BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO THỊ HỒNG VÂN NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT BẢN ĐỊA NHẰM XỬ LÝ NƢỚC THẢI SINH HOẠT ĐÔ THỊ HÀ NỘI Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học thực phẩm Hà Nội - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO THỊ HỒNG VÂN NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT BẢN ĐỊA NHẰM XỬ LÝ NƢỚC THẢI SINH HOẠT ĐÔ THỊ HÀ NỘI Chuyên ngành Mã số : Công nghệ sinh học thực phẩm : 62.54.02.05 Luận án tiến sĩ kỹ thuật Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Cách GS.TS Đặng Thị Thu Hà Nội - 2012 Lời cảm ơn ! Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Cách GS.TS Đặng Thị Thu, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Liên Hà TS Nguyễn Lan Hương, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội quan tâm giúp đỡ suốt trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lương Hữu Thành cán phòng Sinh học môi trường, Viện Môi trường nông nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ trình thực nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trường đồng nghiệp khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện, quan tâm, chia sẻ động viên suốt thời gian qua Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình bè bạn, người động viên, góp ý tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày… tháng … năm 2012 Đào Thị Hồng Vân LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết thí nghiệm trình bày luận án trung thực Một phần số liệu đăng tạp chí khoa học chuyên ngành trong: “Danh mục công trình khoa học công bố có liên quan đến luận án”, số liệu khác đồng ý cho phép sử dụng đồng tác giả phần lại kết luận án Hà Nội, ngày tháng Tác giả Đào Thị Hồng Vân năm 2012 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN 1.1 Nƣớc thải đô thị Hà Nội 1.1.1 Nguồn gốc nƣớc thải đô thị Hà Nội 1.1.2 Đặc tính nƣớc thải đô thị Hà Nội 1.1.3 Hiện trạng nước thải đô thị Hà Nội 1.2 Thành phần nƣớc thải đô thị Hà Nội 10 1.2.1 Các chất hữu nước thải đô thị .10 1.2.1.1 Protein trình chuyển hoá protein nước thải .12 1.2.1.2 Tinh bột trình chuyển hoá tinh bột nước thải 13 1.2.1.3 Lipid (chất béo) trìnhchuyển hoá lipid nước thải 14 1.2.2 Các hợp chất vô nước thải đô thị 15 1.2.2.1 Các hợp chất nitơ vô .15 1.2.2.2 Các hợp chất phospho 19 1.2.2.3 Các nguyên tố kim loại 20 1.2.3 Vi sinh vật nước thải đô thị 20 1.2.4 Chất rắn nước thải đô thị 24 1.3 Các giải pháp công nghệ xử lý nƣớc thải đô thị .25 1.3.1 Tổng quan giải pháp công nghệ xử lý nước thải đô thị .25 1.3.2 Giải pháp vi sinh vật xử lý nước thải đô thị .27 1.3.3 Các giải pháp công nghệ vi sinh ứng dụng xử lý nước thải 29 1.3.3.1 Phương pháp xử lý hiếu khí .30 1.3.3.2 Phương pháp xử lý kỵ khí 32 1.3.3.3 Phương pháp xử lý thiếu khí 33 1.3.3.4 Hệ thống xử lý sinh học nước thải phối hợp .33 1.3.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật phát triển giải pháp công nghệ xử lý nước thải Việt Nam 35 1.3.4.1 Nghiên cứu phát triển chế phẩm vi sinh để xử lý nước thải .35 1.3.4.2 Nghiên cứu thử nghiệm phát triển giải pháp CN xử lý nước thải 38 1.3.4.3 Công nghệ vi sinh xử lý nước thải tích hợp tiết kiệm lượng 41 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Vật liệu .46 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .46 2.1.2 Hoá chất thí nghiệm 46 2.1.3 Thiết bị 47 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 47 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu .47 2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 47 2.2.2.1 Phân lập .47 2.2.2.2 Xác định hoạt tính .48 2.2.2.3 Xác định mật độ tế bào 48 2.2.2.4 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật 48 2.2.2.5 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (phương pháp bề mặt đáp ứng) 49 2.2.3 Phương pháp xác định tiêu nước 50 2.2.3.1 Xác định BOD5 50 2.2.3.2 Xác định COD .51 2.2.3.3 Xác định hàm lượng nitrit 51 2.2.3.4 Xác định hàm lượng nitrat 51 2.2.3.5 Phân tích phospho tổng số .52 2.2.3.5 Xác định nitơ tổng 53 2.2.3.7 Xác định hàm lượng tổng chất rắn lơ lửng 54 2.2.3.8 Xác định coliform 55 2.2.4 Định tên vi sinh vật 55 2.2.4.1 Sử dụng kit chuẩn API 50 CHB 55 2.2.4.2 Phân tích đoạn gen 16S rRNA .55 2.2.5 Phân tích đa dạng vi khuẩn kỹ thuật DGGE 57 2.2.5.1 Tách chiết DNA tổng số từ bùn hoạt tính .57 2.2.5.2 Điện di DNA gel agarose .58 2.2.5.3 Khuếch đại đoạn DNA phản ứng PCR 58 2.2.5.4 Điện di gel gradient biến tính DGGE .59 2.2.6 Phương pháp xử lý nước thải 60 2.2.6.1 Xử lý gián đoạn .60 2.2.6.2 Xử lý liên tục quy mô nhỏ .60 2.2.6.3 Xử lý liên tục trường .60 2.2.6.4 Xác định hiệu suất xử lý 61 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 3.1 Xác định đặc trƣng nƣớc thải sinh hoạt đô thị sông Tô Lịch Kim Ngƣu, Hà Nội 62 3.1.1 Đặc trưng chung .62 3.1.2 Nhận diện vi khuẩn có tiềm xử lý ô nhiễm .65 3.2 Phân lập, tuyển chọn số chủng vi sinh vật thích ứng để xử lý nƣớc thải sinh hoạt đô thị 66 3.2.1 Phân lập tuyển chọn vi sinh vật phân huỷ hợp chất hữu 67 3.2.2 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật nitrat hoá 70 3.3 Định tên chủng vi sinh vật tuyển chọn .73 3.4 Xác định các điều kiện lên men thu sinh khối vi khuẩ n 80 3.4.1 Lên men thu sinh khối, quy mô phòng thí nghiệm 80 3.4.1.1 Lựa chọn môi trường xác định ảnh hưởng thời gian lên men 80 3.4.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến lên men thu sinh khối 83 3.4.1.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến lên men thu sinh khối 84 3.4.1.4 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 86 3.4.1.5 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối vi khuẩn 87 3.4.2 Lên men thu sinh khối, quy mô lít 91 3.4.2.1 Ảnh hưởng tốc độ cấp khí 91 3.4.2.2 Xác định thời gian lên men thu sinh khối 93 3.5 Tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải sinh hoạt 95 3.5.1 Kiểm tra sự tương hỗ hai chủng vi khuẩn thí nghiê ̣m 95 3.5.2 Tạo chế phẩm vi sinh vật 96 3.5.3 Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm 100 3.6 Sử dụng chế phẩm BioV1 xử lý nƣớc thải phòng thí nghiệm 101 3.7 Hoàn thiện quy trình công nghệ sử dụng chế phẩm BioV1 thải sinh hoạt đô thị quy mô nhỏ 104 3.7.1 Ảnh hưởng pH nước thải đến hiệu suất xử lý 106 3.7.2 Ảnh hưởng lượng oxy hòa tan đến hiệu suất xử lý 107 3.7.3 Ảnh hưởng thời gian lưu nước đến hiệu suất xử lý 108 3.7.4 Ảnh hưởng lượng chế phẩm bổ sung đến hiệu suất xử lý 109 3.7.5 Hoàn thiện quy trình công nghệ xử lý thử nghiệm (quy mô nhỏ) 110 3.8 Ứng dụng chế phẩm BioV1 xử lý thử nghiệm trƣờng 113 3.9 Đánh giá tồn vi khuẩn kỹ thuật DGGE 118 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN PHỤ LỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT BOD5 Biochecmical oxygen demand = Nhu cầu oxy hóa sinh hóa COD Checmical oxygen demand = Nhu cầu oxy hóa hóa học TSS Total Suspended Solids = Tổng chất rắn lơ lửng MLSS Mixed Liquor Suspended Solids = Chất rắn lơ lửng bùn lỏng hỗn hợp TDS Total Dissolved Solids = Tổng chất rắn hòa tan DO Disolved oxygen = Oxy hòa tan F/M Food/Microoganism DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis = điện di gel gradient biến tính PCR Polymerase Chain Reaction = Phản ứng chuỗi trùng hợp dNTP Deoxynucleoside triphosphates rDNA Acid deoxyribonucleic ribosom bp Base pair = Cặp bazơ CFU Clony Forming Unit = Đơn vị hình thành khuẩn lạc EM Effective microorganisms = vi sinh vật hữu hiệu TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam QCVN Quy chuẩn Việt Nam BTNMT Bộ tài nguyên môi trường XLNT Xử lý nước thải TNHHNNMTV Trách nhiệm hữu hạn nhà nước thành viên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Kết phân tích nước thải sông, hồ nội thành Hà Nội Bảng 3.1: Kết phân tích chất lượng nước sông Tô Lịch Kim Ngưu 63 Bảng 3.2: Hoạt tính phân giải hợp chất hữu chủng phân lập 68 Bảng 3.3: Kết thử nghiệm xử lý gián đoạn nước thải sinh hoạt 69 Bảng 3.4 Hoạt tính oxy hóa hợp chất chứa nitơ chủng vi khuẩn 71 Bảng 3.5: Khả nitrat hoá chủng HA1 HD5 nước thải sinh hoạt đô thị điều kiện phòng thí nghiệm 72 Bảng 3.6: Đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật tuyển chọn 73 Bảng 3.7: Kết kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn gram dương tuyển chọn dựa kit API 50CHB 75 Bảng 3.8: So sánh mức độ tương đồng gen 16S rRNA chủng tuyển chọn với GenBank 76 Bảng 3.9: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến phát triển chủng A L6 81 Bảng 3.10: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến phát triển chủng HA1 HD5 82 Bảng 3.11: Ma trận thí nghiệm kết 87 Bảng 3.12: Phân tích phương sai Anova mô hình 88 Bảng 3.13: Điều kiện lên men thu sinh khối vi sinh vật 94 Bảng 3.14: Ảnh hưởng chất mang đến tỷ lệ tế bào sống sót 98 Bảng 3.15: Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn sinh khối chất mang 99 Bảng 3.16: Tỷ lệ sống sót vi khuẩn chế phẩm sau thời gian bảo quản 100 Bảng 3.17: Kết phân tích thành phần nước trước xử lý 102 Bảng 3.18: Thử nghiệm chế phẩm BioV1 xử lý gián đoạn quy mô 80 lít 103 Bảng 3.19: Thử nghiệm chế phẩm BioV2 xử lý gián đoạn quy mô 80 lít 104 Bảng 3.20: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất xử lý 106 Bảng 3.21: Ảnh hưởng DO đến hiệu suất xử lý 107 Bảng 3.22: Kết phân tích chất lượng nước sau xử lý liên tục quy mô 200 lít 111 Hòa tan 0,1 gam α-naphtyamin 200 ml nước cất, đun cách thủy bếp khoảng 30 phút cho tan hết Sau để nguội, thêm 150 ml CH 3COOH 12% Chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn NaNO2: Hòa tan 0.1497 gam NaNO2 tinh khiết hóa học sấy khô 150 oC nước cất, pha loãng đến vạch định mức lít, ml có chứa 0.1 mg nitrit - Dung dịch lugol: 1g I2 + 2g KI pha 100 ml nước - Dung dịch axit phenol disulfonic: Hòa tan 50 gam phenol 100 ml axit sunfuric đặc, đun hồi lưu hỗn hợp dung dịch khoảng 1-2 để tan hết phenol Sau để nguội, dung dich thu có màu nâu đỏ, sánh, bảo quản lọ tối màu - Dung dịch Amoniac đặc (25%) - Dung dịch chuẩn KNO3: Hòa tan 1,629g KNO3 tinh khiết sấy khô đến khối lượng không đổi 105-110oC 2h nước cất bình định mức dung tích 1000ml Trong 1ml dung dịch có 1mg nitrat - Dung dịch photphat tiêu chuẩn có nồng độ photpho 10mg/l: Hòa tan 219.5mg KH2PO4 khan (sấy khô 105oC 1giờ) nước cất định mức lên 1lít Dung dịch có nồng độ photpho 50mg/l Sau tiếp tục pha loãng nước cất để dung dịch nồng độ photpho 10mgP/l - Chỉ thị màu phenolphthalein 0.1% - Thuốc thử amon molipđat: Hòa tan 25g (NH4)Mo7O24.4H2O 175ml nước cất 50oC, để lắng (lọc cần) Hòa 280ml H2SO4 đậm đặc vào 400ml nước cất, để nguội, sau cho dung dịch molipdat vào pha loãng đến 1lít - Dung dịch thiếc (II) clorua: Hòa tan 2.5g SnCl2.H2O 100ml glycerol Đun nóng nồi cách thủy khuấy cho tan hết - Axit clohidric, d = 1,18g/ml - Natri hidroxit, khoảng 500g/l - Axit clohidric, dung dịch tiêu chuẩn 0,02mol/l Pha chế dung dịch cách pha loãng axit clohidric (dung dịch tiêu chuẩn 0,02mol/l) định chuẩn phương pháp thông thường Có thể dùng dung dịch chuẩn có bảo đảm thị trường - Dung dịch axit boric/ thị - 138 - Hoà tan 0,5  0,1 metyl đỏ vào khoảng 800ml nước pha loãng thành lít ống đong Hoà tan 1,5  0,1g xanh metylen vào khoảng 800ml nước rồipha loãng thành lít ống đong Hoà tan 20  1g axit boric (H3BO3) nước ấm Để nguội đến nhiệt độ phòng Thêm 10  0,5ml dung dịch metyl đỏ 2,0  0,1ml xanh metylen (5.7.2) pha loãng thành lít ống đong PHỤ LỤC Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B licheniformis A6 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 tcccccctga ggctaatacc accacttaca cgacgatgcg gactcctacg acgccgcgtg taccgttcga tgccagcagc cgcgcgcagg ttggaaactg atgcgtagag tgaggcgcga cgatgagtgc actccgcctg caagcggtgg atcctctgac tggttgtcgt tgatcttagt ggaaggtggg caatgggcag tcaagttcgg gtacacgtgg ggatgcttga gatggacccg tagccgacct ggaggcagca agtgatgaag atagggcggt cgcggtaata cggtttctta gggaacttga atgtggagga aagcgtgggg taagtgttag gggagtacgg agcatgtggt aaccctagag cagctcgtgt tgccagcatt gatgacgtca aacaaagggc atcgcagtcc gtaacctgcc ttgaaccgca cggcgcatta gagagggtga gtagggaatc gttttcggat accttgacgg cgtaggtggc agtctgatgt gtgcagaaga acaccagtgg agcgaacagg agggtttccg tcgcaagact ttaattcgaa atagggcttc cgtgagatgt cagttgggca aatcatcatg agcgaagccg gcaactcgac - 139 - tgtaagactg tggttcaatt gctagttggt tcggccacac ttccgcaatg cgtaaaactc tacctaacca aagcgttgtc gaaagccccc ggagagtgga cgaaggcgac attagatacc ccctttagtg gaaactcaaa gcaacgcgaa cccttcgggg tgggttaagt ctctaaggtg ccccttatga cgaggctaag tgcgtgaagc ggataactcc ataaaaggtg gaggtaacgg tgggactgag gacgaaagtc tgttgttagg gaaagccacg cggaattatt ggctcaaccg attccacgtg tctctggtct ctggtagtcc ctgcagcaaa ggaattgacg gaaccttacc gcagagtgac cccgcaacga actgccggtg cctgggctac ccaatcccac aggaccgcgt gggaaaccgg gcttttagct ctcaccaagg acacggccca tgacggagca gaagaacaag gctaactacg gggcgtaaag gggagggtca tagcggtgaa gtactgacgc acgccgtaaa cgcattaagc ggggcccgca aggtcttgac aggtggtgca gcgcaaccct acaaaccgga acacgtgcta aaatctgttc agtaacggtg 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B subtilis L6 tgctccctga gggataactc cataaaaggt gaggtaacgg tgggactgag gacgaaagtc tgttgttagg gaaagccacg cggaattatt ggctcaaccg attccacgtg tctctggtct cctggtagtc gctgcagcta aggaattgac agaaccttac ggcagagtga tcccgcaacg gactgccggt acctgggcta tgttagcggc cgggaaaccg ggcttcggct ctcaccaagg acacggccca tgacggagca gaagaacaag gctaactacg gggcgtaaag gggagggtca tagcggtgaa gtaactgacg cacgccgtaa acgcattaag gggggcccgc caggtcttga caggtggtgc agcgcaaccc gacaaaccgg cacacgtgct ggacgggtga gggctaatac accacttaca caacgatgcg gactcctacg acgccgcgtg taccgttcga tgccagcagc ggctcgcagg ttggaaactg atgcgtagag ctgaggagcg acgatgagtg cactccgcct acaagcggtg catcctctga atggttgtcg ttgatcttag aggaaggtgg acaatggaca gtaacacgtg cggatggttg gatggacccg tagccgacct ggaggcagca agtgatgaag atagggcggt cgcggtaata cggtttctta gggaacttga atgtggagga aaagcgtggg ctaagtgtta ggggagtacg gagcatgtgg caatcctaga tcagctcgtg ttgccagcat ggatgacgtc gaacaaaggg ggtaacctgc tttgaaccgc cggcgcatta gagagggtga gtagggaatc gttttcggat accttgacgg cgtaggtggc agtctgatgt gtgcagaaga acaccagtgg gagcgaacag gggggtttcc gtcgcaagac tttaattcga gataggacgt tcgtgagatg tcagttgggc aaatcatcat cagcgaaacc ctgtaagact atggttcaaa gctagttggt tcggccacac ttccgcaatg cgtaaagctc tacctaacca aagcgttgtc gaaagccccc ggagagtgga cgaaggcgac gattagatac gccccttagt tgaaactcaa agcaacgcga ccccttcggg ttgggttaag actctaaggt gccccttatg gcgaggttaa Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Nitrosomonas europea HA1 gcggcatgct gcgaacgggt tgtgctaata ggagcggccg gtagttggtc gggaggcagc gagtgaagaa ataattgtga cgcggtaata cggtcttgca caaggctaga atgtggaaga aaagcgtggg ctagttgtcg ggggagtacg gattatgtgg atctaatgga cgtcagctcg aattgctatc tggggatgac cgtgtacaga cggatcggag atgccgcggt ttacacatgc gagtaataca ccgcatatct atgtctgatt tgagaggacg agtggggaat ggccttcggg tttatgacgg cgtagggtgc agtcagatgt gtgcagcaga acaccgatgg gagcaaacag gatctaatta gtcgcaagat attaattcga gacataagag tgtcgtgaga atttttaatg gtcaagtcct gggttgccaa tctgcaactc gaatacgttc aagtcgaacg tcggaacgtg ctgaggagaa agctagttgg gccaaccaca tttggacaat ttgtaaagct taccgacaga gagcgttaat gaaagccccg ggggagtgga cgaaggcagc gattagatac aggatttggt taaaactcaa tgcaacgcga tacccgaaag tgttgggtta agcactttag catggccctt cccgcgaggg gactccgtga ccgggtcttg gcagcggggg tccttaagtg aagcagggga tggggtaaag ctgggactga gggcgaaagc cttttagtcg aaaagcaccg cggaattact ggcttaacct attccatgtg tccctgggtt cctggtagtc aacgtagcta aggaattgac aaaaccttac ggagccaaga agtcccgcaa tgagactgcc atgggtaggg ggagccaatc agtcggaatc tacacaccgc - 140 - cttcggcctg gggaataacg tcgcaagacc gcttaccaag gacacggccc ctgatccagc gaaagaaaga gctaactacg gggcgtaaag gggaattgcg tagcagtgaa gacactgacg cacgccctaa acgcgtgaag ggggacccgc ctacccttga cacaggtgct cgagcgcaac ggtgacaaac cttcacacgt tcagaaagca gctagtaatc ccgtcacacc ccggcgagtg catcgaaaga ttgcgctaaa gcaacgatca agactcctac catgccgcgt gttgcaatga tgccagcagc ggtgcgcagg tttgaaacta atgcgtagag ctcatgcacg acgatgtcaa ttgaccgcct acaagcggtg catgcttgga gcatggctgt ccttgtcact cggaggaagg aatacaatgg cgtcgtagtc gcggatcagc atg 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Nitrobacter vulgaris HD5 agcgaacgct ggcagacggg ttgtgctaat gtctgattag agaggatgat tggggaatat ccctagggtt ccggctaact actgggcgta ctccagaact gtgtagaggt cccgatactg gtccacgccg aacgctttaa cgggggcccg ccagcccttg gcacaggtgc acgagcgcaa ggtgataagc gctacacacg ctcaaaaaac ggcggcaggc tgagtaacgc accggataag cttgttggtg cagccacatt tggacaatgg gtaaagctct tcgtgccagc aagggtgcgt gcctttgata gaaattcgta acgctgaggc taaacgatga gcattccgcc cacaagcggt acatgtccat tgcatggctg cccccgtcct cgcgaggaag tgctacaatg cgtctcagtt ttaacacatg gtgggaacgt cccttacggg aggtaatggc gggactgaga gcgcaagcct tttgtgcggg agccgcggta aggcgggtct ctgaggatct gatattcgca acgaaagcgt atgccagccg tggggagtac ggagcatgtg gaccggtcgc tcgtcagctc tagttgctac gtggggatga gcggtgacaa cggattgggc caagtcgaac accttttggt gaaagattta tcaccaaggc cacggcccaa gatccagcca aagataatga atacgaaggg ttaagtcaga tgagttcggg agaacaccag ggggagcaaa ttagtgggtt ggtcgcaaga gtttaattcg agagatgtga gtgtcgtgag catttagttg cgtcaagtcc tgggaagcaa tctgcaaccc gggcgtagca tcggaacaac tcgccgaaag gacgatcagt actcctacgg tgccgcgtga cggtaccgca ggctagcgtt ggtgaaatcc agaggtgagt tggcgaaggc caggattaga tactcactag ttaaaactca acgcaacgcg ccttctcttc atgttgggtt agcactctaa tcatggccct aggggcaacc gagcccatga atacgtcagt acagggaaac atcggcccgc agctggtctg gaggcagcag gtgatgaagg agaataagcc gctcggaatt tggagctcaa ggaactgcga ggctcactgg taccctggta tggcgcagct aaggaattga cagaacctta ggagcatgga aagtcccgca ggagactgcc tacgggctgg cctagcaaat agttggaatc PHỤ LỤC Dựng đƣờng chuẩn nitrit nitrat * Dựng đường chuẩn nitrit: Chuẩn bị dãy ống nghiệm khô có kích thước, cho vào ống nghiệm hóa chất với thể tích bảng 1-PL đây, lắc ống nghiệm, để yên 10 phút đem đo quang bước sóng 520 nm Bảng 1-PL: Cường độ quang dung dịch ống nghiệm mẫu chuẩn nitrit Ống nghiệm Dung dịch (ml) Nước cất (ml) Axit sunfanilic (ml) α-naphtylamin (ml) Nồng độ Nitrit (mg/l) 0,0 5,0 1 0,0 0,5 4,5 1 0,1 1,0 4,0 1 0,2 1,5 3,5 1 0,3 2,0 3,0 1 0,4 - 141 - 2,5 2,5 1 0,5 3,0 2,0 1 0,6 3,5 1,5 1 0,7 4,0 1,0 1 0,8 10 4,5 0,5 1 0,9 11 5,0 0,0 1 1,0 Hình 1-PL: Đƣờng chuẩn nitrit 0.7 y = 0.6024x + 0.0026 R2 = 0.9956 0.6 ABS 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nồng độ Nitrit (m g/L) - Dựng đường chuẩn nitrat: Chuẩn bị 11 ống nghiệm khô có kích thước, dung tích 25ml, cho vào ống nghiệm hóa chất bảng sau: Bảng 2-PL: Cường độ quang dung dịch ống nghiệm mẫu chuẩn nitrat Ống nghiệm Dung dịch (ml) Nước cất (ml) Amoniac (ml) Nồng độ Nitrat (mg/l) 5,0 Phenol disulfonic (ml) 0,5 0,0 0,5 4,5 0,5 1,0 4,0 0,5 1,5 3,5 0,5 5 2,0 3,0 0,5 2,5 2,5 0,5 5 3,0 2,0 0,5 - 142 - 3,5 1,5 0.5 4,0 1,0 0,5 10 4,5 0,5 0,5 11 5,0 0,5 10 Hình 2-PL: Đƣờng chuẩn nitrat 0.3 y = 0.0242x + 0.0055 R2 = 0.9983 OD 410nm 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 12 Nồng độ Nitrat (mg/l) PHỤ LỤC Kết tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus subtilis L6: Bảng 3-PL Ma trận thí nghiệm kết STT Nhiệt độ (oC) pH Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ tế bào (lg CFU/ml) 10 11 12 33 27 30 30 33 30 30 30 27 33 27 30 7 7 7 8 42 42 48 54 54 48 42 48 48 48 54 54 8.27 8.72 9.35 7.71 8.65 9.34 7.5 9.36 7.40 7.31 8.7 7.81 - 143 - 13 14 15 16 17 30 27 33 30 30 8 48 48 48 42 48 9.39 7.79 7.37 7.72 9.32 Bảng 4-PL Phân tích phương sai Anova mô hình Thông số Phương sai Chuẩn F Giá trị p (khả > F) 1.16 0.13 0.053 0.054 0.051 0.040 0.003 1.02 8.16 0.32 0.0002 2576.32 282.91 117.18 120.81 112.32 88.75 7.99 2263.64 18107.96 705.20 0.24 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0.0255 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,867 Mô hình A-Nhiệt độ B-pH C-Thời gian AB AC BC A2 B2 C2 Không tương thích Phương trình hồi quy: Y (mật độ tế bào) = +9.35 -0.13 +0.081 +0.082 -0.11 +0.10 -0.030 -0.49 -1.39 -0.27 *A *B *C *A*B *A*C *B*C * A2 * B2 * C2 - 144 - Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 9.39 Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 9.39 7.31 9.5 7.31 9.5 X1 = A: Nhiet X2 = C: Thoi gian 9 M a t d o te b a o Actual Factor C: Thoi gian = 48.00 M a t d o te b a o X1 = A: Nhiet X2 = B: pH Actual Factor B: pH = 7.00 8.5 7.5 8.5 7.5 7 8.00 54.00 33.00 33.00 32.00 7.50 32.00 51.00 31.00 31.00 7.00 B: pH 48.00 30.00 29.00 6.50 C: Thoi gian A: Nhiet 28.00 30.00 (a) Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 9.39 (b) Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao 7.31 9.5 X1 = B: pH X2 = C: Thoi gian Perturbation 9.5 Actual Factors A: Nhiet = 30.00 B: pH = 7.00 C: Thoi gian = 48.00 C 8.5 M a t d o te b a o M a t d o te b a o A: Nhiet 28.00 42.00 27.00 6.00 27.00 Actual Factor A: Nhiet = 30.00 29.00 45.00 7.5 AC A 8.5 B B 7.5 54.00 8.00 51.00 7.50 48.00 C: Thoi gian 7.00 45.00 6.50 B: pH -1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000 42.00 6.00 (d) Deviation from Reference Point (Coded Units) (c) Hình 3-PL Ảnh hưởng yếu tố đến mật độ tế bào chủng B licheniformis A6 Kết tối ưu hóa phần mềm Design Expert Version 8.0.6.1 sau: - Nhiệt độ: 29,64oC - pH = 7,03 - Thời gian nuôi cấy: 48,76 - Mật độ tế bào đạt: 2,4x109 CFU/ml (lg CFU/ml = 9,37) - 145 - Với phương án tối ưu này, yêu cầu yếu tố ảnh hưởng đạt Desirability 100% mong muốn, mục tiêu mật độ tế bào mục tiêu chung đạt 98,85% mong muốn A:Nhiet B:pH C:Thoi gian 0.988495 Mat te bao 0.988495 Combined 0.000 0.250 0.500 0.750 1.000 Hình 4-PL Mức độ đáp ứng mong đợi Kết tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng Nitrosomonas europea HA1: Bảng 5-PL Ma trận thí nghiệm kết STT Nhiệt độ (oC) pH Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ tế bào (lg CFU/ml) 10 11 12 13 14 15 16 17 33.00 27.00 30.00 33.00 33.00 30.00 27.00 30.00 30.00 30.00 30.00 30.00 33.00 30.00 27.00 30.00 27.00 8.00 8.00 8.00 9.00 7.00 8.00 7.00 7.00 8.00 8.00 8.00 9.00 8.00 7.00 9.00 9.00 8.00 120.00 72.00 96.00 96.00 96.00 96.00 96.00 72.00 96.00 96.00 96.00 120.00 72.00 120.00 96.00 72.00 120.00 7.85 7.15 8.70 7.51 7.80 8.65 7.09 7.10 8.70 8.68 8.72 8.10 7.48 8.15 7.98 7.78 8.19 Bảng 6-PL Kết phân tích hồi quy - 146 - Thông số Phương sai Chuẩn F Mô hình A-Nhiệt độ B-pH C-Thời gian AB AC BC A2 B2 C2 0.60 0.0066 0.19 0.97 0.35 0.11 0.13 1.54 1.01 0.73 385.53 4.24 121.17 618.98 223.04 71.91 85.36 987.47 647.75 470.25 Giá trị p (khả > F) < 0.0001 0.0786 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 Không tương thích 0.0027 3.87 0.1121 Y (mật độ tế bào) = +8.69 +0.029 +0.15 +0.35 -0.30 -0.17 -0.18 -0.60 -0.49 -0.42 *A *B *C *A*B *A*C *B*C * A2 * B2 * C2 Kết tối ưu hóa phần mềm Design Expert Version 8.0.6.1 sau: - Nhiệt độ: 29,52oC - pH = 7,99 - Thời gian nuôi cấy: 108,66 - Mật độ tế bào đạt: 5,6x108 CFU/ml (lg CFU/ml = 8,75) Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 8.72 Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 8.72 7.09 7.09 9 X1 = A: Nhiet X2 = C: Thoi gian 8.5 M a t d o te b a o Actual Factor C: Thoi gian = 96.00 M a t d o te b a o X1 = A: Nhiet X2 = B: pH Actual Factor B: pH = 8.00 7.5 9.00 8.5 7.5 33.00 32.00 8.50 8.00 B: pH 120.00 31.00 33.00 112.00 30.00 32.00 104.00 29.00 7.50 28.00 7.00 31.00 96.00 A: Nhiet 30.00 88.00 C: Thoi gian 27.00 29.00 80.00 28.00 72.00 (a) (b) - 147 - 27.00 A: Nhiet Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 8.72 Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Perturbation 7.09 8.5 C M a t d o te b a o M a t d o te b a o X1 = B: pH X2 = C: Thoi gian Actual Factor A: Nhiet = 30.00 Actual Factors A: Nhiet = 30.00 B: pH = 8.00 C: Thoi gian = 96.00 7.5 8.5 B A C B A 7.5 120.00 9.00 112.00 8.50 104.00 96.00 8.00 88.00 C: Thoi gian 7.50 80.00 B: pH 72.00 7.00 -1.000 (c) -0.500 0.000 0.500 1.000 (d) Deviation from Reference Point (Coded Units) Hình 6-PL Ảnh hưởng yếu tố đến mật độ tế bào chủng Nitrosomonas europea HA1 Với phương án tối ưu này, yêu cầu yếu tố ảnh hưởng đạt 100% mong muốn, mục tiêu mật độ tế bào mục tiêu chung đạt 100% Desirability mong muốn A:Nhiet B:pH C:Thoi gian Mat te bao Combined 0.000 0.250 0.500 0.750 1.000 Hình 7-PL Mức độ đáp ứng mong đợi Kết tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng Nitrobacter vulgaris HD5: Bảng 7-PL Ma trận thí nghiệm kết STT Nhiệt độ (oC) pH Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ tế bào (lg CFU/ml) 33.00 27.00 30.00 33.00 33.00 30.00 8.00 8.00 8.00 9.00 7.00 8.00 120.00 72.00 96.00 96.00 96.00 96.00 8.50 7.25 8.50 7.50 7.76 8.55 - 148 - 10 11 12 13 14 15 16 17 27.00 30.00 30.00 30.00 30.00 30.00 33.00 30.00 27.00 30.00 27.00 7.00 7.00 8.00 8.00 8.00 9.00 8.00 7.00 9.00 9.00 8.00 7.3 7.0 8.4 8.56 8.6 8.1 7.3 8.4 7.84 7.5 8.17 96.00 72.00 96.00 96.00 96.00 120.00 72.00 120.00 96.00 72.00 120.00 Bảng 8-PL Phân tích phương sai Anova mô hình Thông số Phương sai Chuẩn F Giá trị p (khả > F) 0.54 0.031 0.029 2.12 0.16 0.02 0.16 0.79 1.0 0.34 0.0037 109.54 6.3 5.8 427.66 32.25 3.95 32.25 159.48 202.52 68.21 0.62 < 0.0001 0.0404 0.0468 < 0.0001 0.0008 0.0872 0.0008 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 0.637 Mô hình A-Nhiệt độ B-pH C-Thời gian AB AC BC A2 B2 C2 Không tương thích Phương trình hồi quy: Y (mật độ tế bào) = +8.52 +0.063 +0.060 +0.52 -0.20 +0.070 -0.20 -0.43 -0.49 -0.28 *A *B *C *A*B *A*C *B*C * A2 * B2 * C2 - 149 - Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 8.6 Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 8.6 7 9 M a t d o te b a o Actual Factor C: Thoi gian = 96.00 8.5 M a t d o te b a o X1 = A: Nhiet X2 = C: Thoi gian X1 = A: Nhiet X2 = B: pH Actual Factor B: pH = 8.00 7.5 9.00 33.00 7.5 120.00 32.00 8.50 32.00 104.00 30.00 C: Thoi gian 7.00 27.00 (a) Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Design points above predicted value Design points below predicted value 8.6 30.00 88.00 A: Nhiet 28.00 31.00 96.00 29.00 7.50 B: pH 33.00 112.00 31.00 8.00 29.00 80.00 Perturbation C 8.5 8.5 M a t d o te b a o M a t d o te b a o (b) Actual Factors A: Nhiet = 30.00 B: pH = 8.00 C: Thoi gian = 96.00 X1 = B: pH X2 = C: Thoi gian A: Nhiet 28.00 72.00 27.00 Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Mat te bao Actual Factor A: Nhiet = 30.00 8.5 7.5 6.5 B A A B C 7.5 120.00 9.00 112.00 8.50 104.00 96.00 8.00 88.00 C: Thoi gian 7.50 80.00 6.5 B: pH -1.000 72.00 7.00 -0.500 0.000 0.500 1.000 (d) Deviation from Reference Point (Coded Units) (c) Hình 8-PL Ảnh hưởng yếu tố đến mật độ tế bào chủng N vulgaris HD5 Kết tối ưu hóa phần mềm Design Expert Version 8.0.6.1 sau: - Nhiệt độ: 30,04oC - pH = 7,78 - Thời gian nuôi cấy: 104,89 - Mật độ tế bào đạt: 4,5x108 CFU/ml (lg CFU/ml = 8,65) - 150 - Với phương án tối ưu này, yêu cầu yếu tố ảnh hưởng đạt 100% mong muốn, mụcDesirability tiêu mật độ tế bào mục tiêu chung đạt 100% mong muốn A:Nhiet B:pH C:Thoi gian Mat te bao Combined 0.000 0.250 0.500 0.750 Hình 9-PL Mức độ đáp ứng mong đợi PHỤ LỤC Một số hình ảnh nghiên cứu - 151 - 1.000 B subtilis B licheniformis Hình 10-PL Ảnh chụp kết TEST kit sinh hóa API 50CHB Hình 11-PL Ảnh chụp bể sinh học tích hợp chức - 152 - ... chế phẩm vi sinh vật xử lý nước thải sinh hoạt đô thị - Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nước thải sinh hoạt đô thị Đối tượng phạm vi nghiên cứu: - Nước thải số sông nội thành Hà. .. ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO THỊ HỒNG VÂN NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT BẢN ĐỊA NHẰM XỬ LÝ NƢỚC THẢI SINH HOẠT ĐÔ THỊ HÀ NỘI Chuyên ngành Mã số : Công nghệ sinh học thực phẩm. .. trường nước thải - Định tên vi sinh vật phương pháp truyền thống sinh học phân tử - Nghiên cứu điều kiện lên men thu sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý nước thải sinh