I HC THI NGUYấN TRNG I HC S PHM - H TH PHNG NH GI KH NNG CHU HN V PHN LP GEN CYSTATIN LIấN QUAN N TNH CHU HN CY U TNG [Glycine max (L.) Merrill] LUN VN THC S SINH HC Thỏi Nguyờn - 2010 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn I HC THI NGUYấN TRNG I HC S PHM - H TH PHNG NH GI KH NNG CHU HN V PHN LP GEN CYSTATIN LIấN QUAN N TNH CHU HN CY U TNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyờn ngnh: Di truyn hc Mó s: 62.42.70 LUN VN THC S SINH HC NGI HNG DN KHOA HC: PGS.TS CHU HONG MU Thỏi Nguyờn - 2010 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn LI CM N Tụi xin by t lũng bit n sõu sc n thy PGS.TS Chu Hong MuPhú Giỏm c i hc Thỏi nguyờn v TS Chu Hong H - Phú Giỏm c Phũng thớ nghim trng im , Vin Cụng ngh sinh hc thuc Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó tn tỡnh hng dn , chi bao , hờt long giỳp tụi sut qua tri nh nghiờn cu va thc hin tai lun Tụi xin by t lũng bit n sõu sc ti GS TS Lờ Trn Bỡnh - Nguyờn Viờn trng Vin Cụng ngh Sinh hc ó giỳp va to mi iu kin thun li tụi hon thnh lun cua mi nh Tụi xin chõn thnh cam n TS Nguyn V Thanh Thanh - Trng i hc khoa hoc t nhiờn H Thỏi nguyờn v CN Hong Ha - Phũng Cụng ngh t bo thc vt , Vin Cụng ngh sinh hc ó giỳp tụi quỏ trỡnh thc hin tai lun Trong quỏ trỡnh thc hiờn tai , tụi ó nhõn c s giỳp nhit tỡnh ca ton th cỏn b Phũng Cụng ngh t bo thc vt, Vin Cụng ngh Sinh hc Nhõn dp ny, tụi xin chõn thnh cam n s giỳp quý bỏu ú Tụi xin chõn thnh cam n cỏc thy cụ giỏo v cỏc cỏn b Khoa sau i hc, Trng i hc S phm - i hc Thỏi nguyờn ó giang dy v to iu kin cho tụi hon thnh khoỏ hc Tụi xin cam n lanh ao trng THPT ụng Hy , cỏc bn ụng nghip ó to iu kin giỳp tụi quỏ trỡnh hc v hon thnh lun Cui cựng tụi rt bit n nhng ngi thõn gia ỡnh, cỏc ban cua tụi ó luụn ng viờn, quan tõm, to mi iu kin cho tụi hc v nghiờn cu Thỏi Nguyờn, thỏng nm 2010 Tỏc gia lun H Thi Phng S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn MUC LUC Trang phu bi a Trang Li cam n Nhng ch viờt tt Danh muc cac bang luõn an Danh muc cac hi nh luõn an M U Chng TNG QUAN TI LIU 1.1 CY U TNG VA C TI NH CHI U HAN CUA CY U TNG .4 1.1.1 Cõy u tng 1.1.2 c tớnh chu hn ca cõy u tng .8 1.2 CHT C CHấ CYSTATIN VA GEN CYSTATIN THC VT VA CY U TNG 12 1.2.1 Chõt c chờ Cystatin 12 1.2.1.1 Gii thiờu chung vờ Cystatin sinh võt .12 1.2.1.2 Phõn loi Cystatin .13 1.2.1.3 Cu trỳc, chc nng ca Cystatin thc vt 15 1.2.2 Gen ma hoa Cystatin thc võt va cõy õu tng .. .19 1.3 NG DUNG SINH HC PHN T TRONG PHN LP GEN 21 Chng VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 28 2.1 VT LIU NGHIấN CU .28 2.1.1 Vt liu thc vt 28 2.1.2 Húa cht, thit b v a im nghiờn cu 29 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 PHNG PHP NGHIấN CU .29 2.2.1 ỏnh gớa kha nng chu hn giai on cõy non bng phng phỏp gõy hn nhõn to .29 2.2.2 X lý kt qua v tớnh toỏn s liu 31 2.2.3 Phng phỏp sinh hc phõn t 31 2.2.3.1 Phng phỏp tỏch chit ARN tng s t mm u tng 31 2.2.3.2 Phng phỏp in di ADN trờn gel agarose .32 2.2.3.3 Phng phỏp RT-P 32 2.2.3.4 Ph-ơng pháp gắn gen vào vector tách dòng 35 2.2.3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5 36 2.2.3.6 Ph-ơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 36 2.2.3.7 Tỏch chiờt plasmit 37 2.2.3.8 Phng phỏp xỏc nh trỡnh t gen bng thit b t ng( N) 37 Chng KT QU V THO LUN 38 3.1 C IM CUA HT V KH NNG CHU HN CUA CC GING U TNG NGHIấN CU 38 3.1.1 c im hỡnh thỏi, kớch thc v lng ht ging u tng nghiờn cu 38 3.1.2 Kha nng chu hn ca ging u tng 39 3.2 KấT QUA PHN LP VA XAC I NH TRI NH T GEN CYSTATIN U TNG 40 3.2.1 Tỏch chit ARN tụng sụ 40 3.2.2 Kết RT-PCR 43 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.3 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5 44 3.2.4 Kt qu chn dũng t bo mang vector tỏi t hp 46 3.2.5 Kt qu tỏch chit ADN plasmid 47 3.2.6 Kt qu kim tra cỏc dũng plasmid 48 3.2.7 Kt qua giai trỡnh t nucleotit 49 KấT LUN VA ấ NGHI . 58 CễNG TRI NH CễNG Bễ LIấN QUAN ấN LUN VN 59 TI LIU THAM KHO 60 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn NHNG CH VIT TT ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic ASTT p sut thm thu ATP- aza Enzym phõn giai ATP Bp Cp baz cADN Si ADN b sung c tng hp t mARN nh enzyme phiờn ma ngc dNTP Deoxynucleotid cs Cụng s DHA Docosa Hexaenoic Axit EDTA Ethylendiamin tetraacetic axit EPA Eicosa Pentaenoic axit HSP Heat shock protein - Protein sc nhit HSG Heat Shock Granules HSPL H s pha loóng Kb Kilo baz = 1000 bp LEA Late embryogenesis abundant MGPT Mụi gii phõn t - Molecular chaperone MW Molecular weight - Khi lng phõn t PCR Polymeraza chain reaction - Phan ng chui polimeraza S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MUC CC BNG Bng 2.1 Tờn Bang Trang Nguụn gc, c iờm ca ging u tng nghiờn 30 cu 2.2 Thnh phn phan ng ca PCR 24 2.3 Chu k nhit cho phan ng PCR 37 2.4 Thnh phn phan ng gn san phm PCR vo vector tỏch dũng pBT 38 3.1 Mu sc, sụ lng v lng ht ca ging u 42 tng nghiờn cu 3.2 anh gia kha nng chi u han cua giụng u tng 45 Hờ sụ tng ụng va hờ sụ khac cua gen cystatin 58 nghiờn cu 3.3 10 giụng õu tng (%) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MUC CC HèNH Hinh Tờn Hi nh Trang 2.1 S ụ vector pBT 38 3.1 Hỡnh anh ht ca ging u tng nghiờn cu 42 3.2 Hỡnh anh cõy u tng lỏ trc x lý hn 44 3.3 Hỡnh anh cõy u tng lỏ sau x lý hn 44 3.4 Kt qua tỏch chit RNA tng s 46 3.5 Kết PCR nhõn gen cu a giụng õu tng Thai 48 Nguyờn 3.6 Kt qua bin np vector tỏi t hp vo t bo kha bin E coli DH5 49 3.7 PCR trc tip t khun lc vi cp mụi pUC18F- 50 3.8 Kt qua tỏch ADN plasmid tỏi t hp 51 3.9 Kt qua ct plasmid bng enzyme gii hn BamHI 52 3.10 Trỡnh t trỡnh t nucleotid ca mu nghiờn cu 54 Thỏi Nguyờn v mõu giụng õu tng a cụng bụ trờn genbank 3.11 Biờu ụ hi nh cõy so sanh mc tng ụng gen 59 cystatin cua 10 giụng õu tng 3.12 Trỡnh t axit amin cua mõu nghiờn cu Thai 60 Nguyờn va mõu giụng õu tng a cụng bụ trờn genbank S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn M U Lý chn ti u tng Glycine max (L.) Merrill l loi cõy cú v trớ quan trng c cu cõy trụng nụng nghip, cú giỏ tr kinh t v hm lng dinh dng cao Ht u tng cha 30%- 46% protein, 12%-25% lipit, v nhiu loi vitamin (B1, B2, C,D, E, K), cha nhiu loi axit amin cn thit (lizin, triptophan, metionin, xystein, lizin), l nguụn nng lng cn thit cho ngi Cõy u tng cú thi gian sinh trng ngn, h r cú nt sn mang vi khun c nh m, to kha nng c nh nit khụng khớ thnh cht hu c nờn cõy u tng thng c trụng luõn canh vi lỳa v ngụ tng v v cai to t bc mu Vỡ vy trụng u tng gúp phn cai to t v bao v mụi trng Vi nhng giỏ tr to ln ú, m cõy u tng c trụng ph bin nhiu nc trờn th gii, phỏt trin mnh M, Braxin, Argentina , Trung Quc va n Vit Nam, cõy u tng c gieo trụng ca vựng nụng nghip trờn ca nc vi nguụn gen rt a dng v phong phỳ, gụm cỏc ging nhp ni, ging lai to, ging t bin v on cỏc ging a phng S a dng v phong phỳ ú chớnh l nguụn nguyờn liu phc v cho cụng tỏc ging nhm chn to nhng ging u tng mi cho nng sut v cht lng phự hp vi mc tiờu chn ging [9] Nhng ging u tng a phng thng cú nng sut thp, nhng li cú cht lng ht tt v kha nng chng chu cao ụi vi cỏc iu kin bt li ca ngoi canh Trong nhng nm gn õy din bin khớ hu ngy cng phc tp, lng ma phõn b khụng u gia cỏc vựng v gia cỏc thỡ k nm nờn hn hỏn v nng núng kộo di cựng vi s bin i ca cỏc yu t mụi trng khỏc ó tỏc ng xõu n s sinh trng v phỏt trin, lm giam nng sut v S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... chờ Cystatin 12 1.2.1.1 Gii thiờu chung vờ Cystatin sinh võt .12 1.2.1.2 Phõn loi Cystatin .13 1.2.1.3 Cu trỳc, chc nng ca Cystatin thc vt 15 1.2.2 Gen ma hoa Cystatin. .. M U Chng TNG QUAN TI LIU 1.1 CY U TNG VA C TI NH CHI U HAN CUA CY U TNG .4 1.1.1 Cõy u tng 1.1.2 c tớnh chu hn ca cõy u tng .8 1.2 CHT C CHấ CYSTATIN VA GEN CYSTATIN THC VT... 2.2.3.3 Phng phỏp RT-P 32 2.2.3.4 Ph-ơng pháp gắn gen vào vector tách dòng 35 2.2.3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5 36 2.2.3.6 Ph-ơng pháp PCR trực tiếp