i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - PHAN THỊ HOÀNG HẢO NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS NCVC Chu Hoàng Hà Thái Nguyên, Năm 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu nhóm cộng nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thực từ tháng tới tháng năm 2010 Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2010 Học viên ký tên Phan Thị Hoàng Hảo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Trước hết xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS NCVC Chu Hoàng Hà, TS Nguyễn Hữu Cường, TS Phạm Bích Ngọc phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn dìu dắt trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nghiêm Ngọc Minh cho phép tham gia thực đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát nhanh ngộ độc thực phẩm độc tố tụ cầu vàng” Trong trình nghiên cứu vừa qua, nhận giúp đỡ bảo tận tình TS Lê Văn Sơn, TS Lâm Đại Nhân, CN Hoàng Hà, Ths Lê Thu Ngọc cán phòng Công nghệ tế bào thực vật bạn sinh viên phòng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Trường Viện Bên cạnh đó, xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để hoàn thành luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn! Phan Thị Hoàng Hảo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm Saphylococcus aureus độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B giới Việt Nam 1.1.1 Khái quát bệnh ngộ độc thực phẩm 1.1.2 Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm Saphylococcus aureus độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B giới Việt Nam 1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 1.2.1 Đặc điểm phân loại 1.2.2 Đặc điểm vi khuẩn học 1.2.2.1 Hình dạng kích thƣớc 1.2.2.2 Độc tố khả gây bệnh 1.2.3 Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 10 1.3 Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B 10 1.3.1 Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 1.3.2 Cơ chế gây độc staphylococcal enterotoxin B 12 1.3.3 Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp tiềm ứng dụng 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 16 2.1.1 Chủng vi khuẩn plasmid 16 2.1.2 Các kít 16 2.1.3 Hóa chất, máy móc thiết bị 16 2.1.4 Môi trƣờng đệm 17 2.1.5 Cặp mồi sử dụng 17 2.1.6 Phần mềm 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 17 2.2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.2.1 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 18 2.2.2.2 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 20 2.2.2.3 Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế 20 2.2.2.4 Phƣơng pháp tinh ADN từ gel agarose 22 2.2.2.5 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector 23 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi 2.2.2.6 Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α 24 2.2.2.7 Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α 24 2.2.2.8 Biểu protein staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 26 2.2.2.9 Phƣơng pháp điện di protein gel polyacrylamide 26 2.2.2.10 Phƣơng pháp tinh protein 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu 29 3.1.1 Thiết kế mồi 30 3.1.2 Kết PCR nhân gen seb 31 3.1.3 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le gen seb 32 3.2 Kết thiết kế vector biểu pET21a+ mang gen seb đột biến 34 3.2.1 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le pET21a+ 34 3.2.2 Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu 36 3.2.3 Kết kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng colony-PCR 37 3.2.4 Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzym hạn chế 38 3.2.5 Kết giải trình tự gen seb đột biến vector biểu …… ……….……40 3.3 Kết biểu gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp 39 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii 3.3.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng BL21(DE3) 40 3.3.2 Kiểm tra biểu gen seb 41 3.3.3 Tối ƣu điều kiện biểu gen seb 43 3.3.4 Tinh protein tái tổ hợp SEB 47 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid APS Ammonium persulphate ARN Ribonucleic Acid bp Base pair cs Cộng dH2O Nước khử ion dNTP Deoxyribonucleotide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit IPTG Isopropylthio--D-galactoside Kb Kilobase LB Luria and Bertani PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction S aureus Staphylococcus aureus SDS Sodium dodecyl sulfate SEB Staphylococcal enterotoxin B SEs Staphylococcal enterotoxins v/p Vòng / phút Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ix Bảng Tên bảng Trang 1.1 Sơ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng toàn quốc từ 2007 – 2009 2.1 Chu kì phản ứng PCR 20 2.2 Công thức pha gel tách (12%) 27 2.3 Công thức pha gel cô (5%) 27 3.1 Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350 31 DANH MỤC BẢNG Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn x Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... phép tham gia thực đề t i Nghiên cứu t o kháng nguyên t i t hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho t o k t ph t nhanh ngộ độc thực phẩm độc t t cầu vàng” Trong trình nghiên cứu. .. vector biểu 36 3.2.3 K t kiểm tra vector t i t hợp phản ứng colony-PCR 37 3.2.4 K t kiểm tra plasmid t i t hợp enzym hạn chế 38 3.2.5 K t giải trình t gen seb đ t biến vector biểu ……... enterotoxin B 10 Số hóa Trung t m Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 1.3.2 Cơ chế gây độc staphylococcal enterotoxin B 12 1.3.3 Staphylococcal enterotoxin B t i t hợp tiềm