loài vi khuẩn, loài vi khuẩn tổ hợp với loài tuyến trùng định (bảng 1.1) [33] Bảng 1.1 Mối quan hệ tuyến trùng vi khuẩn cộng sinh TT EPN Steinernema abbasi S affine S apuliae S arenarium S bicornutum S carpocapsae S ceratophorum S cubanum S diaprepesi 10 S feltiae 11 S glaseri 12 S hermaphroditum 13 S intermedium 14 S karii 15 S kraussei 16 S kushidai 17 S longicaudum 18 S monticolum 19 S puertiricense 20 S rarum 21 S riobravis 22 S scapterisci 23 S scarabaei 24 S siamkayai 25 S thermophilum 26 S weiseri 27 Heterorhabditis bacteriophora 28 H megidis VKCS Flavimonas oryzihabitans X bovienii X kozodoii X kozodoii X budapestensis X nematophila X budapestensis X poinarii X doucetiae X bovienii X bovienii X griffiniae X bovienii X hominickii X bovienii X japonica X ehlershii X hominickii X romanii X szentirmaii X cabanillasii X innexi X koppenhoeferi X stockiae X indica X bovienii Photorhabdus luminescens P luminescens Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tài liệu tham khảo Elawad et al., 1998 Akhurst & Boemare, 1990 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Akhurst & Boemare, 1990 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Fischer-Le Saux et al., 1998 Akhurst & Boemare, 1990 Akhurst & Boemare, 1990 Tailliez et al., 2006 Poinar, 1990 Tailliez et al., 2006 Akhurst & Boemare, 1990 Nishimura et al., 1994 Tailliez et al., 2006 Fischer-Le Saux et al., 1998 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Fischer-Le Saux et al., 1998 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Somvanshi et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Poinar, 1990 Poinar et al., 1987 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.1 cho thấy X bovienii có quan hệ cộng sinh với loài Steinernema, X poinarii với loài, loài vi khuẩn Xenorhabdus khác có quan hệ cộng sinh với loài Steinernema Điều cho thấy tính chuyên hóa tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn có tính đa dạng cao 1.2.2 Vi khuẩn Photorhabdus Photorhabdus có kích thước 0,5 -2 x 1- 10 μm, Gram âm, không sinh bảo tử di động lông rung Hô hấp kị khí không bắt buộc, nhiệt độ tối ưu 280C; số chủng phát triển 37- 380C Photorhabdus có phản ứng catalase dương tính không khử nitrat (chủ yếu âm tính với số loài thuộc họ Enterobacteriaceae) Photorhabdus lên men glucose sinh axit, không sinh khí có khả lên men đường Fructose, D- mannose, maltose, ribose, N – acetylglucosamine sinh axit, lên men glycerol yếu IJs của các loài tuyến trùng Heterorhabditis spp., vi khuẩn cộng sinh nằm dải rác theo chiều dài của ruột , chủ yếu vẫn là ở nửa trước ống ruột Hầu hết loài vi khuẩn giống Photorhabdus có khả tạo sáng huỳnh quang sinh học [8] 1.2.3 Sự chuyển pha vi khuẩn cộng sinh Sự biến đổi pha đặc điểm phổ biến vi khuẩn, thay đổi đảo nghịch cho phép vi khuẩn tránh hàng rào miễn dịch côn trùng vật chủ nhiễm thực khuẩn thể Sự biến đổi pha xuất loài vi khuẩn giống Xenorhabdus Photorhabdus Sự biến đổi pha Xenorhabdus mô tả dị hình dạng khuẩn lạc môi trường agar, khuẩn lạc khác màu viền khuẩn lạc chúng [22,26,31] Sự biến đổi pha Xenorhabdus nghiên cứu đầy đủ X nematophilus xác định đặc trưng biến đổi pha Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn loài [19] Đặc trưng pha I nhuộm màu đường viền xanh (xanh bromothymol đỏ congo) sản sinh chất kháng sinh, lecithinese [26], thể vùi protein tua viền [16] Ở pha II đặc trưng pha I có biểu yếu Các tế bào pha I lớn đa hình pha II [26] Các nghiên cứu gần cho thấy vai trò pha I sản sinh chất kháng khuẩn, kháng nấm nhằm ức chế vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết côn trùng, hạn chế cạnh tranh chất dinh dưỡng, dành nguồn dinh dưỡng cho tuyến trùng Ngoài ra, cách thủy phân côn trùng hệ enzyme protease, lipase,… pha I có khả chuyển hóa chất thành sản phẩm phù hợp cho tuyến trùng tăng trưởng sinh sản Sự xuất hiện tượng vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng EPN mạnh mẽ cho thấy yếu tố quan trọng mối tương quan tuyến trùng, vi khuẩn côn trùng vật chủ Tuy nhiên, giai đoạn biến thể (pha II) chưa có nghiên cứu rõ ràng chức chúng tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn - côn trùng vật chủ [3] Pha I pha II trì dòng chủng kỹ thuật nhân dòng thông thường [16] 1.3 Mối quan hệ tương tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh Quan hệ cộng sinh mối quan hệ sinh thái phổ biến quần xã sinh vật sinh giới Nó đóng vai trò quan trọng việc hợp thành dạng sống Trái đất tạo đa dạng sinh học vô phong phú Tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh tương tác với nhau, bên thực nhiệm vụ, chức riêng để sinh tồn phát triển lại giúp bên để tồn tại, tổ hợp tách rời tồn độc lập môi trường tự nhiên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... lựa chọn đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp.TĐ3 Tam Đảo, Vĩnh Phúc có khả kháng khuẩn, kháng nấm Với mục tiêu: - Phân. .. TẠO VI N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… HOÀNG THỊ BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG... sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh với côn trùng (Entomopathogenic Nematodes - EPN) đối tượng nghiên cứu nhà khoa học khả diệt côn trùng gây hại khả sinh kháng sinh chúng có khả ngăn chặn vi sinh