-1- MỞ ĐẦU Axit lactic số chất hóa học quan trọng, sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm công nghiệp hóa học Trong đó, 70% axit lactic sản xuất ứng dụng vào thực phẩm ngành có liên quan đến thực phẩm Hiện nay, 90% lượng axit lactic sản xuất trình lên men vi khuẩn Nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit lactic thường sản phẩm từ lương thực tinh bột khoai tây, tinh bột bắp, tinh bột mì, Tuy nhiên nguồn nguyên liệu có giá thành cao cạnh tranh với nguồn nguyên liệu thực phẩm Do đó, lên men sản xuất axit lactic từ nguồn nguyên liệu nguồn gốc thực phẩm biomass tập trung nghiên cứu Ngoài ra, axit lactic xác nhận số 30 chất hóa học có khả sản xuất từ biomass Trong số nguồn sinh khối biomass, sinh khối lignocellulose có sẵn với số lượng lớn, phân bố rộng rãi giá thành thấp Tuy nhiên, cellulose hemicellulose lignocellulose trực tiếp sử dụng vi khuẩn lactic (LAB) để sản xuất axit lactic cấu trúc phức tạp lignocellulose thiếu enzyme cellulolytic LAB Dịch thủy phân lignocellulose sau tiền xử lý thủy phân chủ yếu bao gồm hỗn hợp đường glucose, cellobiose, xylose arabinose Như vậy, dẫn xuất đường thu từ trình thủy phân lignocellulose đường glucose có đường xylose cellobiose Vì vậy, lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose hướng nghiên cứu có tính khả thi lẽ làm giảm giá thành sản phẩm, góp phần giải ô nhiễm môi trường mà tăng hiệu trình sản xuất axit lactic từ vật liệu lignocellulose Việt Nam nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải hàng năm lớn Trong số loại phế phụ phẩm nông nghiệp, rơm rạ loại nguyên liệu có sản lượng lớn dễ thu gom Ước tính, năm có khoảng 61 triệu rơm rạ Tuy nhiên, phần lớn rơm rạ thải bỏ tươi phương thức phổ biến đốt bỏ đồng ruộng điều gây lãng phí nguồn nguyên liệu ô nhiễm môi trường -2- nghiêm trọng Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rơm rạ có bước tiếp cận, nhiên dừng lại nguồn đường glucose thủy phân từ cellulose mà chưa tận dụng hết nguồn đường khác cellobiose (thủy phân cellulose), xylose (thủy phân hemicellulose) Do đó, đề tài “Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ số chủng vi khuẩn Lactobacillus” tiến hành nhằm khai thác mạnh nguồn nguyên liệu lignocellulose tập trung vào nguyên liệu rơm rạ- nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp Mục tiêu nghiên cứu đề tài: - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường cellobiose xylose - Nghiên cứu lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ chủng vi khuẩn chọn Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường cellobiose xylose - Khảo sát tối ưu điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ xylose cellobiose chủng chọn - Khảo sát điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng vi khuẩn, xác định dạng D, L axit lactic tạo thành Những đóng góp đề tài - Luận án phân lập chủng vi khuẩn từ sản phẩm lên men truyền thống Việt Nam: L fermentum Y6 có khả lên men axit lactic từ xylose chủng L plantarum HC2 có khả lên men axit lactic từ đường cellobiose - Luận án nghiên cứu cách có hệ thống trình lên men sinh axit lactic từ xylose cellobiose (phân lập, tuyển chọn, định tên chủng vi khuẩn, tối ưu hóa điều kiện lên men axit lactic) lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng lựa chọn Bố cục luận án -3- Luận án trình bày 131 trang: Mở đầu (2 trang), tổng quan tài liệu (33 trang), vật liệu phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết thảo luận (51 trang với 21 bảng, 68 hình sơ đồ), kết luận kiến nghị (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (14 trang với tài liệu tiếng Việt 142 tài liệu tiếng Anh) phụ lục (9 trang) CHƢƠNG I TỔNG QUAN Tổng quan vấn đề nghiên cứu luận án trình bày chi tiết phần: 1.1 Axit lactic 1.1.1 Đặc tính hóa học axit lactic 1.1.2 Ứng dụng axit lactic 1.1.3 Các phương pháp sản xuất axit lactic 1.2 Lignocellulose 1.2.1 Thành phần hóa học lignocellulose 1.2.2 Rơm rạ 1.3 Lên men axit lactic từ rơm rạ 1.3.1 Quá trình tiền xử lý 1.3.2 Quá trình thủy phân 1.3.3 Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ vi khuẩn lactic 1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ giới Việt Nam CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Mẫu phân lập: Các mẫu từ nguồn thực phẩm lên men truyền thống từ địa bàn khác như: Cà muối chua, dưa muối chua , dưa bắp cải muối, sung muối, măng chua, hành muối, bã dong giềng, dày bò Các mẫu thu thập từ địa bàn Hà Nội, Sơn Tây - Rơm rạ: Rơm rạ Khang Dân vụ đông, hè thu gom vào vụ năm 2014, 2015 Hoài Đức, Hà Nội 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh sinh học phân tử -4- 2.2.1.1 Phân lập tuyển chọn chủng sinh axit lactic từ đường xylose cellobiose (Bergey D.H cộng (1994), Le.T.B cộng (1999), Vamanu E cộng (2005), Bevilacqua A.E cộng (1989)) 2.2.1.2 Quan sát đặc điểm hình thái, sinh lí sinh hóa chủng vi khuẩn chọn(Bergey D.H cộng (1994)) 2.2.1.3 Định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử 2.2.1.4 Kiểm tra khả đối kháng chủng vi khuẩn Y6 HC2 2.2.2 Phƣơng pháp lên men Lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ tiến hành sau: - Lên men axit lactic từ đường xylose cellobiose: Quá trình lên men axit lactic tiến hành sau: Bình thủy tinh 200 ml nút cao su chứa 150ml môi trường YE - xylose YE - cellobiose, tỉ lệ cấp giống, nồng độ đường, nhiệt độ, pH ban đầu, tốc độ lắc yếu tố thay đổi theo thí nghiệm khảo sát, lên men thực 120 Sau đó, thu dịch đem xác định lượng axit tổng tạo thành phân tích lượng axit lactic tạo thành phương pháp HPLC - Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ qui mô 200ml: Bình thủy tinh 200 ml nút cao su chứa 150ml môi trường YE sử dụng đường từ dịch thủy phân rơm rạ (cellobiose 11,3 g/l; glucose 16,9 g/l xylose 8,16 g/l), điều kiện: Duy trì pH 6,2 NaOH 2N, lượng giống cấp 10% theo thể tích tỉ lệ L plantarum HC2 : L fermentum Y6, nhiệt độ, tốc độ lắc, nồng độ đường nồng độ cao nấm men thay đổi theo thí nghiệm khảo sát - Lên men axit lactic qui mô lít Thiết bị lên men lít chứa 1500 ml môi trường YE - dịch thủy phân rơm rạ hàm lượng đường (cellobiose 11,3 g/l; glucose 16,9 g/l xylose 8,16 g/l), hàm lượng cao nấm men g/l, pH 6,2 trì NaOH 2N, tỉ lệ giống cấp 10% theo thể tích tỉ lệ L plantarum HC2 : L fermentum Y6 2:1; nhiệt độ 37oC Lên men diễn 48 giờ, canh trường thu xác định lượng axit lactic tạo thành lượng đường dư Xác định hiệu suất lên men axit lactic Hiệu suất lên men = (A/D) × 100 -5- Trong đó: A: Lượng axit lactic thu sau trình lên men (g/l); D: Lượng đường tiêu thụ trình lên men (g/l) 2.2.3 Phƣơng pháp hóa lí - sinh 2.2.3.1 Xác định đường khử (Miller G.L cộng (1996)) 2.2.3.2 Xác định hàm lượng axit tổng theo Therner (Vamanu E cộng (2005)) 2.2.3.3 Xác định hàm lượng axit lactic, nồng độ đường dịch lên men theo phương pháp HPLC 2.2.3.4 Phương pháp tiền xử lý rơm rạ kiểm( NaOH) theo phương pháp nấu kín (Nguyen.T.M.P cộng (2015)) 2.2.3.5 Phương pháp thủy phân rơm rạ hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 Cellic® Htec2 (Nguyen.T.M.P cộng (2015)) 2.2.3.6 Xác định dạng D,L axit lactic Thu hồi tinh axit lactic theo phương pháp truyền thống có cải tiến (Vũ Thị Thuận cộng (2012)) Phương pháp hiệu để xác định dạng D, L axit lactic đo góc quay cực hỗn hợp đồng phân Các mẫu đo máy quang phổ kế phân cực Jasco - j - 710 - spectropolarimeter, cách đo theo TCVN 8446 - 2010 2.2.3.7 Khảo sát tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ chủng chọn Đối với trình lên men axit lactic chủng L fermentum Y6 từ xylose với nhiệt độ mức 30oC, 35oC, 37oC, 40oC 45oC pH ban đầu (4,5; 5; 5,5;6; 6,5; 7; 7,5); nồng độ đường xylose (5 g/l; 10g/l; 15 g/l; 20 g/l; 25 g/l); tỉ lệ cấp giống( 5%; 10%; 15%; 20%) Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc trì pH điều kiện tối ưu Đối với trình lên men axit lactic chủng L plantarum HC2 từ cellobiose với nhiệt độ mức 30oC, 35oC, 37oC, 40oC 45oC pH ban đầu (4,5; 5; 5,5;6; 6,5; 7; 7,5); nồng độ đường cellobiose (5 g/l; 10g/l; 15 g/l; 20 g/l; 25 g/l); tỉ lệ cấp giống (5%; 10%; 15%; 20%), tốc độ lắc 0; 50; 100; 150 vòng/phút Khảo sát ảnh hưởng trì pH lắc điều kiện tối ưu -6- Đối với trình lên men axit lactic hỗn hợp chủng L fermentum Y6 L plantarum HC2 từ dịch thủy phân rơm rạ: Nhiệt độ khảo sát mức 33oC; 35oC; 37oC 39oC Nồng độ đường dịch thủy phân (10 g/l; 20 g/l; 30 g/l; 38 g/l; 76 g/l); tỉ lệ cấp giống 10% (HC2 : Y6 = 1:1; 2:1; 3:1; 4:1), tốc độ lắc 0; 50, 100; 150; 200 vòng/phút pH 6,2 trì NaOH 2N Tối ưu hóa trình lên men axit lactic theo phương pháp bề mặt đáp ứng quy hoạch Box-Benken, sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15 Ma trận thực nghiệm bao gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy yếu tố khảo sát nhiệt độ (30 – 44oC), pH (4,5 – 7,5), nồng độ đường cellobiose xylose (5 – 15 g/l) 2.2.3.8 Phương pháp thống kê Tất thí nghiệm thực lần để lấy giá trị trung bình Kết xử lý thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose 3.1.1 Phân lập, tuyển chọn định tên chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đƣờng xylose 3.1.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường xylose Từ 20 mẫu sản phẩm lên men lấy từ nguồn khác địa bàn Hà Nội phân lập 26 chủng môi trường YE - xylose agar có bổ sung CaCO3 Quan sát vòng phân giải D1 nhận thấy 26 chủng có khả sinh axit, nhiên có chủng: Y1, Y5, Y6, Y7, MC2, MC5, DC3, HX3, HX10 có tỉ lệ D1/d1 ≥ Vì vậy, chủng vi khuẩn lựa chọn để tiến hành tuyển chọn Tiếp tục tuyển chọn chủng có khả sinh axit lactic cao từ chủng theo phương pháp định tính axit lactic thuốc thử Uffelman, phương pháp cấy chấm điểm, đục lỗ thạch định lượng axit NaOH 0,05N chọn chủng Y5, Y6 có khả sinh axit cao (bảng 3.2) tiến hành xác định khả sinh axit lactic chủng phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC (hình 3.5 hình 3.6) Kết -7- chọn chủng Y6 cho hiệu suất sinh axit lactic đạt 56 % cao chủng Y5( 54%) Do đó, chủng Y6 chọn cho thí nghiệm Bảng 3.2 Đặc điểm chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm định lượng axit S T Kí hiệu T Y1 Y5 Y6 Y7 MC2 MC5 HX3 HX10 DC3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Khuẩn lạc tròn, kích thước từ 1,0- 1,4 mm, bề mặt trơn, nhẵn bong, nhầy, trắng trong, không tâm Khuẩn lạc tròn có kích thƣớc từ 0,6 – 0,8 mm, bề mặt trơn, nhẵn bóng, không mép, màu trắng đục Khuẩn lạc tròn, kích thƣớc từ 0,8-1,1 mm, không mép, bề mặt trơn, nhẵn bóng, màu trắng đục Khuẩn lạc to tròn kích thước từ 1,5 – 1,8 mm, trắng đục, nhày Khuẩn lạc to, viền cưa, trắng đục Trắng ngả vàng, tròn, trơn, nhẵn Tròn đều, trắng đục, nhẵn Trắng đục, khuẩn lạc to, tròn Tròn, có tâm, màu trắng sáng, bóng D1/d1 D2 – d2 Lượng axit thu sau 96 (g/l) 4,0 5,0 5,21 4,3 5,5 5,78 4,5 6,5 3,0 4,0 4,74 4,0 3,8 4,8 4,2 4,8 5,2 4,5 5,6 5,6 4,1 5,0 5,3 3,0 4,1 4,8 (D1: đường kính vòng phân giải (mm), d1: đường kính khuẩn lạc (mm)) (d2 đường kính lỗ đục (mm), D2 đường kính vòng phân giải) -8- Hình 3.5 Sắc kí đồ HPLC dịch lên men axit lactic từ xylose chủng Y5 Hình 3.6 Sắc kí đồ HPLC dịch lên men axit lactic từ xylose chủng Y6 3.1.1.2 Định tên chủng vi khuẩn Y6 a Đặc điểm sinh lý – sinh hóa chủng Y6 Quan sát kính hiển vi hình thái điển hình, đặc tính chủng Y6 cho thấy: chủng vi khuẩn Y6 thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương có tế bào hình que ngắn, có khả axit hóa môi trường, không sinh bào tử, không sinh khí không di động b Định tên phương pháp sinh học phân tử DNA hệ gen chủng nghiên cứu tách chiết đoạn gen mã cho 16S rRNA khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F/1492R Kết giải trình tự đoạn gen 16S Y6 cho thấy đoạn gen gồm 1447 bp đoạn gen so sánh với gen 16S rRNA vi khuẩn Genbank với phần mềm Blastn Kết cho thấy đoạn gen 16S rRNA chủng Y6 có độ tương đồng 99.92% với trình tự -9- 16S rADN Lactobacillus fermentum (AJ575812) (1279/1280 bp); tương đồng 97.89% Lactobacillus gorilla (AB904716) (1253/1280 bp) (hình 3.10) Hình 3.10 Vị trí phân loại chủng Y6 với loài có quan hệ họ hàng gần Kết hợp đặc điểm sinh học phân tử sinh lí, sinh hóa xếp chủng Y6 thuộc loài Lactobacillus fermentum đặt tên Lactobacillus fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) 3.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men axit lactic từ đƣờng xylose chủng L fermentum Y6 Từ kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố: Nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đường xylose, tỉ lệ cấp giống đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 lựa chọn giá trị nhiệt độ 37oC; pH ban đầu 6; nồng độ đường xylose 10 g/l; tỉ lệ cấp giống 10 % (v/v) thu 7,29 g/l axit sau 120 lên men 6.66 30 oC 35 oC 37 oC 40 oC 45 oC 24 48 72 96 Thời gian (giờ) 120 144 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) - 10 7.25 24 48 72 96 Thời gian (giờ) 120 4.5 5.5 6.5 7.5 144 Hàm lượng axit (g/l) Hình 3.12 Ảnh hưởng pH ban đầu đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 7.27 g/l 10 g/l 15 g/l 20 g/l 25 g/l 30 g/l 24 48 72 96 Thời gian (giờ) 120 144 Hình 3.14 Ảnh hưởng nồng độ đường đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 Nhận thấy có yếu tố tác động mạnh đến trình yếu tố nhiệt độ, pH ban đầu nồng độ đường xylose (hình 3.11; 3.12; 3.14) Do đó, thí nghiệm chọn yếu tố để tiến hành tiến hành tối ưu điều kiện lên men axit lactic từ xylose chủng L fermentum Y6 3.1.3 Tối ƣu điều kiện lên men axit lactic từ đƣờng xylose chủng L fermentum Y6 Theo nguyên tắc ma trận Box - Behnken, ta tiến hành 17 thí nghiệm với thay đổi đồng thời yếu tố nhiệt độ, pH ban đầu nồng độ đường xylose quanh giá trị trung bình (bảng 3.5) Từ phân tích phương sai, phần mềm đưa phương trình hồi quy theo giá trị mô hình nghiên cứu sau: Y = 8,06 - 0,38X1 + 0,73X2 + 1,51X3 - 0,34 X1X2 - 0,64 X1X3 + 0,055X1X3 - 1,29X12 - 1,71 X22 - 1,87 X32 (1) - 11 - Bảng 3.5 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken với ba yếu tố hàm lượng axit thu điều kiện nuôi cấy khác STT X1 X2 X3 o X1( C) X2 X3(g/l) Y(g/l) -1 0 37 6,0 10 8,0 +1 0 30 6,0 3,11 -1 +1 37 4,5 15 5,32 +1 +1 44 6,0 3,58 -1 -1 37 6,0 10 8.10 +1 -1 44 4,5 10 4,15 -1 +1 37 6,0 10 7,9 +1 +1 30 6,0 15 7,5 -1 -1 30 4,5 10 4,2 10 +1 -1 44 6,0 15 5,41 11 -1 +1 37 7,5 15 6,58 12 +1 +1 37 6,0 10 8,15 13 0 37 7,5 3,53 14 0 30 7,5 10 6,63 15 0 44 7,5 10 5,23 16 0 37 4,5 2,49 17 0 37 6,0 10 8,15 Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa hàm lượng axit thu sau trình lên men phần mềm Design-Expert Kết tìm phương án tốt để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: nhiệt độ 37,76oC; pH ban đầu = 6,2; nồng độ đường 11,53 g/l Khi đó, lượng axit đạt điều kiện theo tính toán 8,33 g/l Thực nghiệm tiến hành điều kiện sau: Nhiệt độ 38 o C, pH ban đầu 6,2 nồng độ đường 12 g/l Sau 120 lên men, hàm lượng axit đạt 8,51 g/l Kết có độ tương thích cao so với lí thuyết, lượng axit thu sau tối ưu đa yếu tố tăng 16,7% so với khảo sát đơn yếu tố 3.1.4 Ảnh hƣởng lắc trì pH ban đầu điều kiện tối ƣu - 12 - Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình lên men trì pH6,2 NaOH 2N điều kiện tối ưu Kết cho thấy tốc độ lắc 50 vòng/phút kết hợp với trì pH6,2 dẫn đến hiệu suất lên men mức độ sử dụng đường tăng, đồng thời rút ngắn thời gian lên men Phân tích dịch lên men điều kiện trì pH 6,2 sau 48 phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC thu kết lượng axit lactic tạo thành 7,36 g/l; axit axetic 2,24 g/l Như vậy, hiệu suất lên men axit lactic 61,3% Từ liệu tham chiếu so sánh cho thấy lợi lực lên men axit lactic từ xylose chủng L fermentum Y6 cao so với chủng chi Lactobacillus, đạt hiệu suất lên men axit lactic 61,3% Đồng thời, chủng L fermentum Y6 phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống, nên có lợi lực độ ổn định hoạt tính bảo quản giống Bên cạnh đó, chủng có khả phát triển lên men môi trường YE - môi trường muối khoáng đơn giản chứa 3% cao nấm men nguồn bổ sung nitơ hữu cơ, điều ưu điểm chủng so với chủng Lactobacillus khác Enterococcus ưu điểm sử dụng chủng L fermentum Y6 lên men axit lactic từ dịch thủy phân lignocellulose 3.2 Nghiên cứu lên men axit lactic từ cellobiose 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn chủng định tên chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đƣờng cellobiose 3.2.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường cellobiose Từ 22 chủng vi khuẩn phân lập được, dựa vào kết phân lập lựa chọn sơ chủng thể khả sinh axit cao với tỉ lệ D1/d1≥ 3,0 (D1- đường kính vòng phân giải, d1- đường kính khuẩn lạc) Tiếp tục tuyển chọn chủng có khả sinh axit lactic cao theo phương pháp định tính axit lactic thuốc thử Uffelman; phương pháp cấy chấm điểm, đục lỗ thạch định lượng axit NaOH 0,05N Kết chọn chủng HC2 có khả sinh axit cao (hình 3.24, 3.25, bảng 3.8) Tiến hành xác định lượng axit lactic tạo thành phương pháp sắc kí lỏng cao áp kết thu lượng axit lactic tạo thành 4,2 g/l; lượng đường cellobiose dư 3,79 g/l - 13 - Hình 3.24 Hình ảnh cấy chấm Hình 3.25 Hình ảnh đục lỗ điểm chủng vi khuẩn có khả thạch chủng vi khuẩn có lên men axit lactic từ đường khả lên men axit lactic từ cellobiose đường cellobiose Bảng 3.8 Đặc điểm chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm định lượng axit Lượng S Hình dạng D2Kí axit Đặc điểm hình thái D1/ T tế bào vi d2 hiệu d1 sau 96h khuẩn lạc T khuẩn (g/l) Kích thước nhỏ li ti, Que ngắn HC1 màu trắng, không nhày, 3,0 4,0 5,1 xếp chuỗi tròn Kích thƣớc bình HC Que thƣờng,tròn, lồi, 4,0 6,0 5,5 chuỗi dài màu trắng đục, bề mặt bóng Kích thước bình Que, thường, tròn, viền HC3 3,75 4,5 5,2 chuỗi dài lồi lõm, nhày, trắng nhạt Que xếp Tròn, kích thước nhỏ li HC4 chuỗi 3,75 4,5 5,2 ti, màu trắng, bóng ngắn Tròn, kích thước nhỏ, Que ngắn HC5 bề mặt trơn bóng, màu 3,0 4,0 5,0 xếp chuỗi trắng sữa (D1: đường kính vòng phân giải (mm), d1: đường kính khuẩn lạc (mm)) - 14 - (d2 đường kính lỗ đục (mm), D2 đường kính vòng phân giải) 3.2.1.2 Định tên chủng vi khuẩn lựa chọn a Đặc điểm sinh lý – sinh hóa chủng HC2 Tiến hành quan sát đặc điểm hình thái xác định đặc tính sinh lý – sinh hóa chủng HC2 cho thấy chủng vi khuẩn HC2 thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương có tế bào hình que ngắn, có khả axit hóa môi trường, không sinh bào tử, không sinh khí không di động b Định tên phương pháp sinh học phân tử DNA hệ gen chủng nghiên cứu tách chiết đoạn gen mã cho 16S rRNA khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F/1492R Kết giải trình tự đoạn gen 16S HC2 gồm 1447 bp đoạn gen so sánh với gen 16S rRNA vi khuẩn Genbank với phần mềm Blastn Kết nhận cho thấy đoạn gen 16S rRNA chủng HC2 có độ tương đồng lên đến 100% so với trình tự gen 16S rRNA Lactobacillus plantarum subsp plantarum _ D79210 (1360/1360 bp); tương đồng 99.93% Lactobacillus pentosus_D79211 (1359/1360 bp), tương đồng 99.85% với Lactobacillus paraplantarum_AJ306297 (1358/1360 bp); tương đồng 99.63% với Lactobacillus plantarum subsp argentoraten_AJ640078 (1355/1360 bp) (hình 3.31) Hình 3.31 Vị trí phân loại chủng HC2 với loài có quan hệ họ hàng gần - 15 - Kết hợp đặc điểm sinh học phân tử sinh lí, sinh hóa xếp chủng HC2 thuộc loài Lactobacillus plantarum đặt tên Lactobacillus plantarum HC2 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đƣờng tỉ lệ cấp giống đến khả lên men axit lactic chủng L plantarum HC2 Từ kết khảo sát cho thấy số: Nhiệt độ 37oC; pH ban đầu 6; tỉ lệ cấp giống 10%; nồng độ đường 10g/l lắc 100 vòng/phút hàm lượng axit thu cao (6,45g/l) sau 120 nuôi cấy Trong có yếu tố ảnh hưởng mạnh đến trình lên men: Nhiệt độ, pH ban đầu nồng độ đường (hình 3.32; 3.33; 3.34) Do đó, chọn yếu tố để tiến hành trình tối ưu hóa Hàm lượng axit(g/l) 5.85 25oC 30 oC 35 oC 37 oC 40 oC 45 oC 24 48 72 96 Thời gian(giờ) 120 144 168 Hình 3.32 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 Hàm lượng axit (g/l) 4.5 6.09 5.5 6.5 24 48 72 96 120 Thời gian(giờ) 144 168 7.5 Hình 3.33 Ảnh hưởng pH ban đầu đến trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 - 16 - Hàm lượng axit (g/l) 6.22 5g/l 10g/l 15 g/l 20 g/l 25g/l 24 48 72 96 120 144 168 Thời gian(giờ) Hình 3.34 Ảnh hưởng nồng độ đường đến trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 3.2.3 Tối ƣu hóa trình lên men axit lactic từ cellobiose chủng L plantarum HC2 Dựa sở khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình lên men axit lactic, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời nhiệt độ (X1), pH ban đầu (X2) nồng độ đường (X3) Kết thể bảng 3.9 Kết phân tích phương sai mô hình tối ưu phần mềm DX7.1.5 (State-Ease) Giá trị F mô hình 38,83 với p < 0,0001 (p< 0,05) cho thấy dạng mô hình lựa chọn Giá trị p “Không tương thích” 0,1176 (p>0,05) cho thấy mô hình tương hợp với thực nghiệm Phương trình hồi quy thể mối quan hệ lượng axit thu yếu tố pH ban đầu, nhiệt độ nồng độ đường mô tả sau phương trình (2): Y= 7,11- 0,32X1 + 0,43X2 + 1,15 X3 - 0,22 X1X2 - 0,3 X1X3 - 0,8 X12 1,01X22- 1,95 X32(2) Từ kết dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm điều kiện lên men tối ưu là: Nhiệt độ 35,91oC; pH ban đầu 6,17; nồng độ đường cellobiose 10,93 g/l Khi đó, lượng axit đạt điều kiện theo tính toán 7,33 g/l Thực nghiệm lên men axit lactic từ cellobiose điều kiện: Tỉ lệ cấp giống 10%; nhiệt độ 36oC; pH ban đầu 6,2; hàm lượng đường 11 g/l lắc 100 vòng/phút Sau 120 lên men lượng axit thu 7,43 ± 1,45 g/l Kết có độ tương thích cao so với lí thuyết - 17 - Bảng 3.9 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với yếu tố hàm lượng axit thu điều kiện nuôi cấy khác STT 10 11 12 13 14 15 16 17 X1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 0 0 0 0 X2 0 +1 +1 0 0 -1 +1 -1 +1 0 0 X3 0 0 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 X1(oC) 30 44 30 44 30 44 30 44 37 37 37 37 37 37 37 37 37 X2 4,5 4,5 7,5 7,5 6 6 4,5 7,5 4,5 7,5 6 6 X3(g/l) 10 10 10 10 5 15 15 5 15 15 10 10 10 10 10 Design-Expert® Software Design-Expert® Software Design-Expert® Software Y Y Y 7.2 7.2 2.9 2.9 7.2 X1 = A: nhiet X2 = B: pH Y(g/l) 4,95 4,8 6,23 5,2 3,1 3,02 6,28 5,0 2,9 3,37 4,5 5,8 6,9 7,1 7,15 7,2 7,18 7.2 2.9 7.4 X1 = A: nhiet X2 = C: Duong 6.575 7.4 X1 = B: pH X2 = C: Duong 6.3 Actual Factor C: Duong = 10.00 6.225 Actual Factor B: pH = 6.00 Actual Factor A: nhiet = 37.00 Y 5.05 Y 5.2 Y 5.95 5.325 4.1 3.875 4.7 2.7 7.50 44.00 6.75 40.50 6.00 B: pH 37.00 5.25 33.50 4.50 30.00 A: nhiet Hình 3.37 Ảnh hưởng đồng thời pH ban đầu nhiệt độ đến trình lên men axit lactic từ cellobiose chủng L plantarum HC2 15.00 44.00 12.50 40.50 10.00 C: Duong 37.00 7.50 33.50 5.00 30.00 A: nhiet 15.00 7.50 12.50 6.75 10.00 C: Duong 6.00 7.50 5.25 5.00 4.50 B: pH Hình 3.38 Ảnh hưởng Hình 3.39 Ảnh hưởng đồng thời nồng độ đồng thời nồng độ đường nhiệt độ đến đường pH ban đầu trình lên men axit trình đến lên men lactic từ cellobiose axit lactic từ cellobiose chủng L plantarum HC2 chủng L plantarum HC2 - 18 - Như vậy, kết nghiên cứu xác định yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men axit lactic chủng L plantarum HC2: Nhiệt độ 36oC; pH ban đầu 6,2; nồng độ đường cellobiose 11 g/l, lắc 100 vòng/phút, tỉ lệ cấp giống 10% theo thể tích, sau 120 lên men lượng axit thu 7,43 g/l, tăng 15,2% so với khảo sát đơn yếu tố 3.2.4 Ảnh hƣởng trì pH Nghiên cứu ảnh hưởng trì pH suốt trình lên men axit lactic chủng L plantarum HC2, nhận thấy trì pH trình lên men tăng hiệu trình lên men: Lượng axit tăng rút ngắn trình lên men Phân tích thành phần dịch lên men điều kiện trì pH phương pháp HPLC thu kết quả: Lượng axit lactic tạo thành 8,83g/l (hiệu suất tương ứng đạt 81,76%) đường dư không (hình 3.42) Hình 3.42 Sắc kí đồ HPLC dịch lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 3.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ 3.3.1 Tiền xử lý rơm rạ kiềm (NaOH) theo phƣơng pháp nấu kín thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý hỗn hợp enzyme Ctec2 Htec2 Phân tích phổ HPLC dịch đường mẫu bột xút sau tiền xử lý điều kiện tối ưu, cho thấy đường lên men (glucose, xylose cellobiose) chiếm 96,35% tổng lượng đường thu cellobiose 23,68 g/l; glucose 33,8 g/l; xylose 16,33 g/l, arabinose 2,79 g/l - 19 - Như vậy, dịch thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý thủy phân hỗn hợp enzyme thương phẩm chứa loại đường có khả lên men xylose, cellobiose, glucose Sử dụng hiệu hỗn hợp loại đường lên men axit lactic hướng nghiên cứu cần triển khai để tìm kiếm giải pháp sử dụng nguyên liệu lignocellulose cho sản xuất axit lactic, đồng thời góp phần giảm tải ô nhiễm môi trường Ngoài ra, việc sử dụng có hiệu loại đường xuất phát từ dịch thủy phân cellulolse hemicellulose giảm chi phí sản xuất axit lactic tới 25% 22.2 25 20 15 10 12 24 36 48 Thời gian (giờ) 60 72 Hàm lượng axit (g/l) Hình 3.44 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L plantarum HC2 Hàm lượng axit (g/l) Hàm lượng axit (g/l) 3.3.2 Lên men lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng đơn hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 3.3.2.1 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L plantarum HC2 Quá trình lên men axit lactic diễn 48 giờ, kết thu hình 3.44 Lượng axit tạo thành nhanh khoảng 24 đầu sau cấp giống sau tăng chậm, đến 48 kết thúc trình lên men Lúc lượng axit thu 22,2 g/l Trong dịch thủy phân rơm rạ cellobiose đạt khoảng 12 g/l, glucose 18 g/l Do đó, khả sử dụng đường cellobiose, L plantarum HC2 sử dụng đường glucose lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ 20 14.2 15 10 12 24 36 48 Thời gian (giờ) Hàm lượng axit (g/l) 60 72 Hình 3.45 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L fermentum Y6 3.3.2.2 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L fermentum Y6 - 20 - Hàm lượng axit (g/l) Kết nhận thấy rằng, trình lên men axit diễn 48 giờ, lượng axit thu cao đạt 14,2 g/l (hình 3.45) Trong dịch thủy phân rơm rạ xylose đạt khoảng g/l, glucose 18 g/l Do đó, khả sử dụng đường xylose, L fermentum Y6 sử dụng đường glucose lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ 3.3.2.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Tiến hành kiểm tra tính kháng chéo chủng HC2 Y6 cách ria chủng thành đường thẳng cắt môi trường đĩa thạch Kết thể PL3.1 cho thấy chủng HC2 Y6 phát triển bình thường chứng tỏ chủng L plantarum HC2 chủng L fermentum Y6 không đối kháng Do đó, nên sử dụng hỗn hợp hai chủng HC2 Y6 lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ nhằm tận dụng tối đa nguồn carbon có thành phần dịch lên men để thu hiệu lên men lớn Từ kết khảo sát cho thấy giá trị tương ứng thông số khảo sát trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 bao gồm: Nhiệt độ 37oC; pH trì 6,2; tỉ lệ cấp giống 10% tỉ lệ L plantarum HC2 : L fermentum Y6 = :1 ; nồng độ độ đường 38g/l; hàm lượng cao nấm men g/l lắc 100 vòng/ phút 30 25 20 15 10 23.4 g/l g/l g/l g/l 12 24 36 Thời gian (giờ) 48 60 Hình 3.47 Ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men đến trình lên men axit lactic hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) - 21 40 30.6 30 01:01 02:01 03:01 04:01 20 10 12 24 36 48 Thời gian (giờ) Hình 3.49 Ảnh hưởng tỉ lệ giống đến trình lên men axit lactic hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) 40 32.3 vòng/phút 50 vòng/phút 100 vòng/phút 150 vòng/phút 200 vòng/phút 30 20 10 12 24 36 Thời gian (giờ) 48 Hình 3.50 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình lên men axit lactic hốn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Hình 3.51 Phổ HPLC dịch lên men hỗn hợp chủng L.plantarum HC2 L fermentum Y6 Phân tích phổ HPLC (hình 3.51) nhận thấy lượng axit lactic thu 24,39 g/l; axit axetic 7,20 g/l lượng đường dư đường cellobiose: 0,86 g/l Lúc này, hiệu suất lên men axit lactic thu 65,7% Như vậy, loại đường thu từ rơm rạ sử dụng có hiệu - 22 - 40 35 30 25 20 15 10 12 10 OD 600nm Nồng độ đường dư axit tạo thành(g/l) 3.3.3 Nghiên cứu động học trình lên men lên men axit lactic chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ Kết cho thấy vòng đầu trình lên men, lượng đường tiêu thụ chưa đáng kể (7,0 g/l) lượng axit tạo thành 4,7 g/l Tuy nhiên từ khoảng từ 12 đến 36 giờ, tốc độ trình lên men tăng nhanh, lượng đường tiêu thụ tăng mạnh từ 12,9 g/l đến 32,1 g/l đồng thời lượng axit dao động khoảng 10g/l đến 29,5 g/l Quá trình lên men đạt kết cao thời điểm 48 với lượng đường dư 0,86g/l lượng axit tạo thành 34,5 g/l Đồng thời thông qua hình 3.52 nhận thấy thời điểm thích hợp để thu lượng axit lớn cuối pha log, đầu pha cân (tại thời điểm 48 tính từ lên men) trình sinh trưởng phát triển chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 0 12 24 36 Thời gian (giờ) Axit Đường 48 60 72 OD Hình 3.52 Động thái trình sinh axit chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ 3.3.4 Xác định dạng D,L lactic axit Dạng L - lactic axit chiếm 86% Như vậy, sản phẩm axit lactic thu hỗn hợp đồng phân D, L axit lactic, sản phẩm ứng dụng làm chất điều chỉnh độ pH sản phẩm thực phẩm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau trình nghiên cứu, luận án thu kết sau - 23 - - Đối với trình lên men axit lactic từ đường xylose + Từ mẫu thực phẩm truyền thống phân lập 26 chủng vi khuẩn có khả lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, phương pháp tuyền chọn chọn chủng Y6 lên men axit lactic cao Bằng phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hóa sinh học phân từ định tên chủng Y6 Lactobacillus fermentum Y6 + Bằng phương pháp khảo sát đơn yếu tố qui hoạch thực nghiệm bậc Box - Bernken xác định điều kiện tối ưu cho chủng L fermentum Y6 lên men axit lactic cao: Nhiệt độ 38oC; pH trì 6,2; nồng độ đường 12 g/l; tỉ lệ cấp giống 10%, lắc 50 vòng/phút sau thời gian 48 thu nhận 7,36 g/l axit lactic Hiệu suất lên men axit lactic 61,3% - Đối với trình lên men axit lactic từ đường cellobiose + Từ 22 chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn khác nhau, tuyền chọn chủng HC2 có khả lên men axit lactic cao từ đường cellobiose Bằng phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hóa sinh học phân từ định tên chủng HC2 Lactobacillus plantarum HC2 + Sử dụng phương pháp khảo sát đơn yếu tố qui hoạch thực nghiệm bậc Box - Bernken xác định điều kiện tối ưu cho chủng L plantarum HC2 lên men axit lactic cao: tỉ lệ cấp giống 10%; nhiệt độ 36oC; pH trì 6,2; nồng độ đường 11 g/l lắc 100 vòng/phút sau thời gian 48 thu 8, 83 g/l axit lactic Hiệu suất lên men axit lactic 80,27% - Đối với trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng đơn hỗn hợp chủng L fermentum Y6 L plantarum HC2 + Xử lý thủy phân rơm rạ thu dịch thủy phân rơm rạ chứa cellobiose 23,68 g/l; glucose 33,8 g/l; xylose 16,33 g/l, arabinose 2,79 g/l + Lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L plantarum HC2: Nhiệt độ 37oC, tỉ lệ cấp giống 10% (trong tỉ lệ chủng L plantarum HC2: L fermentum Y6 = 1:1 ); pH trì 6,2; nồng độ đường 38 g/l lắc 100 vòng/phút sau thời gian 48 thu 22,2 g/l axit + Chủng L fermentum Y6 lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ điều kiện: Nhiệt độ 37oC, tỉ lệ cấp giống 10% (trong tỉ lệ - 24 - chủng L plantarum HC2: L fermentum Y6 = 1:1); pH trì 6,2; nồng độ đường 38 g/l lắc 100 vòng/phút sau thời gian 48 thu 14,2 g/l axit + Đã xác định điều kiện thích hợp để lên men axit lactic chủng L fermentum Y6 L plantarum HC2: nhiệt độ 37oC, tỉ lệ cấp giống 10% (trong tỉ lệ chủng L plantarum HC2 : L fermentum Y6 = 2:1 ); pH trì 6,2; nồng độ đường 38 g/l lắc 100 vòng/phút sau thời gian 48 thu 32,3 g/l axit Hiệu suất sinh axit đạt 85% Dịch cach trường lên men sau 48 phân tích HPLC thu kết 24,39 g/l axit lactic, hiệu suất lên men axit lactic đạt 65,7 % dạng Laxit lactic chiếm 86 % 4.2 Kiến nghị - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ quy mô pilot -Tiến hành nghiên cứu trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân từ nguồn nguyên liệu thực vật hỗn hợp chủng L fermentum Y6 L plantarum HC2  ... men axit lactic từ đường xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ chủng vi khuẩn chọn Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường cellobiose. .. trình thủy phân 1.3.3 Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ vi khuẩn lactic 1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose dịch thủy. .. lên men axit lactic 80,27% - Đối với trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng đơn hỗn hợp chủng L fermentum Y6 L plantarum HC2 + Xử lý thủy phân rơm rạ thu dịch thủy phân rơm rạ