B GIO DC V O TO VIN KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM VIN SINH THI V TI NGUYấN SINH VT NGUYN PHNG HOA NGHIấN CU THU NHN C T MIN DCH IMMUNOTOXIN NH HNG NG DNG IU TR UNG TH V BIU HIN KHNG NGUYấN HER2 LUN VN THC S KHOA HC H Ni - 2010 S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn VIN KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM VIN SINH THI V TI NGUYấN SINH VT Nguyn phng Hoa NGHIấN CU THU NHN C T MIấN DCH IMMUNOTOXIN NH HNG NG DNG IU TR UNG TH V BIU HIN KHNG NGUYấN HER2 Ngnh: Sinh hc Chuyờn ngnh: Sinh hc thc nghim Mó s: 60.42.30 LUN VN THC S KHOA HC Ngi hng dn khoa hc: PGS TS Lờ Quang Hun H Ni - 2010 S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn MC LC M U1 Chng 1- TNG QUAN TI LIU Khỏi niờm, phõn loi v ng dng ca immunotoxin.3 1.2 Tỡnh hỡnh ung th vỳ (UTV) trờn th gii v Vit Nam 1.2.1.Trờn th gii 1.2.2. Vit Nam 1.3 Gii thiu ung th vỳ5 1.3.1 Khỏi nim chung v bnh UTV 1.3.2 Nguyờn nhõn phỏt sinh ung th vỳ 1.3.3 Cỏc phng phỏp chn oỏn 1.3.4 Cỏc phng phỏp iu tr 1.4 Khỏng nguyờn Her2 c hiu t no ung th vỳ 10 1.4.1 Khỏi quỏt v khỏng nguyờn HER2 10 1.4.2 Cu trỳc HER2 11 1.4.2.1 Cu trỳc gen HER2 11 1.4.2.2 Cu trỳc protein HER2 11 1.4.2.3 S khuch i HER2 v c ch gõy ung th ca HER2.13 1.5 Khỏi quỏt chung v khỏng th - Khỏng th n dũng 16 1.5.1 Cu to chung ca khỏng th 16 1.5.2 Khỏng th n dũng 17 1.5.3 Khỏng th n chui - Mnh khỏng th 17 1.5.4 Mt s khỏng th n dũng s dng iu tr ung th vỳ 19 1.5.5 Khỏng th khỏng HER2 gn Melitin22 Chng 2- VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CUError! Bookmark not defined 2.1 Vt liu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Sinh phm 23 2.1.2 Hoỏ cht Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thit b Error! Bookmark not defined 2.2 Phng phỏp nghiờn cu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Phng phỏp PCR.24 2.2.2 Ct bng enzym gii hn 26 2.2.3 Phng phỏp thit k vector biu hin 26 2.2.4 Phng phỏp bin np 29 2.2.5 Phng phỏp biu hin protein tỏi t hp 30 2.2.6 Phng phỏp in di protein trờn gel polyacrylamide 31 2.2.7 Phng phỏp tớnh sch protein tỏi t hp bng ct ỏi lc Ni2+ 32 2.2.8 Phng phỏp phõn tớch ph 33 Chng 3- KT QU V THO LUN 36 3.1 Thit k vector biu hin pET-21A(+)mang gen mó hoỏ c t dch hermel 36 S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.1 Ct gen Hermel 36 3.1.2.Ct vector pET-21A(+) 36 3.1.3 Gn gen hermel vo vector pET-21A(+) v chn dũng plasmid tỏi t hp 38 3.1.4 Xỏc nh trỡnh t gen hermel Error! Bookmark not defined 3.2 Biu hin v ti u hoỏ biu hin gen hermel .Error! Bookmark not defined 3.2.1 Bin np plasmid tỏi t hp pET-21A(+) vo t bo E.coli BL21(DE3) .Er ror! Bookmark not defined 3.2.2 Biu hin gen mó hoỏ c t dch c hiu khỏng nguyờn HER2 t bo E coli BL 21(DE3) 45 3.3 Ngiờn cu iu kin biu hin gen mó hoỏ c t dch c hiu khỏng nguyờn HER2 E coli 46 3.3.1.nh hng ca pH lờn kh nng sinh tng hp c t dch herme 47 3.3.2 nh hng ca oxi lờn kh nng biu hin ca gen mó hoỏ c t dch c hiu khỏng nguyờn HER248 3.3.3 Kho sỏt nng khỏng sinh50 3.3.4 kho sỏt nhit nuụi cy Error! Bookmark not defined 3.3.5 nh hng ca IPTG.52 3.3.6 Kho sỏt thi gian thu mu54 3.3.7 Biu hin protein tỏi t hp hermel cỏc iu kin thớch hp ó la chn.55 3.4 Tinh sach protein tỏi t hp hermel, khng nh bng ph v xỏc inh hot tớnh 56 3.4.1 Tinh sch protein tỏi t hp HER2 56 3.4.2 Phõn tớch ph protein tỏi t hp.57 3.4.3 Xỏc inh hot tớnh ca protein hermel 59 Kt lun v kin ngh Error! Bookmark not defined Ti liu tham kho Error! Bookmark not defined S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn THUậT NGữ VIếT TắT Stt Ký hiu Tờn y ADN Axit Deoxyribonucleic Amp Ampicillin bp Base pair (cặp bazơ nitơ) ddNTP Dideoxynucleotide dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid PE Pseudomonas exotoxin EtBr Ethidium Bromide HRP Horseradish peroxidase 10 IPTG Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside 11 IR Inter-repeat region (miền lặp nội mạch bảo tồn) 12 Ka Kanamycin 13 kDa Kilo Dalton 14 LB Môi tr-ờng Lauria Betani 15 DT Diphtheria toxin 16 LRR Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine) 17 LTA Axit lipoteichoic 18 NASBA Nucleic acid sequence-based amplification (khuếch đại dựa trình tự axit nucleic) 19 OD Optical Density (Mật độ quang học) 20 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 21 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 22 TAE Tris - Acetate - EDTA 23 TE Tris - EDTA 24 utv ung th- vú 25 v/ph vòng/phút 26 X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- - D-galactopyranoside S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn -1- M U Cng hp c t dch (Immunotoxin - ITs) c xỏc nh l nhng cht gõy c cho t bo, c to git mt cỏch chn lc qun th t bo m ú cú biu hin nhng khỏng nguyờn hoc th th b mt c hiu Phõn t c t dch ITs cú tỏc dng nhn bit v lm tan t bo ung th vỳ biu hin quỏ mc HER2 mt yu t phỏt trin biu mụ biu hin mnh 25-30% bnh nhõn ung th vỳ ITs c to bng vic kt hp gia yu t : (1) cht gõy c (toxins) cú bn cht l protein v (2) tỏc nhõn hng ớch theo cỏc phng phỏp hoỏ hc (7) hoc bng cụng ngh ADN tỏi t hp HER2 l mt loi th th thuc h cỏc yu t phỏt trin biu mụ (Human Epidermal growth Receptor, EGFR), cú hot tớnh tyrosine kinase, úng vai trũ quan trng quỏ trỡnh sinh trng v bit hoỏ t bo Cho n cha tỡm thy ligand c hiu ca HER2; nhiờn nú cú th to dimer vi bn thõn nú hoc vi cỏc th th khỏc h hỡnh thnh ng th th (coreceptor) thỳc y cỏc ng truyn tớn hiu S khuch i gen HER2 trờn nhim sc th 17 dn n s tng biu hin th th HER2 trờn b mt t bo ung th vỳ Biu hin quỏ mc HER2 cú th bin i t bo thnh dng ỏc tớnh v lm tng quỏ trỡnh hỡnh thnh u Theo nhiu nghiờn cu gn õy, khong 25-30% bnh nhõn ung th vỳ cho thy cú s khuch i gen HER2 hoc biu hin quỏ mc gen ny cỏc t bo ung th Tớnh cht ny lm cho HER2 tr thnh mt ớch hu hiu chn oỏn sm cng nh ớch tn cụng ca liu phỏp iu tr dch S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn -2- Ung th vỳ hin ang l mt hai loi ung th chim t l cao nht cỏc bnh ung th n gii iu tr ung th vỳ cng nh nhiu loi ung th khỏc theo cỏc liu phỏp truyn thng nh hoỏ tr liu v x tr liu mc dự hiu qu tiờu dit u cao nhng li cú mt nhc im rt ln, ú l tỏc dng lờn c cỏc c quan bỡnh thng xung quanh (non-targeted effect) Mt khỏc, cỏc phng phỏp ny a phn ch ỏp dng i vi trng hp cỏc u ó phỏt trin v giai on mun nờn cú hiu qu iu tr thp Nhng nghiờn cu gn õy v cỏc marker sinh hc ung th vỳ ó m mt hng iu tr mi, thụng minh v y trin vng, liu phỏp iu tr tn cụng ớch (targeted therapy), cú th loi b gn nh hon ton nhc im ca cỏc liu phỏp truyn thng Mt s thuc cú bn cht khỏng th c hiu HER2 ó c FDA chp thun iu tr cho cỏc bnh nhõn ung th vỳ dng tớnh vi HER2 giai on cui l HERCEPTIN gúp phn nghiờn cu nhm to cỏc b kớt chn oỏn v cỏc loi thuc cú hiu qu iu tr cao i vi dng ung th vỳ dng tớnh vi HER2 chỳng tụi tin hnh ti: Nghiờn cu thu nhn c t dch immonotoxin nh hng ng dng iu tr ung th vỳ biu hin khỏng nguyờn Her2 S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn -3- Chng I TNG QUAN TI LIU Khỏi nim, phõn loi v ng dng Immunotoxin Nh ó núi trờn, cng hp c t dch (Immunụtxin-IT) c xỏc nh l nhng cht gõy c cho t bo, c to git mt cỏch chn lc qun th t bo m ú biu hin nhng khỏng nguyờn hoc receptor b mt c hiu Nhng c t dng ny ang c nghiờn cu v ch to khụng ch tr liu ung th (5), m cũn c th nghim trờn cỏc bnh khỏc nh GvHD (6), cỏc bnh t dch v AIDS (7) Immunotoxin c to bng vic kt hp gia hai yu t : cht gõy c (toxins) cú bn cht l protein v (2) tỏc nhõn hng dớch theo cỏc phng phỏp hoỏ hc (9) hoc cụng ngh ADN tỏi t hp (11) Cho ti cỏc toxin thng hay c dựng nht ch to ITs l cỏc protein t vi khun [pseudomonas exotoxin (PE) hay diptheria toxin (DT)] , hoc t thc vt [nhúm cỏc protein bt hot riboxom (RIPs) nh : Ricin, pokweet anti- viral protein (PAP) Saporin (SAP) ] C hai loi toxin ny tỏc ng lờn t bo theo c ch lm bt hot EP-2 (PE, DT) hay tỏc ng lờn im gn ca EP-2 (RIPs) trờn tiu phn riboxom 28S, lm c ch quỏ trỡnh sinh tng hp protein (17) Mc dự cỏc toxin k trờn cú hot tớnh cao v ch bng khụng n 10 phõn t cú th git cht mt t bo ớch, vic kt hp gia chỳng to ITs cũn mang li giỏ tr s dng cao hn nhiu.Cỏc kt qu nghiờn cu cng ó cho thy ITs to bi cỏc toxin k trờn cú kh nng c ch t bo ung th mnh v hiu qu hn t hng trm ti hng nghỡn ln cú tớnh hng ớch v tớnh chn lc c t Melitin l gỡ ? Melitin l mt loi protein hay chui axit amin, thu hỳt rt mnh i vi mng t bo nờn tip xỳc vi b mt t bo mc tiờu, nú nhanh S húa bi Trung tõm Hc Liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... iu tr cao i vi dng ung th vỳ dng tớnh vi HER2 chỳng tụi tin hnh ti: Nghiờn cu thu nhn c t dch immonotoxin nh hng ng dng iu tr ung th vỳ biu hin khỏng nguyờn Her2 S húa bi Trung tõm Hc Liu i... Mt s thuc cú bn cht khỏng th c hiu HER2 ó c FDA chp thun iu tr cho cỏc bnh nhõn ung th vỳ dng tớnh vi HER2 giai on cui l HERCEPTIN gúp phn nghiờn cu nhm to cỏc b kớt chn oỏn v cỏc loi thuc... no ung th vỳ 10 1.4.1 Khỏi quỏt v khỏng nguyờn HER2 10 1.4.2 Cu trỳc HER2 11 1.4.2.1 Cu trỳc gen HER2 11 1.4.2.2 Cu trỳc protein HER2 11 1.4.2.3 S khuch i HER2