BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Trương Ba Hùng NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BỔ SUNG NEO-POLYNUT Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Mở đầu Chương I: Tổng quan tài liệu Giới thiệu sơ lược beta – glucan 1.1 Tình hình nghiên cứu beta-glucan nước 1.2 Nguồn nguyên liệu chứa -glucan 1.3 Ứng dụng -glucan 1.3.1 Ứng dụng thực phẩm 1.3.2 Ứng dụng  -glucan y dược, mỹ phẩm 1.3.3 Ứng dụng nuôi trồng thủy sản Probiotics 2.1 Định nghĩa probiotics 2.2 Cơ chế tác động probiotics 2.2.1 Sinh tổng hợp chất kháng khuẩn 2.2.2 Cạnh tranh vị trí gắn kết 10 2.2.3 Cạnh tranh nguồn dinh dưỡng 11 2.2.4 Kích thích miễn dịch 11 2.3 Vi sinh vật probiotics 12 2.3.1 Vi khuẩn lactic 12 2.3.2 Bacillus spp 13 2.4 Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotics 14 2.5 Ứng dụng probiotics … 15 2.5.1 Trong thực phẩm dược phẩm 15 2.5.2 Nông nghiệp 19 2.5.2.1 Nuôi trồng thủy hải sản 19 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.5.2.2 Chăn nuôi 22 Chương II: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 27 2.1 Vật liệu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 Chương III: Kết 31 3.1 Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng saccharomyces cerevisiae 31 3.1.1 Lựa chọn môi trường tối ưu 31 3.1.2 Khảo sát điều kiện tăng trưởng tối ưu 32 3.2 Hoàn thiện lên men chủng probiotics bổ sung 35 3.2.1 Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng 35 3.2.1.1 Kết xác định đường cong sinh trưởng vi khuẩn l acidophilus hai môi trường MRS dịch chiết dứa tối ưu 35 3.2.1.2 Kết xác định thay đổi pH theo thời gian hai môi trường MRS dịch chiết dứa tối ưu 36 3.2.1.3 Kết xác định hàm lượng đường giảm theo thời gian hai môi trường lên men MRS dịch chiết dứa tối ưu 37 3.2.1.4 Kết so sánh khả ức chế vi sinh vật thị dịch nuôi cấy l acidophilus môi trường MRS dịch chiết dứa tối ưu 39 3.2.1.5 Nghiên cứu trạng thái nuôi cấy 42 3.2.2 Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng bacillus subtilis B1 43 3.2.2.1 Xác định đường cong sinh trưởng chủng bacillus subtilis B1 loại môi trường 43 3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình sinh trưởng vi khuẩn bacillus subtilis 46 3.2.3 Hoàn thiện công nghệ tách chiết thu hồi thành tế bào Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn từ sinh khối saccharomyces cerevisie 53 3.2.4 Hoàn thiện công nghệ tách beta-glucan từ thành tế bào làm nguyên liệu cho thực phẩm chức 54 3.2.5 Hoàn thiện công nghệ thủy phân nấm men thu hồi acid amin tự protein 55 3.2.5.1 Tách thu hồi protein từ dịch tế bào nấm men 56 3.2.5.2 Thủy phân protein tách axit amin tự 57 3.2.6 Hoàn thiện ổn định công nghệ sản xuất chế phẩm thức ăn bổ sung phục vụ chăn nuôi nuôi trồng thủy sản 58 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm chức cho chăn nuôi nuôi trồng thủy sản 62 Chương IV Kết luận 67 Tài liệu tham khảo 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Mật độ tế bào chủng nấm men S.cerevisae hai môi trường nghiên cứu Bảng 3.2: Ảnh hưởng pH ban đầu lên sinh khối S.cerevisiae1 sau 30 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng S cerevisiae1 Bảng 3.4: Mật độ tế bào chủng S.cerevisiae1 sau khoảng thời gian lên men Bảng 3.5: Các thông số tối ưu lên men thu hồi sinh khối chủng S.cerevisiae1 Bảng 3.6: Tính toán giá thành cho lít môi trường dịch chiết dứa tối ưu (2009) Bảng 3.7: Xác định mật độ L.acidophilus VN1 trạng thái nuôi khác Bảng 3.8 Mật độ chủng vi khuẩn nghiên cứu loại môi trường khác theo thời gian Bảng 3.9 Sinh khối chủng vi khuẩn nghiên cứu theo thời gian Bảng 3.10 Sinh khối chủng vi khuẩn nghiên cứu với nguồn cacbon khác Bảng 3.11 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng chủng vi khuẩn nghiên cứu Bảng 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng B.subtilis Bảng 3.13 Sinh khối chủng vi khuẩn nghiên cứu điều kiện pH ban đầu khác Bảng 3.14: Đánh giá phát triển B.subtilis B1 Bảng 3.15: Điều kiện lên men tối ưu cho chủng probiotics Bảng 3.16: Thực thu hồi sản xuất nguyên liệu bột probiotic Bảng 3.17: Hàm lượng protein hexose sản phẩm glucan tách chiết từ thành tế bào chủng nấm men nghiên cứu Bảng 3.18: Ảnh hưởng pH đến hàm lượng protein thu dịch thủy phân Bảng 3.19: Ảnh hưởng nhiệt độ trình thủy phân thu nhận axit amin Bảng 3.20: Thông số lên men chủng vi sinh vật probiotic Bảng 3.21: Đánh giá khả sấy phun Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.22: Công thức phối trộn cho 100 kg sản phẩm NEO-POLYNUT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 3.1: Mối tương quan pH ban đầu môi trường đến sinh khối chủng S.cerevisiae1 Hình 3.2: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng S cerevisiae1 Hình 3.3: Đường cong sinh trưởng S.cerevisiae1 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn đường công sinh trưởng vi khuẩn L acidophilus nuôi hai môi trường MRS dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn thay đổi pH theo thời gian hai môi trường lên men MRS dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ hàm lượng đường OD Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường tổng thay đổi theo thời gian lên men hai môi trường MRS dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.8: Môi trường dịch chiết dứa tối ưu không sinh H2O2 Hình 3.9 : Đồ thị biểu diễn khả ức chế vi sinh vật thị (E.coli) dịch nuôi cấy L acidophilus môi trường MRS dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.10 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis B1 MT1 Hình 3.11 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis B1 MT2 Hình 3.12 Biểu đồ biểu ảnh hưởng nguồn cacbon khác tới sinh khối B.subtilis B1 Hình 3.13 Biểu đồ biểu ảnh hưởng nguồn nitơ khác tới tích luỹ sinh khối Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Việc kết hợp chất có hoạt tính sinh học chủng probiotic công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ đời sống nói chung sản xuất nông nghiệp nói riêng hướng tích cực có tính khả quan Các chất có hoạt tính sinh học nhiều nhà khoa học giới nước quan tâm có polysaccharide Polysaccharide thành phần quan trọng phần lớn chất trùng hợp sinh học (biopolymer), chúng có vai trò việc tạo cấu trúc tính toàn vẹn vi khuẩn nấm (Bohn & Bemiller, 1995, Sakurai et al., 1996, Vetvika et al., 1997)  -glucan polysaccharide ý đặc tính sinh học có, hiệu mạnh việc củng cố hoạt động miễn dịch không đặc hiệu, có đặc điểm kháng khối u mạnh, có hiệu ứng kháng virut kháng khuẩn, cuối chúng giúp cho vết thương mau lành chống nhiễm sau bị thương sau phẫu thuật Bên cạnh việc sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cải thiện suất, thay kháng sinh , hóa dược nâng cao chất lượng sản phẩm chăn nuôi su hướng tất yếu nước khu vực giới (Hill, 1990; Charteris cs,1998; Chang cs, 2001) Trong nước có nghiên cứu sản xuất probiotic bổ sung vào thức ăn để giảm tiêu chảy, cải thiện khả tiêu hóa (Phạm Văn Toản,1996; Đỗ Trung Cứ cs, 2000; Phan Ngọc Kính, 2001; Nguyễn Như Pho Trần Thị Thu Thủy, 2003; Võ Thị Hạnh, 2003) Nhưng nghiên cứu bước đầu, chưa có hợp tác triệt để chuyên gia công nghệ vi sinh dinh dưỡng thức ăn để tạo sản phẩm có tính ổn định cao sử dụng hiệu cho vật nuôi [7] Hiện Việt nam việc kết hợp nhóm vi khuẩn probiotic -glucan để tạo chế phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi hướng nghiên cứu nhiều mẻ Do lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bổ sung NEO-POLYNUT”, nhằm hướng tới mục đích tạo chế Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn phẩm sinh học chức năng, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi giúp tăng khả chuyển hóa thức ăn, tăng cường hệ thống miễn dịch cho vật nuôi, hạn chế nguy gây bệnh, giảm chi phí chăn nuôi thông qua việc giảm hệ số tiêu thụ thức ăn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu sơ lƣợc Beta - Glucan 1.1 Tình hình nghiên cứu beta-glucan nƣớc Từ đầu năm 1970, số viện nghiên cứu Nhật Bản thử tách chiết -glucan từ nấm lớn trở thành hướng Nhật Bản Những năm gần đây, beta-glucan phân lập từ thành tế bào nấm men ngày ý Các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học khác tăng cường miễn dịch, kháng khối u tác nhân bảo vệ phóng xạ, kích thích hệ thống miễn dịch (Bohn & Bemiller 1995, Sakurai et al 1996, Vetvika et al 1997) Theo Paulsen et al (2001, 2003) sử dụng -glucan nấm men cho cá hồi Atlantic cá hồi cầu vồng làm tăng hoạt tính lysozym huyết chúng Khoa Công nghệ Sinh học, trường tổng hợp Hàn Quốc tách chiết glucan tan kiềm từ thành tế bào Sacchromyces cerevisiae chủng dại chủng đột biến có độ tinh cao (Ha et al.,2002) Thái Lan, Australia, beta-glucan chiết từ nấm men sử dụng chất kích thích miễn dịch tiềm cho Penaeus monodon Salmo salar L (Suphantharika et al., 2003, Paulsen et al., 2000) Ngoài ra, nhiều nước khác Nhật Bản, Mỹ, Canađa, Tiệp Khắc, Nga tiến hành nhiều nghiên cứu lĩnh vực phục vụ nuôi trồng thuỷ sản Trong giai đoạn 2004-2005 chương trình công nghệ sinh học, với tài trợ đề tài KC-04-28, lần Việt Nam, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học bắt tay nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết -glucan từ thành tế bào Sacchromyces cerevisiae, bước đầu thu sản phẩm có độ tinh khiết cao Sản phẩm beta-glucan từ chủng nấm men S.cerevisiae có loại mạch bêta-1,6 Sản phẩm beta - glucan từ chủng nấm men S.cerevisiae có hai loại mạch bêta-1,6 bêta1,3 Chế phẩm Bêta glucan từ chủng S.cerevisiae có 80% hexoza 0.99% protein Chế phẩm beta - glucan từ chủng S.cerevisiae S.cerevisiae có hàm lượng protein khoảng 1,2% 50% hexoza Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chế phẩm -glucan thử nghiệm chuột có tác dụng phục hồi số lượng tế bào bạch cầu máu ngoại vi khả thực bào đại thực bào ổ bụng động vật gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm chiếu xạ Chế phẩm  - glucan từ chủng S.cerevisiae có tác dụng tốt hệ thống miễn dịch không đặc hiệu nồng độ nghiên cứu Hiện nay, Liên hiệp Khoa học sản xuất Công nghệ sinh học Môi trường sử dụng beta - glucan chế phẩm Neo-Polynut phục vụ chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Chế phẩm Neo-Polynut Bộ thủy sản công nhận chất lượng cho phép sản xuất lưu hành 1.2 Nguồn nguyên liệu chứa -glucan Glucan thu từ nguồn khác như: thực vật, tế bào nấm men, nấm nói chung miêu tả polymer glucoza Glucan có số hoạt tính sinh học hoạt hóa hệ miễn dịch, chống ung thư, kích thích sinh trưởng -glucan tìm thấy nấm lớn có phân nhánh với phân tử glucoza tăng cường miễn dịch đến mức Bên cạnh đó, - glucan chiết từ thành tế bào nấm men bánh mỳ phân nhánh mạnh có khả tăng hoạt tính miễn dịch mạnh tất loại - glucan -1,3-D-Glucan chiết từ thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae đặt tên vào đầu năm 1960 nhóm nghiên cứu Mỹ (trường Tổng hợp Tulane, khoa Y học, chuyên ngành sinh lý học) -Glucan tách chiết từ chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrueckii, Candida albicans, Candida cloacae, Candida tropicalis, Hansenula henricii Đặc biệt - Glucan tách từ xác nấm men lên men bia với nồng độ Glucan lên tới 92% 1.3 Ứng dụng -glucan 1.3.1 Ứng dụng thực phẩm - Cung cấp nguồn xơ thực phẩm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... tạo chế phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi hướng nghiên cứu nhiều mẻ Do lựa chọn đề tài : Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bổ sung NEO-POLYNUT , nhằm hướng tới mục đích tạo chế. .. 3.2.6 Hoàn thiện ổn định công nghệ sản xuất chế phẩm thức ăn bổ sung phục vụ chăn nuôi nuôi trồng thủy sản 58 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm chức cho chăn nuôi nuôi trồng thủy sản. .. độ nghiên cứu Hiện nay, Liên hiệp Khoa học sản xuất Công nghệ sinh học Môi trường sử dụng beta - glucan chế phẩm Neo-Polynut phục vụ chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Chế phẩm Neo-Polynut Bộ thủy sản