ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÝ THỊ KIM TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÝ THỊ KIM TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRỊNH TẤT CƯỜNG Hà N ội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trịnh Tất Cường người thầy hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giảng dạy khoa Sinh học làm sở cho thực tốt luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu tập thể cán bộ, anh, chị bạn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014 Học viên Lý Thị Kim Tuyến MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT GABA Axit gamma-amino butylric GABA-T GABA transaminase GAD L-glutamate decarboxylase HTS Phương pháp sàng lọc High throughput screening KC1 Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT ml milliliter mM millimolar MRS De Man, Rogosa, Sharpe MSG Monosodium glutamate OD Mật độ quang học PLP Pyridoxalphosphate TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLC Thin layer chromatography TPCN Thực phẩm chức DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Cấu trúc GABA .4 Hình Con đường tổng hợp phân hủy GABA .5 Hình 3: Mô hình cấu trúc thụ thể GABAA Hình 4: Mô hình cấu trúc thụ thể GABAB Hình 5: Hoạt động thụ thể trước sau gắn kết với GABA Hình 6: Kết chạy sắc ký TCL dịch lên men môi trường MRS 29 Hình 7: Hoạt tính GAD cám gạo xác định thông qua MSG 31 Hình 8: Kết xác định glutamic acid cám gạo TLC 32 Hình 9: Đường chuẩn glutamic acid .33 Hình 10: Hiệu nhiệt độ thời gian trình thủy phân glutamic acid từ cám gạo 35 Hình 11: Đường chuẩn GABA 36 Hình 12: Hiệu NaCl trình phát triển tế bào sản xuất GABA 37 Hình 13: Ảnh hưởng pH tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 41 Hình 14: Ảnh hưởng nhiệt độ tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 42 Hình 15: Ảnh hưởng thời gian tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 43 Hình 16: Ảnh hưởng ôxy tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 44 Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo .45 Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B) .46 Hình 19: Kiểm tra GABA TLC 46 Hình 20: Khả bảo vệ tế bào PC12 dịch lên men chủng Lactobacillusplantarum KLEPT 48 Hình 21: Sắc ký đồ GABA chuẩn 49 Hình 22: Xây dựng đường chuẩn GABA qua HPLC .49 Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men .50 Hình 24: Chạy phân đoạn tách chiết sắc ký cột .51 Hình 25: Đưa mẫu GABA tinh vào đường chuẩn để xác định độ tinh mẫu 52 Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh kính soi sau 24 nuôi cấy tế bào WSS-1 (A), sau 48 (B) 53 Hình 27: Kết thay đổi OD Iot dựa vào thay đổi nồng độ GABA lên men 54 Hình 28: Đường chuẩn nồng độ GABA mật độ quang bước sóng 405nm 55 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Thành phần môi trường MRS .15 Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng hai mẫu cám gạo 30 Bảng 4: Giá trị glutamic acid mẫu cám gạo 33 Bảng 5: Lượng GABA mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon 38 Bảng 6: Lượng GABA mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ .39 Bảng 7: Tỉ lệ MSG (%) ảnh hưởng tới hiệu suất tạo GABA hai loại môi trường 40 Bảng 8: Hàm lượng GABA dịch lên men theo hai phương pháp đo .55 MỞ ĐẦU γ-Aminobutyric axit (GABA) axít amin có chức quan trọng hệ thống thần kinh GABA thực vai trò trình truyền tín hiệu thần kinh qua khe xináp giữ liên lạc tế bào với hệ thống thần kinh trung ương Ngoài ra, GABA biết có hiệu điều hòa số rối loạn thần kinh giống bệnh Parkinson, Huntington bệnh Alzheimer Chính GABA có chức sinh lý quan trọng nên nhiều công trình nghiên cứu trọng tâm vào phát triển GABA thành thực phẩm chức Hiện nay, trình sản xuất GABA có nhiều đường khác chẳng hạn: tách chiết từ loại ngũ cốc, tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm, lên men đậu tương vi sinh vật Trong đó, trình sản xuất GABA lên men vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) ứng dụng rộng rãi có hiệu cao giới Đặc biệt, vi khuẩn axít lactic ứng dụng để lên men cho hàm lượng lớn GABA từ thực phẩm truyền thống tối ưu trình sản xuất GABA sử dụng vi khuẩn lactic axit mục tiêu công nghiệp Tại Việt Nam, nói chưa có công nghệ chế biến GABA có khả hướng tới quy mô công nghiệp Mặc dù, số công trình nghiên cứu sản xuất GABA nghiên cứu chưa có sản phẩm GABA bán thị trường Ngoài chưa có công trình nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích miễn dịch ổn định Việt Nam Hiện nay, hướng nghiên cứu ứng dụng chất có nguồn gốc tự nhiên để làm thực phẩm chức bắt đầu xuất Việt Nam Thực tế, sản phẩm tiếp cận thị trường sản phẩm phải đảm bảo chất lượng giá thành Để giải hai vấn đề lớn này, hướng nghiên cứu đề tài chọn nguồn nguyên liệu rẻ tiền sẵn có nước mà cung cấp đầy đủ thành phần để lên men GABA có hiệu suất cao Về chất lượng sản phẩm, nhóm nghiên cứu đề tài sử dụng chất thị thay đổi kênh ion clorua để kiểm tra hoạt tính tế bào Xuất phát từ sở khoa học thực tiễn tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo Lactobacillus” Nghiên cứu thực nhằm mục tiêu: + Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ + Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA 10 Tỉ 50 75 100 lệ tế bào sống DM 50 - 20 50 - 20 50 100 200 20 50 (µg/ml ) (µM) Hình 20: Khả bảo vệ tế bào PC12 dịch lên men chủng Lactobacillus plantarum KLEPT 3.3.2 Xác định GABA HPLC Thành phần GABA dịch lên men xác định phương pháp so màu Tuy nhiên, để khẳng định thêm độ xác GABA tạo thành tiến hành phân tích GABA dịch lên men phương pháp HPLC Bản thân GABA không hấp thụ ánh sáng nhìn thấy, UV hay huỳnh quang Chính vậy, để phân tích GABA HPLC cần phải chuyển GABA sang dẫn xuất có khả hấp thụ tốt UV vùng ánh sáng thường huỳnh quang mạnh để bắt sản phẩm Trước tiên, GABA chuẩn phân tích 56 giống phần phương pháp thiết bị HPLC Sau chạy sắc ký cho kết hình 21 Từ sắc ký đồ thu cho thấy GABA chuẩn sau đệm cho pick sau 19 phút 500 mAU 358nm,4nm (1.00) 400 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 Hình 21: Sắc ký đồ GABA chuẩn Tiến hành chạy sắc ký GABA chuẩn nồng độ: 10; 20; 30; 40; 50 µl xây dựng đường chuẩn GABA hình 22, đường chuẩn sở xác định nồng độ GABA mẫu dịch nghiên cứu Conc.(x10) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area Hình 22: Xây dựng đường chuẩn GABA qua HPLC Tiếp tục chạy sắc ký dịch lên men thô phần phương pháp, thu sắc ký đồ có nhiều pic khác (hình 23) Tuy nhiên, sắc ký đồ cho pick giống với pick GABA chuẩn sau 19 phút cột Điều cho phép khẳng định lần dịch lên men sinh GABA 57 mAU 150 358nm,4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men Sau chạy sắc ký mẫu dịch lên men thô, tiến hành chạy phân đoạn tách chiết sắc ký cột để kiểm tra độ tinh GABA mẫu dịch lên men, kết hình 24C pick xuất phút 19, pick GABA mẫu lên men 58 mAU 358nm,4nm (1.00) 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 A mAU 358nm,4nm (1.00) 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 B 500 mAU 358nm,4nm (1.00) 400 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 C Hình 24: Chạy phân đoạn tách chiết sắc ký cột 59 Để kiểm tra độ tinh mẫu dịch lên men chạy sắc ký mẫu lên men sau tinh với nồng độ 20 µl đưa vào đường chuẩn GABA, kết hình 25 cho thấy GABA mẫu dịch lên men sau tinh đạt độ tinh cao 96,7% Level Conc 10 20 30 40 50 Mean Area 2516827 6154657 9151430 12149212 16341778 S % RSD Area 2516827 6242833 9151430 12149212 16341778 124699.2 2.026095 Area 6066482 0 Conc.(x10) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area Hình 25: Đưa mẫu GABA tinh vào đường chuẩn để xác định độ tinh mẫu  Kết mẫu tinh đạt độ tinh cao 96,7 % 3.3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể 3.3.3.1 Nuôi cấy tế bào WSS-1 Việc nuôi tế bào WSS-1 phát triển vấn đề định đến trình thử hoạt tính GABA Chính vậy, tế bào tiến hành nuôi cấy điều kiện vô trùng nghiêm ngặt theo phần phương pháp Sau tế bào nuôi tủ nuôi cấy tế bào với tỉ lệ CO 5%, nhiệt độ 37°C quan sát kính hiển vi Kết hình 26A cho thấy tế bào dính kết tăng sinh nhiều sau 24 Tỉ lệ tế bào tiếp tục tăng sinh lên sau 48 (hình 26B) 60 A B Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh kính soi sau 24 nuôi cấy (A), sau 48 nuôi cấy (B) 3.3.3.2 Đánh giá hoạt tính GABA thông qua bắt màu Iot dòng tế bào WSS-1 Việc đánh giá hoạt tính GABA sau sản xuất định chất lượng toàn công nghệ sản xuất lên men từ dịch cám gạo sản phẩm tạo hoạt tính sản phẩm ý nghĩa dược tính tác động đến điều trị bệnh Chính vậy, việc đánh giá hoạt tính dựa vào tác động thụ thể GABA dòng tế bào WSS-1 có ý nghĩa vô quan trọng Chúng áp dụng dòng tế bào việc xác định hoạt tính sinh học dịch GABA sau lên men Tế bào phân chia vào giếng đĩa 96 giếng thao tác theo phần phương pháp Tế bào giếng đĩa 96 đem đo khả hấp thụ quang học bước sóng 405 nm Kết đọc ghi lại sử dụng phần Xcell cho kết hình 27 Từ kết cho thấy, tế bào không xử lý GABA khả hấp thụ Iot gần Tuy nhiên, tế bào xử lý GABA chuẩn nồng độ GABA lên men dạng thô khả thay đổi màu Iot rõ ràng 61 Hình 27: Kết thay đổi OD Iot dựa vào thay đổi nồng độ GABA lên men 3.3.3.3 Định lượng GABA dựa vào thay đổi màu iot Phương pháp định lượng GABA so màu thông thường cho kết xác áp dụng từ nhiều năm Tuy nhiên, việc định lượng không tác động lên đích thực hoạt động tế bào Chính vậy, thực phương pháp định lượng GABA dịch lên men phương pháp so màu với Iôt để từ mật độ quang thu suy nồng độ GABA đánh giá hoạt tính Điều có vai trò quan trọng trình phát triển thực phẩm chức để xác định sản phẩm có tác động thực lên đích tế bào hay không Để đánh giá xác hàm lượng GABA tạo thành dịch lên men cần phải xây dựng đường chuẩn GABA Dựa vào đường chuẩn đo hàm lượng GABA dịch lên men cách suy từ mật độ quang thu  Xây dựng đường chuẩn Một dải nồng độ GABA pha phần phương pháp Sau đó, nồng độ đưa vào đĩa có chứa tế bào WSS-1 Sau đó, tế bào đem đánh giá khả hấp thụ màu bước sóng 405 máy ELISA 6860 Kết 62 cho đường chuẩn GABA (hình 28) Dựa vào đường chuẩn này, suy nồng độ GABA mẫu cần đo OD405 Hình 28: Đường chuẩn nồng độ GABA mật độ quang bước sóng 405 nm  Xác định hàm lượng GABA dịch lên men Để đánh giá độ xác phương pháp định lượng thông qua thụ thể GABA phương pháp so màu Chúng lấy mẫu lên men đo hai phương pháp Kết bảng Từ kết cho thấy hàm lượng GABA đo hai phương pháp khác Như vậy, phương pháp đánh giá hàm lượng GABA thông qua thụ thể áp dụng phương pháp so với phương pháp so màu cho kết giống phương pháp có khả đánh giá hoạt tính GABA trực tiếp tế bào Bảng 9: Hàm lượng GABA dịch lên men theo hai phương pháp đo Phương pháp đánh giá GABA (mM) so màu thông thường 672 so màu iot 670 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài hoàn thành với kết sau: Quy trình lên men từ chủng Lactobacillus plantarum KLEPT môi trường dịch cám gạo đạt hiệu bổ sung thêm 1% NaCl, 1% glucose, 1% cao nấm men, 12% mỳ cho 10 lít dịch lên men Xác định thông số dùng lên men GABA thích hợp pH 6,5; nhiệt độ 340C; thời gian 96 h; tỉ lệ oxi 40% Đánh giá hoạt tính GABA trực tiếp tế bào theo phương pháp so màu Iot cho kết tương đương với phương pháp so màu thông thường Kiến nghị Tiếp tục hoàn thiện phương pháp tinh chế GABA công nghệ kết tinh Bước đầu đánh giá hiệu GABA động vật người Triển khai lên men dạng quy mô công nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt: Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kĩ thuật 64 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2007), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sư phạm Hà Nội Nguyễn Xuân Thắng (2002), Receptor màng tế bào tác dụng thuốc, NXB Y học, Hà Nội Tiếng anh: Abe Y., Umemura S., Sugimoto K.I., Hirawa N., Kato Y., Yokoyama N Yokoyama T., Junichi I., Masao I (1995), “Effect of green tea rich in γ -aminobutyric acid on blood pressure of Dahl salt-sensitive rats”, American Journal of Hypertens 8(1), 74-79 Ali F.W.O., Abdulamir A.S., Mohammed A.S., Bakar F.A., Manap Y.A., Zulkifli A.H., Saari N (2009), “Novel, Practical and Cheap Source for Isolating Beneficial gamma-Aminobutyric Acid-Producing Leuconostoc NC5 Bacteria”, Research Journal of Medical Science,3(4) 146-153 Bautista G.M., Lugay J.C., Cruz L.J., Juliano B.O (1964), “Glutamic acid decarboxylase activity as a viability index of artificial dried and stored rice”, Cereal Chem, 41 188-191 Cagno R D., Mazzacane F., Rizzello C.G., Angelis M.D., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D (2009), “Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications”, Appl Microbiol Biotechnol, 86 731-741 Connor M.A., Saunders R.M., Kohler G.O (1977), “Preparation and properties of protein concentrates obtained by wet alkali processing of rice bran”, Rice Byproducts Utilization International Conference, IACFT, Spain 10 Cross M L (2004), “Immune-signaling by orally-delivered probiotic bacteria: Effects on common mucosal immunoresponses and protection at distal mucosal sites”, J Immunopathol Pharmacol, 17 127-134 11 Chin H.S., Breidt F., Fleming H.P., Shin W.C., Yoon S.S (2006), “Identification of predominant bacterial isolates from the fermenting kimchi using ITS-PCR and partial 16S rDNA sequence analyses”, J Microbiol Biotechnol,16 68-76 12 Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C (2007), “Production of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells”, J Microbiol Biotechnol, 17 104-109 65 13 Choi S I., Lee J W., Park S M., Lee M Y., Ji G E., Park M S., Heo T R (2006), “Improvement of γ-aminobutyric acid (GABA) production using cell entrapment of Lactobacillus brevis”, J Microbiol Biotechnol, 16 562-568 14 Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., De Angelis M., Giuliani G., Meloni M., De Servi B., Gobbetti M (2009), "Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications", Appl Microbiol Biotechnol, 86 41731 15 Foester C.W., Foester H F (1973), “Glutamic acid decarboxylase in spores of Bacillus megaterium and its possible involvement in spore germination”, J Bacteriol, 114 1090-1098 16 Hayakawa K., Masayuki K., Yamori Y (2005), “Role of the renal nerves in γaminobutyric acid-induced anti-hypertensive effect in spontaneously hypertensive rats”, European Journal of Pharmacology, 524 120-125 17 Inglese J (2007), “High-throughput screening assays for the identification of chemical probes”, Nature chemical biology, 466-479 18 Jannoey P., Niamsup H., Lumyong S., Tajima S., Nomura M., Chairote G (2010), “γ-Aminobutyric Acid (GABA) Accumulations in Rice During Germination”, Chiang Mai J, 37(1) 124-133 19 Jeun J.H., Kim H.D., Lee H.S., Ryu B.H (2004), “Isolation and identification of Lactobacillus sp produced γ-aminobutyric acid (GABA) from traditional salt fermented anchovy”, Kor J Food Nutr, 72-79 20 Jin Z., Mendu S.K., Birnir B (2011), GABA is an effective immunomodulatory molecule, Amino Acids, 45 87-94 21 Kang M.S., Cho S.C., Kook M.C., Pyun Y.R., Choi C.I (2006), “Novel strains of Lactobacillus spp and method for preparing γ-aminobutyric acid using the same”, Korea Patent 10-0549094 22 Kayahara H., Sugiura T (2001), “Research on physiological function of GABA in recent years-improvement function of brain function and anti-hypertension”, Japanese Journal of Food development, 36(6) 4-6 66 23 Kim S.H., Shin B.H., Kim Y.H., Nam S.W., Jeon S.J (2007), “Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis BH2”, Biotechnol Bioprocess Eng, 12 707-712 24 Kinefuchi M., Sekiya M., Yamazaki A., Yamamoto K (1999), “Accumulation of GABA in brown rice by high pressure treatment”, Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 46 323-328 25 Komatsuzake N., Kawamoto S., Momose H., Kimura T (2005), "Production of γ aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods", Food Microbiol, 22 497-504 26 Komatsuzake N., Shima J., Kawamoto S., Momose H., Kimura T (2005), “Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods”, Food Microbial, 22 497-504 27 Kono I., Himeno K (2000), “Changes in γ-aminobutyric acid content during beni-koji making”, Biosci Biotechnol Biochem, 64 617-619 28 Kook M.C (2010), “Enhanced Production of γ-Aminobutyric Acid Using Rice Bran Extracts by Lactobacillus sakei B2-16”, J Microbiol Biotechnol, 20(4) 763-766 29 Lee H.Y., Park J.H., Seok S.H., Choi S.A., Baek M.W., Kim D.J., Lee Y., Park J.H (2004), “ Dietary intake of various lactic acid bacteria suppresses type helper T cell production in antigen-primed mice splenocyte”, J Microbiol Biotechnol, 14 167-170 30 Leroy F., De Vuyst L (2004), “Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry”, Trends Food Sci Technol, 15 67-78 31 Li H., Qiu T., Chen Y (2011), “Separation of gamma-aminobutyric acid from 32 fermented broth”, J Ind Microbiol Biotechnol, 38 1955-1959 H.X., Gao D.D., Cao Y.S., Xu H.Y (2008), “A high γ-aminobutyric acidproducing Lactobacillus brevis isolated from Chinese traditional paocai”, 33 Ann Microbiol, 58 649-653 Manyam B.V., Katz L., Hare T.A., Kaniefski K., Tremblay R.D (1981), “Isoniazid-induced elevation of cerebrospinal fluid (CSF) GABA levels and effects on chorea in Huntington’s disease”, Ann Neurol, 10 35-37 67 34 Nomura M., Fujita Y., Kobayashi M., Kimoto H., Suzuki I., Aso H (1999), "Lactococcus lactis contains only one glutamate decarboxylase gene", Microbiology,145 1375-1380 35 Nomura M., Kimoto H., Someya Y., Furukawa S., Suzuki I (1998), “Production of gamma-aminobutyric acid by cheese starters during cheese ripening”, J Dairy Sci, 81 1486-1491 36 Ohtsubo S., Asano S., Sato K., Matsumoto I (2000), “Enzymatic Production of v-Aminobutyric Acid Using Rice (Oryza sativa) Germ”, Food Sci Technol Res, 29 208-211 37 Park K.B., Oh S.H (2007), “ Production of yogurt with enhanced levels of gamma-aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract”, Bioresource Technolology, 98(8) 1675-1679 38 Park O (2007), "Cloning, sequencing and expression of a novel glutamate decarboxylase gene from a newly isolated lactic acid bacterium, Lactobacillus brevis OPK-3", Elsevier, 312-329 39 Parkash J., Kaur G (2007), “ Potential of PSA-NCAM in neuron-glial plasticity in the adult hypothalamus: Role of noradrenergic and GABAergic neurotransmitters”, Brain Research Bulletin, 74 317-328 40 Peter T Bosma., Martin A Collins., John D.D Bishop., I.G.P Guy Drouin., Kevin Docherty., Vance L Trudeau (1999), "Multiplicity of Glutamic Acid Decarboxylases (GAD) in Vertebrates: Molecular Phylogeny and Evidence for a New GAD Paralog", Soc Mol Biol Evol 397-404 41 Qui T., Li H., Cao Y (2010), “Pre-staining thin layer chromatography method for amino acid detection”, Afr J Biotechnol, 8679-8681 42 Ratanaburee A., Kantachote D., Charernjiratraku., Penjamras P., Chaiyasut C (2011), “ Enhancement of γ-aminobutyric acid in a fermented red seaweed beverage by starter culture Lactobacillus plantarum DW12”, Electronic Journal of Biotechnology,14 0717-3458 43 Roberts K.A., Wright J.W., Harding J.W (1993), “GABA and bicucullineinduced blood pressure changes in spontaneously hypertensive rats”, J Cardiovasc Pharmacol, 21 156-162 68 44 Sereewatthanawut I., Prapintip S., Watchiraruji., Goto M., Sasaki M., Shotipruk A (2006), “Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysis”, Bioresource Technology, 99 555-561 45 Siragusa S., De Angelis M., Di Cagno R., Rizzello C.G., Coda R., Gobbetti M (2007), “Synthesis of gamma-Aminobutyric Acid by Lactic Acid Bacteria Isolated from a Variety of Italian Cheeses”, Applied and Environmental Microbiology, 73 7283-7290 46 Stanton H.C (1963), “Mode of action of gamma amino butyric acid on the cardiovascular system”, Arch Int Pharmacodyn, 143, tr 195-204 47 Sun T.S., Zhao S.P., Wang H.K., Cai C.K., Chen Y.F., Zhang H.P (2009), “ACE-inhibitory activity and gamma-aminobutyric acid content of fermented skim milk by Lactobacillus helveticus isolated from Xinjiang koumiss in China”, Eur Food Res Technol, 228 607-612 48 Sun Z., Chen X., Wang J., Zhao W., Shao Y., Guo Z., Zhang X., Zhou Z., Sun T., Wang L., Meng H., Zhang H., Chen W (2011), "Complete Genome Sequence of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Strain ND02", J Bacteriol, 193(13) 3426-3427 49 Tang W, Wildey M.J (2004), “Development of a colorimetric method for functional chloride channel assay”, J Biomolecular Screening, 607-613 50 Tsai J.S., Lin Y.S., Pan B.S., Chen T.J (2006), “ Antihypertensive peptides and gamma-aminobutyric acid from prozyme facilitated lactic acid bacteria fermentation of soymilk”, Process Biochem, 41 1282-1288 51 Ueda Y., Doi T., Nagatomo K., Tokumaru J., Takaki M., Willmore L.J (2007), “Effect of levetiracetam on molecular regulation of hippocampal glutamate and GABA transporters in rats with chronic seizures in-duced by amygdalar FeCl injection”, Brain Research, 1151 55-61 52 Waagepetersen S (2004), Gamma-aminobutyric acid (GABA), sciencedirect 53 Wang M., Hettiarchchy N.S., Qi M., Burks W., Siebenmorgen T (1999), “Preparation and functional properties of rice bran protein isolate”, J Agric Food Chem, 47 411-416 54 Wong C.G., Bottiglieri T., Snead O.C (2003), “GABA, γ-hydroxybutyric acid and neurological disease”, Ann Neurol, 54 S3-S12 69 55 Yamakoshi J., Fukuda S., Satoh T., Tsuji R., Salto M., Obata A., Matsuyama A., Kikuchi M., Kawasaki T (2007), “Antihypertensive and natriuretic effect of less-sodium soy sauce containing gamma-aminobutyric acid in spontaneously hypertensive rats”, Biosci Biotechnol Biochem, 71 165-173 56 Yang S.Y., Lu F.X., Lu Z.X., Bie X.M., Jiao Y, Sun L.J, Yu B (2008), “Production of gamma-aminobutyric acid by Streptococcus salivariussubsp thermophilus Y2 under submerged fermentation”, Amino Acids, 34 473-478 57 Zhang G., Bown A.W (1997), “The rapid determination of γ-aminobutyric acid”, Phytochemistry, 44 1007-1009 58 59 60 61 70 ... bào Xuất phát từ sở khoa học thực tiễn tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ- Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo Lactobacillus Nghiên cứu thực nhằm mục tiêu: + Xây dựng quy trình. .. trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 43 Hình 16: Ảnh hưởng ôxy tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 44 Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÝ THỊ KIM TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ- AMINOBUTYRIC AXIT TỪ DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114