ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - ĐỖ THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - ĐỖ THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Vi Thị Đoan Chính Thái Nguyên, 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục kí hiệu, viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình vẽ viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.3 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN 1.2.1 Phƣơng pháp phân loại truyền thống 1.2.2 Phƣơng pháp phân loại dựa vào thị phân tử gene 16S rRNA 1.3 SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12 1.3.1 Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh 12 1.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 13 1.3.3 Tách chiết chất kháng sinh 15 1.4 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 16 1.4.1 Vi nấm nguyên nhân chủ yếu gây bệnh hại trồng 16 1.4.2 Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật 17 1.5 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƢỜNG .19 iii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.5.1 Tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme 19 1.5.2 Một số enzyme chủ yếu ứng dụng bảo vệ môi trƣờng 20 Chƣơng : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .23 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 23 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MÔI TRƢỜNG 23 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 24 2.2.3 Môi trƣờng nghiên cứu 24 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 26 2.3.2 Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào 26 2.3.3 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh 27 2.3.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme 28 2.3.5 Phƣơng pháp xác định khả chịu nhiệt enzyme 28 2.3.6 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học xạ khuẩn 28 2.3.7 Phƣơng pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA 30 2.3.8 Nghiên cứu bƣớc đầu trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh 33 2.3.9 Phƣơng pháp tách chiết chất kháng sinh 33 2.3.10 Xác định ảnh hƣởng dịch nuôi cấy đến khả nảy mầm hạt 34 2.3.11 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 Chƣơng : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 3.1 SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN 35 3.1.1 Sự phân bố xạ khuẩn đất 35 iv Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.2 Tính đa dạng sinh học xạ khuẩn .36 Hoạt tính kháng sinh chọn lọc chủng xạ khuẩn có HTKS cao 37 3.2.1 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập 37 3.2.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao 41 3.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 44 3.3.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn HT 17.8 HT19.1 44 3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy 45 3.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 46 3.3.4 Phân loại chủng xạ khuẩn HT17.8 HT19.1 .51 3.4 NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẤT KHÁNG SINH CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 59 3.4.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh .59 3.4.2 Tách chiết xác định số tính chất chất kháng sinh chủng HT17.8 62 3.5 TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH ENZYME 64 3.5.1 Hoạt tính enzyme xạ khuẩn 64 3.5.2 Khả chịu nhiệt enzyme 66 3.6 BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CKS TRONG DỊCH NUÔI CẤY CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT 68 KẾT LUẬN .71 KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 v Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Hàng năm, giới vi nấm gây bệnh thực vật nhƣ đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng… gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm tới 83% số bệnh trồng [15] Theo thống kê Tổ chức Nông Lƣơng Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại nông nghiệp bệnh vi nấm lên tới 11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp giới [46].Trong đó, việc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật từ lâu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sức khỏe ngƣời, làm cân sinh thái gây ô nhiễm môi trƣờng Chính vậy, việc sử dụng loại VSV đối kháng, chất sinh học diệt khuẩn vào vùng sinh thái khác trồng đích mà nhà khoa học hƣớng đến, xạ khuẩn sinh kháng sinh đối tƣợng trung tâm tìm kiếm [22] Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ (Prokaryote) với số lƣợng loài lớn phân bố nhiều vùng sinh thái khác Chúng ngày đƣợc biết đến rộng rãi với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá trị sử dụng cao nhƣ CKS, chất chống ung thƣ, chất kích thích sinh trƣởng nhiều hợp chất y dƣợc khác Thêm vào đó, XK khả sinh enzyme ngoại bào nên đƣợc sử dụng rộng rãi làm chế phẩm sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng công nghệ xử lý rác thải [9], [18] Thái Nguyên tỉnh giàu tiềm nông, lâm nghiệp nên có khu hệ VSV phong phú, số có không loài XK sinh CKS Mặt khác, Thái Nguyên lại nằm vùng sinh khoáng, có nhiều loại hình khoáng sản phân bố tập trung Điển hình khu vực núi Pháo thuộc xã Hà Thƣợng, huyện Đại Từ khu vực thị trấn Trại Cau thuộc huyện Đồng Hỷ, nơi diễn hoạt động khai thác khoáng sản mạnh mẽ Các hoạt động khai thác khoáng sản có tác động đáng kể đến môi trƣờng đất, nƣớc qua đó, ảnh hƣởng đến hệ VSV Trên thực tế có nghiên cứu ảnh hƣởng hoạt động khai khoáng tới phát triển đa dạng hệ động, thực vật nhƣng lại chƣa có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nghiên cứu ảnh hƣởng hoạt động tới phân bố hoạt tính sinh học đến hệ VSV đất khu vực Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đặt nhƣ trên, nhƣ để góp phần khai thác nguồn VSV vô phong phú Thái Nguyên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đa dạng sinh học số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân lập Thái Nguyên định hướng ứng dụng” Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát phân bố, đặc điểm hình thái XK mẫu đất thu địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu hoạt tính sinh học chủng XK phân lập đƣợc để từ tuyển chọn số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế, đặc biệt công tác bảo vệ thực vật môi trƣờng Nội dung nghiên cứu - Lấy mẫu, phân lập khiết XK từ mẫu đất - Kiểm tra HTKS chủng phân lập đƣợc với VSV kiểm định để tuyển chọn chủng có HTKS cao - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa phân loại số chủng XK có hoạt tính kháng nấm đƣợc tuyển chọn - Nghiên cứu khả sinh tổng hợp CKS chủng XK lựa chọn - Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào nghiên cứu tuyển chọn số chủng có hoạt tính enzyme cao, có nhiều triển vọng ứng dụng thực tiễn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên Theo hệ thống phân loại nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn G (+) XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) siêu giới nhân sơ (Prokaryota) Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi khoảng 1.000 loài Trong có 478 loài thuộc chi Streptomyces 500 loài thuộc chi lại đƣợc xếp vào nhóm XK [58], [5] Tên xạ khuẩn – Actinomycetes – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) “mykes” (nấm) ban đầu XK đƣợc coi vi nấm chúng sinh trƣởng giống với nấm Tuy nhiên, đến nay, XK đƣợc chứng minh thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có tỷ lệ G+C cao (>55%) DNA [60] Xạ khuẩn nhóm VSV đa dạng đa số sinh trƣởng hiếu khí, hoại sinh phân bố rộng rãi đất, nƣớc, không khí, xác thực vật Nhƣng chủ yếu XK phân bố nhiều đất Số lƣợng XK đất không phụ thuộc vào thành phần, tính chất đất mà phụ thuộc vào độ ẩm, mức độ canh tác khả che phủ thảm thực vật Xạ khuẩn phân bố nhiều lớp đất đất tơi, xốp, có độ ẩm thích hợp, giàu chất hữu chất khoáng Số lƣợng XK đạt tới 9.800.000 – 80.000.000 CFU gam đất [33] Sự phân bố XK đất phụ thuộc nhiều vào pH đất Xạ khuẩn phân bố nhiều loại đất trung tính kiềm yếu axit yếu, có pH khoảng 6,8 – 7,5 Trong lớp đất kiềm hay axit gặp XK gặp lớp đất có độ kiềm mạnh Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30ºC pH trung tính điều kiện tối ƣu cho XK phát triển Mặc dù vậy, nhiều loài XK đƣợc phân lập môi trƣờng khắc nghiệt ví dụ nhƣ loài Arthrobacter ardleyensis ƣa lạnh đƣợc phân lập từ trầm tích hồ Nam cực sống nhiệt độ 0ºC [27] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn loài Nocardiopis alkaliphila đƣợc phân lập từ đất sa mạc Ai Cập sống pH 9,5 - 10 [32] Xạ khuẩn nhóm VSV đóng vai trò quan trọng tự nhiên Chúng tham gia tích cực vào trình chuyển hóa nhiều hợp chất hữu phức tạp đất mà nhiều VSV khác không hấp thu đƣợc Các XK chi Streptomyces đặc biệt nhiều đất nơi chúng phân hủy hoại sinh nhiều hợp chất hữu enzyme ngoại bào Chúng phân hủy sử dụng chất hữu khó phân hủy nhƣ axit humic đất [5] Nhiều chủng XK có khả hòa tan lignin cách sinh enzyme thủy phân cellulase, hemicellulase ngoại bào có ý nghĩa quan trọng công nghiệp bảo vệ môi trƣờng Thực tế, mùi mốc đặc trƣng nhiều loại đất liên quan đến sản sinh hợp chất hữu dễ bay có tên geosmin [57], [25], [44] 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái Đặc điểm bật XK có hệ khuẩn ty (mycelium) phát triển, phân nhánh vách ngăn Đƣờng kính khuẩn ty thay đổi khoảng từ 0,2 µm – µm, chiều dài đạt tới vài cm Kích thƣớc khối lƣợng khuẩn ty thƣờng không ổn định phụ thuộc vào loại điều kiện nuôi cấy Theo ISP, màu sắc KTKS chủng XK đƣợc chia thành nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, nhóm màu không xác định (X) [5], [40] Khi nuôi cấy môi trƣờng dịch thể, XK tạo thành dạng bông, già tạo thành kết tủa lắng xuống đáy, phần kết tủa bao gồm hạt liti, sản phẩm phân hủy màng nguyên sinh chất vách tế bào [19] Khi nuôi cấy môi trƣờng đặc khuẩn ty XK phát triển thành loại Một loại cắm sâu vào môi trƣờng gọi hệ sợi chất (khuẩn ty chất - substrate mycelium) với chức chủ yếu dinh dƣỡng Một loại phát triển bề mặt thạch gọi hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức chủ yếu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn sinh sản [41] Nhiều loại XK, KTKS phát triển theo hình phóng xạ, tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm Bản chất tƣợng chƣa đƣợc giải thích cách thỏa đáng [19] Sau thời gian phát triển, đỉnh KTKS xuất cuống sinh bào tử – quan sinh sản đặc trƣng XK Trên CSBT mang từ 30 ÷ 100 bào tử, mang tới 200 bào tử, nhƣng có mang bào tử hai bào tử CSBT đặc điểm quan trọng để phân loại XK Tuy nhiên nhiều trƣờng hợp, đặc điểm không đƣợc ổn định mà thay đổi theo môi trƣờng nuôi cấy Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thƣờng có hình trụ, hình ovan, hình cầu, hình que với kích thƣớc trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm Bề mặt bào tử XK nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like Nhìn chung, loài, hình dạng bào tử XK tƣơng đối ổn định, xem đặc điểm quan trọng để phân loại XK [47] Hình thái khuẩn lạc XK khác nhau, kích thƣớc hình dạng chúng thay đổi phụ thuộc vào môi trƣờng điều kiện nuôi Khuẩn lạc thƣờng có đƣờng kính 0,5 ÷ mm, nhƣng có khuẩn lạc có đƣờng kính đạt tới cm lớn Khuẩn lạc XK thƣờng rắn chắc, không trơn ƣớt hay suốt nhƣ vi khuẩn hay nấm men mà thƣờng có dạng thô ráp, xù xì, có dạng vôi với nhiều màu sắc khác có nếp tỏa theo hình phóng xạ 1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa XK thuộc nhóm sinh vật dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu, axit hữu cơ, lipit, protein nhiều hợp chất hữu khác để làm nguồn cacbon, sử dụng muối nitrat, muối amôn, urê, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiên khả hấp thụ chất không giống loài hay chủng khác Phần lớn XK nhóm VSV hiếu khí, ƣa ấm, số ƣa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng 25 - 300C Tuy nhiên, nhiệt độ tối ƣu cho sinh tổng hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - ĐỖ THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG... đa dạng sinh học số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân lập Thái Nguyên định hướng ứng dụng Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát phân bố, đặc điểm hình thái XK mẫu đất thu địa điểm nghiên cứu. .. xử lý số liệu 34 Chƣơng : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 3.1 SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN 35 3.1.1 Sự phân bố xạ khuẩn đất 35 iv Số hóa Trung tâm Học liệu