TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH- KTNN ====== TRẦN THỊ KIM THOA NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƢỚC VO GẠO ĐỊNH HƢỚNG SỬ DỤNG QUA DA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý ngƣời động vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS LÊ NGỌC HOÀN HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn trân thành sâu sắc tới thầy: TS Lê Ngọc Hoàn, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, bảo nhƣ giúp đỡ suốt thời gian làm khóa luận vừa qua Tôi xin trân thành cảm ơn tập thể thầy, cô giáo Trung tâm Hỗ trợ NCKH & CGCN Bộ môn Sinh lý ngƣời động vật chị học viên cao học cho nhiều lời khuyên tạo điều kiện thuận lợi cho trình làm thực nghiệm môn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới toàn thầy, cô giáo cán nhân viên Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2- ngƣời dạy bảo giúp đỡ suốt năm học Cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, ngƣời thân, bạn bè, ngƣời bên tôi, chia sẻ, động viên, giúp đỡ lúc gặp nhiều khó khăn Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2016 SINH VIÊN Trần Thị Kim Thoa LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu, kết khóa luận trung thực, không trùng lặp với công trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2016 SINH VIÊN Trần Thị Kim Thoa DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Từ viết tắt A xylinum Acetobacter xylinum BC Bacterial cellulose BH Berberine hydrochloride C E coli h Nồng độ Escherichia coli Giờ HIV Virus suy giảm miễn dịch ngƣời PC Plant cellulose OD Optical Density Et al An other MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu cellulose vi khuẩn (Bacterial celluose-BC) 1.1.1 Vi khuẩn sản sinh BC 1.1.2 Đặc điểmvà ứng dụng BC 1.1.2.1 Đặc điểm cấu trúc BC 1.1.2.2 Tính chất độc đáo BC 1.1.2.3 Ứng dụng BC 1.2 Tình hình nghiên cứu hƣớng nghiên cứu nƣớc 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2.Tình hình nghiên cứu nƣớc 10 1.3 Giới thiệu thuốc Berberin 10 1.3.1 Cấu trúc 10 1.3.2 Nguồn gốc 11 1.3.3 Tính chất 11 1.3.4 Tác dụng dƣợc lý 12 1.4 Tình hình nghiên cứu thuốc Berberin nƣớc 13 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 13 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Giống vi khuẩn 15 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 15 2.1.3.Thiết bị dụng cụ 15 2.1.4 Môi trƣờng tạo màng BC 15 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phƣơngpháp lên men thu màng BC từ môi trƣờng nƣớc vo gạo 17 2.2.2 Phƣơng pháp xử lý màng BC trƣớc hấp thụ thuốc 18 2.2.3 Phƣơng pháp xác định đƣờng chuẩn 20 2.2.4 Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ qua màng BC 21 2.2.5 Phƣơng pháp pha môi trƣờng đệm PBS ( Phosphate buffered saline)PBS 1X 22 2.2.6 Phƣơngpháp xác định lƣợng thuốc giải phóng thông qua hệ thống vận tải đƣợc thiết kế 23 2.2.7 Phƣơng pháp phân tích dƣợc động học giải phóng BH 23 2.2.8 Phƣơng pháp xử lý thống kê 24 2.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Thu màng BC 25 3.1.1 Màng BC thu đƣợc nuôi cấy môi trƣờng nƣớc vo gạo 25 3.1.2 Màng BC thu đƣợc sau nuôi cấy 26 3.1.3 Màng BC tinh chế 26 3.2 Màng BC hấp thụ thuốc BH 27 3.3 Xác định lƣợng thuốc BH giải phóng khỏi màng BC môi trƣờng pH= 7,4 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận 37 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Ứng dụng BC Bảng 2.1: Môi trƣờng tạo màng BC 17 Bảng 2.2: Nồng độBH giá trị OD345nm (n=3) 20 Bảng 2.3: Môi trƣờng đệm PBS 22 Bảng 3.1: Giá trị trung bình OD dung dịch BH 5% ngâm màng BC (n=3) 29 Bảng 3.2: Lƣợng thuốc hấp thụ BH qua màng BC (n=3) 29 Bảng 3.3: Giá trị OD345nm trung bình BH giải phóng từ màng BC qua thời điểm khác (n=3) 31 Bảng 3.4 : Tỉ lệ BH đƣợc giải phóng qua màng BC khoảng thời gian khác (n=3) 33 Bảng 3.5:Hệ số tƣơng quan (R), số tốc độ giải phóng (k) giá trị mũ số giải phóng (n) từ môi trƣờng pH= 7,4 độ dày màng khác (n=3) 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1: công thức cấu tạo BH 11 Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo màng BC thô 18 Sơ đồ 2.2: Quy trìnhthu màng BC tinh chế 19 Hình 3.1: Màng BC nuôi cấy môi trƣờng nƣớc vo gạo 25 Hình 3.2: Màng BC thô 26 Hình 3.3: Màng BC sau tinh chế 27 Hình 3.4: Màng BC hấp thụ dung dịch thuốc BH 5% 28 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Berberine hydrochloride (BH) alkaloid thực vật tiếng với lịch sử lâu đời, đƣợc sử dụng cảViệt Nam Trung Quốc y học cổ truyền Nó đƣợc sử dụng để điều trị tiêu chảy kháng khuẩn nó, chống tăng tính chất chống tiết Gần đây, nghiên cứu chứng minh BH có tính chất dƣợc lý khác bao gồm chống ung thƣ, chống HIV, chống bệnh tiểu đƣờng, đau mắt hột, giải lo âu thuốc giảm đau, nấm da, trị bỏng, … Tuy nhiên, BH có sinh khả dụng thấp, cản trở ứng dụng điều trị thời gian dài Khả hòa tan nƣớc BH nhƣợc điểm hạn chế phát triển ứng dụng BH nhƣ công thức dƣợc phẩm Mặt khác, BH có tác dụng phụ tiềm liên kết với bắp tiêm tĩnh mạch, nhƣ sốc phản vệ phát ban thuốc Do đó, cần thiết để thiết kế loại màng vận chuyển phân phối giúp thuốc giải phóng cách từ từ, tăng khả dụng sinh học truyền thuốc tốt tăng khả điều trị bệnh BH Việc đƣa thuốc vào thể qua da đƣờng phổ biến truyền thống để phân phối thuốc So đƣờng uống hệ thống truyền thuốc qua đƣờng da có nhiều lợi nhƣ an toàn, đơn giản, giúp cho đối tƣợng không uống đƣợc thuốc điều trị liều lƣợng, hạn chế đƣợc số tác dụng phụ thuốc, …và tăng hiệu truyền thuốc Trong tự nhiên có số vi khuẩn có khả sinh màng BC Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trƣờng chứa glucose, glycerol số nguồn cacbon hữu khác chúng có khả hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học khiết đƣợc gọi màng sinh học BC [11] BC sản phẩm loài vi khuẩn, đặc biệt chủng Acetobacter xylinum BC có cấu trúc đặc tính giống với PC- cellulose thực vật (gồm phân tử glucose liên kết với liên kết β- 1,4 glucorit), cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật chỗ: không chứa hợp chất cao phân tử nhƣ ligin, hemicellulose, peptin sáp nến chúng có số tính chất hóa lý đặc biệt nhƣ: Độ bền học, khả thấm hút nƣớc cao, đƣờng kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả phục hồi độ ẩm ban đầu [4], Nhờ đặc tính độc đáo nên màng BC đƣợccoi nguồn polymer mới, giải pháp đƣờng tìm nguồn nguyên liệu Nó thu hút đƣợc ý nhiều nhà khoa học từ nửa sau kỉ XIX đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhƣ:Thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, đáng ý kiểm soát hệ thống vận chuyển thuốc BC đƣợc sử dụng nhƣ vài hệ thống để phân phối thuốc Amin et al [18] báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng bọc cho paracetamol cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết cho thấy màng BC giúp cho thuốc đƣợc giải phóng cách kéo dài làm tăng hiệu sử dụng thuốc Hay Almeida, IF., et al [16] sử dụng màng BC nhƣ hệ thống phân phối thuốc Gần hơn, Huang et al [21] nghiên cứu việc sử dụng màng BC cho việc kiểm soát in vitro Berberine Ngoài ra, màng BC đƣợc dùng làm chất màng đặc biệt cho sợi pin tế bào lƣợng (Brown,1989), làm sợi truyền quang, môi trƣờng chất sinh học sử dụng để cố định protein hay cho sắc kí Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng BC đƣợc sử dụng làm mặt nạ dƣỡng da Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng màng BC đƣợc quan tâm đạt đƣợc thành tựu định Trƣờng Đại học Y dƣợc TP Hồ Chí Minh nghiên cứu sử dụng màng BC có tẩm dầu mù u làm màng trị Hình 3.3: Màng BC sau tinh chế Nhận xét: Màng BC sau tinh chế có màu trắng trong, không tạp chất, hàm lƣợng nƣớc giảm xuống Sau đó, màng BC tinh chế đƣợc ép loại nƣớc để tiến hành hấp thụ giải phóng thuốc 3.2 Màng BC hấp thụ thuốc BH Màng BC sau tinh chế đƣợc đem sấy 120 20 phút để loại bỏ nƣớc tiến hành thí nghiệm hấp thụ thuốc đƣợc thể hình 3.4 [21] 27 Hình 3.4: Màng BC hấp thụ dung dịch thuốc BH 5% Sau đó, cho bình (hình 3.4) vào máy rung siêu âm tiến hành lấy mẫu 0,5h; 1h 2h Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại khả biến (máy UV-Vis) để đo lƣợng thuốc BH hấp thụ vào màng thời điểm 0,5h; 1h 2h Sau đo ta tính đƣợc giá trị OD trung bình dung dịch BH 5% Kết đƣợc thể bảng 3.1 28 Bảng 3.1: Giá trị trung bình OD dung dịch BH 5% ngâm màng BC (n=3) Độ dày màng (cm) 0,3 0,5 Thời gian hấp thụ (h) Giá trị OD345nm 2,378 ± 0,003 1,5 2,284 ± 0,004 2,284 ± 0,004 2,338 ± 0,003 1,5 2,245 ± 0,004 2,245 ± 0,004 Nhận xét: Qua bảng 3.1 ta nhận thấy: Khi màng BC hấp thụ thuốc, giá trị OD (Y) trung bình thuốc BH màng BC có độ dày 0,3 cm 0,5 cm có giá trị OD tăng dần sau không không đổi màng Có thể sau khoảng thời gian 1h; 1,5h; 2h lƣợng thuốc BH hấp thụ vào màng BC tăng dần đạt cực đại 2h Sau xác định đƣợc giá trị OD345nm lớn 2h, tính đƣợc lƣợng thuốc BH hấp thụ nhờ phƣơng trình đƣờng chuẩn (1) phần trăm tốc độ hấp thụ thuốc BH qua màng BC Kết đƣợc thể bảng 3.2 Bảng 3.2: Lượng thuốc hấp thụ BH qua màng BC (n=3) Độ dày Thời gian màng hấp thụ cực (cm) đại (giờ) 0,3 Khối lƣợng thuốc đƣợc Thể tích hấp thụ (mg) 0,7988 ± 0,003 29 Cƣờng độ EE màng hấp thụ màng (%) (cm3) (mg/cm3) 8,427 0,0948 ± 15,976 ± 0,0004 0,0007 0,5 0,8727 ± 0,004 14,045 0,0621 ± 17,454 ± 0,0003 0,0008 Nhận xét: Từ bảng 3.2, ta thấy cƣờng độ hấp thụ thuốc BH qua màng BC có độ dày 0,3 cm cao so với cƣờng độ hấp thụ thuốc BH qua màng BC có độ dày 0,5 cm Nhƣ vậy, màng BC mỏng cƣờng độ hấp thụ lớn Xử lý thống kê việc kiểm định giả thuyết t- Test: Two Sample Assuming Unequal Variancess, kết khác biệt khả hấp thụ khoảng thời gian khác (1,5h 2h) với màng 0,3 cm, P = 0,00048 (T