` ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - - PHẠM THỊ OANH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - - PHẠM THỊ OANH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2010 Tác giả luận văn Phạm Thị Oanh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Bích Nga - Phòng Miễn dịch học Viện Công nghệ Sinh học hết lòng giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Di truyền, Sinh học đại - Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Bộ môn Sinh học phân tử, Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên Qua đây, xin cảm ơn Bộ môn Hệ thống canh tác - Viện Nghiên cứu Ngô cung cấp số giống đậu xanh giúp thực luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè nhiệt tình ủng hộ động viên suốt trình thực luận văn Tác giả luận văn Phạm Thị Oanh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) bp Base pair (cặp base) CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide cs Cộng DNA Deoxy ribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic) EDTA Ethylen Diamin Tetracetic Acid (Axit etylen diamin tetraxetic) HSP Heat Shock Protein (Protein sốc nhiệt) IPTG Isopropylthio - β - D - galactosidase Kb Kilo base LB Luria and Bertani LEA Late embryogenesis abundant protein (Protein tích lũy với số lượng lớn giai đoạn cuối trình hình thành phôi) LTP Lipid Transfer Protein (Protein vận chuyển lipit) MGPT Molecular chaperone (Môi giới phân tử) NXB Nhà xuất PCR Polymease Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PLC Phospholipase C RNA Ribonucleic acid (Axit Ribonucleic) TAE Tris Acetate EDTA X - gal - brom - - chlo - - indolyl - β - D - galactosidase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Tên bảng luận văn Bảng 1.1 1.2 Trang Các giai đoạn sinh trưởng phát triển đậu xanh Diện tích, sản lượng, suất đậu xanh giới năm gần 14 2.1 Các giống đậu xanh nghiên cứu 24 2.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry 28 2.3 Trình tự cặp mồi nhân gen LTP 31 2.4 Thành phần phản ứng PCR 31 2.5 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 32 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT 33 3.1 Một số đặc điểm hình thái giống đậu xanh nghiên cứu 36 3.2 Kích thước rễ, thân giống đậu xanh giai đoạn non 38 3.3 Hàm lượng lipid protein giống đậu xanh nghiên cứu 40 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Khả chịu hạn giai đoạn non giống đậu xanh nghiên cứu Phổ hấp thụ DNA bước sóng 260nm 280nm giống đậu xanh 044/ĐX06 HN Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN AY300807 Vị trí sai khác trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN Vị trí sai khác trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN AY300807 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 46 52 54 55 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình Tên hình luận văn Trang 2.1 Hạt giống đậu xanh nghiên cứu 25 2.2 Đồ thị chuẩn định lượng protein theo Lowry 29 2.3 Sơ đồ vector pBT 33 3.1 3.2 3.3 Mối tương quan hàm lượng lipid protein giống đậu xanh nghiên cứu Đồ thị hình rada biểu diễn khả chịu hạn 42 43 Mối tương quan số chịu hạn chiều dài rễ giống đậu xanh nghiên cứu 44 3.4 Hình ảnh giống đậu xanh nghiên cứu sau 11 ngày gây hạn 45 3.5 DNA tổng số giống đậu xanh 044/ĐX06 BG 46 3.6 Hình ảnh điện di kết nhân gen LTP 47 3.7 Kết điện di DNA thu từ kỹ thuật gel 48 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc 49 3.9 Kết điện di sản phẩm clony-PCR 50 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 Kết điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN Trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh nghiên cứu So sánh trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN với trình tự công bố AY300807 So sánh trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN So sánh trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN AY300807 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 51 53 55 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) ba đậu đỗ nhóm đậu ăn hạt Đây trồng có vị trí quan trọng nông nghiệp nhiều nƣớc, có Việt Nam [7], [11] Trồng đậu xanh cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng ngƣời vật nuôi mà có tác dụng cải tạo bồi dƣỡng đất, rễ đậu xanh có nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh [4], [5] Hiện nay, giống đậu xanh trồng Việt Nam chủ yếu giống có khả chịu hạn thƣờng bị nhiễm số bệnh nhƣ: sâu keo, sâu xanh… Trong năm gần đây, có số công trình nghiên cứu đậu xanh tiếp cận phân tích đại phân tử protein DNA nhƣ: nghiên cứu tính đa hình protein giống đậu xanh địa phƣơng kỹ thuật phân tích thành phần điện di protein dự trữ hạt, nghiên cứu tƣợng đa dạng DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên [6], [10], [17] Một số nghiên cứu khả chịu hạn đƣợc tiến hành số loại trồng nhƣ đậu tƣơng, ngô, lúa… [1], [2], [9] Các nghiên cứu thống đặc tính chịu hạn trồng phức tạp nhiều gen quy định, có gen LTP (Lipid Transfer Protein) LTP gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì Khi gặp stress hạn, LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật giảm nƣớc nhờ tăng độ dày lớp vỏ [36] Tuy nhiên, nghiên cứu mối liên quan đặc điểm sinh lí, hoá sinh sinh học phân tử gen LTP với khả chịu hạn đậu xanh hạn chế Xuất phát từ sở trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá chất lƣợng hạt nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo đậu xanh chịu hạn Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá chất lƣợng hạt giống đậu xanh nghiên cứu thông qua phân tích số tiêu hoá sinh - Đánh giá nhanh khả chịu hạn giai đoạn non số giống đậu xanh - Phân lập nghiên cứu cấu trúc gen LTP liên quan đến tính chịu hạn Nội dung nghiên cƣ́u - Phân tích số đặc điểm hình thái nhƣ: màu gốc thân mầm, màu vỏ hạt, hình dạng hạt, khối lƣợng 1000 hạt, chiều dài thân rễ giống đậu xanh thu thập đƣợc giai đoạn non - Phân tích tiêu hoá sinh sau: hàm lƣợng lipid, protein tan tổng số giống đậu xanh thu thập đƣợc - Đánh giá khả chịu hạn giống đậu xanh thu thập đƣợc giai đoạn non - Tách chiết DNA tổng số số giống đậu xanh - Nhân gen LTP kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) - Tách dòng gen LTP giống đậu xanh chịu hạn tốt chịu hạn - Xác định trình tự gen LTP - Phân tích cấu trúc gen LTP Ý nghĩa khoa học Là sở cho việc thiết kết vector chuyển gen nhằm tạo đậu xanh mang gen LTP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu xanh Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek), có NST 2n = 22, loại đậu ăn hạt, thân thảo Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, đƣợc phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới chủ yếu nƣớc Đông Nam Á Dạng dại V radiata đƣợc tìm thấy Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dƣơng, Đông Phi [11] Phân loại khoa học đậu xanh: - Giới (regnum): Plantae - Ngành (division): Magnolyophita - Lớp (class): Magnolyopsida - Bộ (order): Fabales - Họ (Familia): Fabaceae - Chi (genus): Vigna - Loài (species): V radiata Chi Vigna chi lớn họ Đậu, bao gồm khoảng 150 loài thuộc chi phụ Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron; Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus, đậu xanh số 16 loài phân chi Ceratotropis [5] 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học đậu xanh Cây đậu xanh thuộc loại thân thảo, loại trồng cạn thu hạt bao gồm phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt  Đặc điểm rễ Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ rễ phụ Rễ thƣờng ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, điều kiện thuận lợi ăn sâu tới 70 - 100 cm Rễ phụ thƣờng gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... nhiên, nghiên cứu mối liên quan đặc điểm sinh lí, hoá sinh sinh học phân tử gen LTP với khả chịu hạn đậu xanh hạn chế Xuất phát từ sở trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: Đánh giá chất lƣợng hạt nghiên. .. chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo đậu xanh chịu hạn Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá chất lƣợng hạt giống đậu xanh nghiên cứu thông qua phân tích số tiêu hoá sinh - Đánh giá nhanh khả chịu hạn... cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) nhằm phục vụ việc thiết kế vector chuyển gen mang gen