ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TĂNG THỊ NGỌC MAI ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG, Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – Năm 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực Một số kết công bố TĂNG THỊ NGỌC MAI PGS TS Nguyễn Thị Tâm, phần lại chưa công bố công trình khác ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH Tác giả DÒNG VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG, Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Tăng Thị Ngọc Mai Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.46.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên – Năm 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực Một số kết công bố PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, phần lại chưa công bố công trình khác Tác giả Tăng Thị Ngọc Mai Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào vi sinh), KTV Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Di truyền - Sinh học đại) Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm, khoa Sau đại học, môn Sinh học phân tử Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN thầy cô giáo, cán khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Tăng Thị Ngọc Mai Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4D – Axit dichlorphenoxyacetic ADN Axit deoxyribo nucleic BAP – Benzyl amino purin bp Cặp base (base pair) cs Cộng cADN Sợi ADN bổ sung tổng hợp từ mARN nhờ enzym phiên mã ngược ĐC Đối chứng ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ EDTA Axit ethylen diamin tetra axetic kb Kilobase MS Môi trường Murashige Skoog mARN ARN thông tin NAA Axit α – naphthyl axetic (α – naphthyl acetic acid) PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase R0 Cây tái sinh từ mô sẹo R1 Thế hệ thứ tái sinh RAPD Random Amplified Polymorphic DNA - Phân tích đa hình ADN nhân ngẫu nhiên TAE Tris axetat EDTA TTC 2,3,5, Trichloterazolium- chlorid CTAB Cetyl trimetyl amoni bromua Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt iii Mục lục i Danh mục bảng iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lúa 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa 1.1.2 Giá trị kinh tế lúa 1.1.3 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 1.1.4 Đặc điểm sinh học lúa nước 1.2 Lạnh chế chịu lạnh 1.2.1 Khái niệm tính chịu lạnh thực vật 1.2.2 Tác động lạnh lên thực vật 1.2.3 Cơ chế chịu lạnh thực vật khả khắc phục 1.2.4 Tác hại lạnh tính chịu lạnh lúa 10 1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá nâng cao khả chống chịu trồng 11 1.3.1 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá khả chống chịu trồng mức độ mô - tế bào 11 1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả chống chịu trồng 12 1.4 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích hệ gen thực vật .14 1.4.1 Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) 14 1.4.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 14 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu .17 2.1.1 Vật liệu thực vật 17 2.1.2 Hoá chất thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 18 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 20 2.2.3 Phương pháp phân tích hoá sinh 21 2.2.4 Phương pháp phân tích sinh lý 23 2.2.5 Phương pháp sinh học phân tử 24 2.2.6 Xử lý kết tính toán số liệu 26 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết đánh giá khả chịu lạnh giống lúa 27 3.1.1 Khả chịu lạnh giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm 27 3.1.2 Khả chịu lạnh giống lúa giai đoạn mạ 33 3.1.3 Khả chịu lạnh giống lúa mức độ mô sẹo 37 3.2 Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh giống lúa nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro 45 3.2.1 Kết sàng lọc dòng tế bào chịu lạnh 45 3.2.2 Phân tích mức độ biến động di truyền quần thể R0 46 3.2.3 Kết phân tích đa hình ADN số dòng lúa nghiên cứu kỹ thuật RAPD .47 3.2.3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ lúa số dòng R1 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống XCH 48 3.2.3.2 Phân tích đa hình kỹ thuật RAPD 49 3.2.3.3 Mối quan hệ di truyền dòng lúa nghiên cứu 58 3.2.3.4 Kết luận phân tích đa hình ADN hệ gen dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống XCH kỹ thuật RAPD 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .61 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm giống lúa nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Trình tự nucleotit 10 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.1 Hàm lượng đường khử giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C 27 Bảng 3.2 Hoạt độ α - amylase giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C 30 Bảng 3.3 Tương quan hoạt độ α - amylase hàm lượng đường khử 32 Bảng 3.4 Tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại xử lý lạnh 40C± 0,50C 32 giai đoạn mạ giống nghiên cứu .34 Bảng 3.5 Hàm lượng diệp lục lúa sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C giai đoạn mạ giống lúa nghiên cứu 35 Bảng 3.6 Khả tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng khả tái sinh giống lúa 38 Bảng 3.7 Tỷ lệ sống sót mô sẹo sau xử lý lạnh 50C ± 0,50C nuôi phục hồi tuần 39 Bảng 3.8 Giá trị OD 485 nm mô sẹo giống lúa nghiên cứu .40 Bảng 3.9 Tốc độ sinh trưởng tương đối mô sẹo sau xử lý lạnh 41 Bảng 3.10 Khả tái sinh chồi mô sẹo sau xử lý lạnh 43 Bảng 3.11 Mức độ biến động số tiêu nông học quần thể R0 tái sinh từ mô sẹo chịu lạnh giống XCH .46 Bảng 3.12 Độ tinh hàm lượng ADN mẫu lúa nghiên cứu .48 Bảng 3.13 Tổng số phân đoạn ADN nhân mẫu lúa phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 49 Bảng 3.14 Phân tích đa hình phân đoạn ADN nhân với 10 mồi ngẫu nhiên mẫu lúa nghiên cứu .50 Bảng 3.15 Thống kê phân đoạn ADN nhân phản ứng RAPD với mồi ngẫu nhiên 57 Bảng 3.16 Hệ số đồng dạng di truyền dòng hệ R1 giống gốc XCH.58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 18 Hình 3.1 Hàm lượng đường khử giống lúa nghiên cứu giai đoạn nảy mầm xử lý lạnh 120C ± 0,50C 29 Hình 3.2 Hoạt độ α - amylase giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C 31 Hình 3.3 Tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại xử lý lạnh 40C± 0,50C giai đoạn mạ giống nghiên cứu 34 Hình 3.4 Hàm lượng diệp lục giống sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C 36 Hình 3.5 Tỷ lệ mô sẹo sống sót sau xử lý lạnh nuôi phục hồi .40 Hình 3.6 Tốc độ sinh trưởng tương đối mô sẹo sau xử lý lạnh 42 Hình 3.7 Khả tái sinh chồi mô sẹo sau xử lý lạnh .43 Hình 3.8 Một số hình ảnh nuôi cấy in vitro 45 Hình 3.9 Kết điện di ADN tổng số tách từ mẫu lúa giống XCH 48 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M2 51 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M4 52 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M7 53 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M8 54 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M10 55 Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 56 Hình 3.16 Sơ đồ so sánh dòng hệ R1 giống gốc XCH mức độ phân tử sử dụng mồi M2, M4, M7, M8, M10, M14 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lúa trồng thân thiết, lâu đời Việt Nam nhiều nước khác giới, đặc biệt nước châu Á Khoảng 40% dân số giới sử dụng lúa gạo làm nguồn lương thực Trên giới có 110 quốc gia sản xuất tiêu thụ gạo với mức độ khác Lượng lúa sản xuất mức tiêu thụ cao tập trung khu vực châu Á Ở Việt Nam, lúa trồng chiếm vị trí quan trọng kinh tế quốc dân Lúa gạo không nguồn cung cấp lương thực thiết yếu mà nguồn thu ngoại tệ đáng kể Theo số liệu thống kê năm 2010 Cục Trồng trọt, sản lượng lúa nước năm 2010 mức 39,9 triệu tấn, đó, tỉnh phía Nam chiếm 23,5 triệu tấn, riêng vùng đồng sông Cửu Long đạt sản lượng 21,5 triệu với suất bình quân 5,47 tấn/ha [55], [57], [58] Cây lúa (Oryza sativa L.) loại trồng mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Các yếu tố ngoại cảnh bất lợi thường xuyên tác động đến trình sinh trưởng phát triển lúa là: nhiệt độ cực đoan, hạn hán hay ngập úng, độ mặn, ánh sáng bất lợi… Một yếu tố nhiệt độ thấp Vùng núi phía Bắc, đồng sông Hồng Bắc Trung Bộ khu vực thường xuyên chịu ảnh hưởng lạnh nguyên nhân giảm suất lúa vùng Lúa vụ đông xuân chịu tác động mạnh nhiệt độ thấp Vì vậy, nghiên cứu khả chịu lạnh tăng cường khả chống chịu với nhiệt độ thấp nhằm nâng cao suất ổn định sản lượng giống lúa yêu cầu thiết thực tỉnh miền Bắc khu vục Bắc Trung Bộ [3], [4] Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật lĩnh vực nhằm cải tiến trồng, đặc biệt chọn dòng tế bào có khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi Đây hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng sử dụng tạo giống trồng có khả chống chịu cao thời gian ngắn so với phương pháp truyền thống [2] Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: ‘‘Đánh giá khả chịu lạnh tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH Tác giả DÒNG VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG, Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO. .. hại lạnh tính chịu lạnh lúa 10 1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá nâng cao khả chống chịu trồng 11 1.3.1 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh. .. giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm 27 3.1.2 Khả chịu lạnh giống lúa giai đoạn mạ 33 3.1.3 Khả chịu lạnh giống lúa mức độ mô sẹo 37 3.2 Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh giống lúa